We investigated the role of muscarinic receptor subtypes at the rostral ventrolateral medulla (RVLM), the medullary origin of sympathetic neurogenic vasomotor tone, in mevinphos (Mev) intoxication. Adult Sprague-Dawley rats anesthetized by pentobarbital (45 mg/kg) and maintained by propofol (30 mg/kg/h) were used. Co-microinjection bilaterally of Mev (10 nmol) and artificial cerebrospinal fluid (aCSF) into the RVLM resulted in an increase (Phase I) followed by a decrease (Phase II) in the power density of the vasomotor components of systemic arterial pressure spectrum, our experimental index for sympathetic vasomotor tone. These changes in sympathetic vasomotor outflow in both phases of Mev intoxication were significantly and dose-dependently reduced on co-microinjection of Mev and the M2 subtype of muscarinic receptor (M2R) antagonist methoctramine (0.5 or 1 nmol) or M4R antagonist tropicamide (0.5 or 1 nmol). On the other hand, the M1R antagonist pirenzepine (0.5 or 1 nmol) or M3R antagonist 4-DAMP (0.5 or 1 nmol) was ineffective. Western blot analysis further revealed that the increase in NOS I protein levels at the RVLM during Phase I Mev intoxication or the augmented level of NOS II during both phases were significantly blunted on co-microinjection bilaterally of Mev and methoctramine (1 nmol) or tropicamide (1 nmol) into the RVLM. Pirenzepine (1 nmol) or 4-DMAP (1 nmol) was again ineffective. We conclude that both M2R and M4R subtypes in the RVLM may be involved in Mev intoxication. Whereas the prevalence of NOS I over NOS II at the RVLM during Phase I results in sympathoexcitation, sympathoinhibition induced by NO from NOS II in the RVLM is primarily involved in Phase II Mev intoxication.

The locus coeruleus (LC) is a putative site of action for angiotensin II in the brain. Immunocytochemical studies have identified angiotensin II-like immunoreactive material in nerve terminals innervating the LC, and the LC contains one of the highest densities of angiotensin II receptor binding sites in the rat brain. Recent studies using selective neurotoxins suggest that the binding sites for angiotensin II in the LC are present on noradrenergic perikarya. Angiotensin II receptors are now known to exist as two subtypes that are distinguishable both pharmacologically and biochemically. Radioligand binding studies using agonists and antagonists selective for these angiotensin II receptor subtypes indicate that the rat LC contains a mixture of the two known angiotensin II receptor subtypes, but that the PD123177-sensitive AIIβ receptor subtype is predominant. Comparisons of spontaneously hypertensive rats with normotensive rats indicates that angiotensin II and its receptors in the LC are elevated in the hypertensive rat strain. Studies of the biochemical and physiological actions of angiotensin II in the LC have not yet established an agreed-upon function for angiotensin II in this nucleus.

The non-peptide angiotensin II (AII) receptor subtype selective antagonist, DuP 753, was used to characterize AII receptor binding sites in the rat brain. DuP 753 competed for specific 125I-[Sar1, Ile8]AII (125I-SIAII) binding in many brain nuclei (IC50 = 20-30 nM), but was a weak competitor at remaining sites (IC50 > 10-4 M). DuP 753 sensitive binding sites (designated AIIα subtype) correspond with areas where binding is inhibited by sulfhydryl reducing agents, whereas DuP 753 insensitive sites (AIIβ) correspond with areas where binding is not inhibited by sulfhydryl reducing agents.

Previous studies have used new angiotensin II (AII) receptor subtype selective compounds to localize AII receptor subtypes within discrete rat brain nuclei. The purpose of this autoradiographic study was to extend these preliminary findings and provide a comprehensive analysis of AII binding sites in 22 rat brain nuclei and the anterior pituitary, to include estimates of the binding affinity for 125I sar1 ile8 AII (125I SIAII) at each nucleus, and determine the fractional distribution of each subtype at each nucleus. Estimates of K(D), in separate experiments revealed that AT1 nuclei had a consistently higher affinity for 125I SIAII than AT2 nuclei (0.66 vs. 2.55 nM). Displacement of subsaturating concentrations of 125I SIAII by 10-8-10-4 M DuP753 (selective for the AT1 subtype) or PD123177 (selective for the AT2 subtype) indicated that approximately half of the brain regions surveyed contained predominantly AT1 sites and half contained predominantly AT2 sites. Binding was partially displaced by both compounds in several regions and two site analyses were performed to estimate the distribution of subtypes within each nucleus. The data were then corrected for differential occupancy by 125I SIAII. Brain nuclei associated with cardiovascular or dipsogenic actions of AII, e.g., subfornical organ, organum vasculosum of the lamina terminalis, median preoptic nucleus, nucleus of the solitary tract and area postrema, contained pure, or almost pure, populations of AT1 receptors. The functions of AII in brain regions containing predominantly AT2 binding sites, e.g., thalamus, colliculi, inferior olive and locus ceruleus, remain undefined. Thus, AII binding sites in the rat brain have been differentiated into two subtypes with similar characteristics to those reported in peripheral tissues. However, the unexpected finding that they can be differentiated on the basis of their affinity for 125I SIAII raises questions concerning their coidentity with peripheral receptor subtypes.

Die Behandlung menopausaler und postmenopausaler Beschwerden ist mit einem erhöhten Risiko verbunden, an Mamma- und Endometriumskarzinomen zu erkranken. Darüber hinaus zeigen epidemiologische Studien, dass in ostasiatischen Ländern postmenopausale Beschwerden, osteoporotische Frakturen und Herz-Kreislauferkrankungen seltener auftreten als in westlichen Ländern. Vor diesem Hintergrund war es Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit, in dem Tiermodell der ovarektomierten Ratte die mögliche Bedeutung von estrogenrezeptorsubtypspezifischen Einflüssen für hormonell bedingte Erkrankungen und Beschwerden zu untersuchen. Hierbei sollten gewebespezifische Wirkungen estrogenrezeptorsubtypspezifischer Liganden untersucht und explizit die Bedeutung der Estrogenrezeptorsubtypen ERα und ERβ bei der Gewebehomöostase in Knochen und Darm analysiert werden. Darüber hinaus sollten vor dem Hintergrund estrogenrezeptorsubtypspezifischer Wirkungsweisen gewebespezifische Einflüsse des Phytoestrogens Genistein (Gen) näher charakterisiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass nach einer subkutanen Applikation der knochenprotektive Einfluss von Gen mit dem von Estradiol (E2) vergleichbar ist, durch die Kombination mit Bewegung verstärkt wird und über den ERα vermittelt zu sein scheint. Es zeigte sich außerdem, dass der stimulierende Einfluss von E2 auf den motorischen Antrieb ERα-vermittelt ist und ERβ-spezifische Liganden ebenso wie Gen diesen Effekt antagonisieren. Des Weiteren wurde deutlich, dass E2, nicht aber Gen über den ERα Einfluss auf die Körperfettverteilung nimmt. Mit einer phytoestrogenreichen Diät konnten in adulten Ratten physiologisch relevante Gen/Dai-Plasmaspiegel erreicht werden, allerdings blieben hierbei die nach einer subkutanen Applikation beobachteten knochenprotektiven Effekte dieser Phytoestrogene aus. Bei der näheren Betrachtung der Gewebehomöostase im Dünndarm zeigte sich, dass über den im Darm verstärkt exprimierten ERβ antiproliferative und proapoptotische Effekte vermittelt werden und Gen in diesem Gewebe wie ein ERβ-spezifischer Agonist wirkt. Bezogen auf eine hormonell bedingte Osteoporose, wie sie bei einem Großteil postmenopausaler Frauen auftritt, scheint das Phytoestrogen Genistein eine mögliche Alternative zur Hormonersatztherapie darzustellen. Außerdem zeigt sich, dass Genistein gewebe- und estrogenrezeptorsubtypspezifische antagonistische und agonistische Einflüsse hat und somit die Charakterisierung als „Phyto-SERMs“ (pflanzlicher selektiver Estrogenrezeptormodulator) zutreffend ist. Sollten sich in weiterführenden Studien die beobachteten Effekte im Dünndarm auch für die Gewebehomöostase im Kolon beschreiben lassen, können vor diesem Hintergrund Genistein und ERβ-spezifische Liganden für die Darmkrebsprävention diskutiert werden…

Die Behandlung menopausaler und postmenopausaler Beschwerden ist mit einem erhöhten Risiko verbunden, an Mamma- und Endometriumskarzinomen zu erkranken. Darüber hinaus zeigen epidemiologische Studien, dass in ostasiatischen Ländern postmenopausale Beschwerden, osteoporotische Frakturen und Herz-Kreislauferkrankungen seltener auftreten als in westlichen Ländern. Vor diesem Hintergrund war es Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit, in dem Tiermodell der ovarektomierten Ratte die mögliche Bedeutung von estrogenrezeptorsubtypspezifischen Einflüssen für hormonell bedingte Erkrankungen und Beschwerden zu untersuchen. Hierbei sollten gewebespezifische Wirkungen estrogenrezeptorsubtypspezifischer Liganden untersucht und explizit die Bedeutung der Estrogenrezeptorsubtypen ERα und ERβ bei der Gewebehomöostase in Knochen und Darm analysiert werden. Darüber hinaus sollten vor dem Hintergrund estrogenrezeptorsubtypspezifischer Wirkungsweisen gewebespezifische Einflüsse des Phytoestrogens Genistein (Gen) näher charakterisiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass nach einer subkutanen Applikation der knochenprotektive Einfluss von Gen mit dem von Estradiol (E2) vergleichbar ist, durch die Kombination mit Bewegung verstärkt wird und über den ERα vermittelt zu sein scheint. Es zeigte sich außerdem, dass der stimulierende Einfluss von E2 auf den motorischen Antrieb ERα-vermittelt ist und ERβ-spezifische Liganden ebenso wie Gen diesen Effekt antagonisieren. Des Weiteren wurde deutlich, dass E2, nicht aber Gen über den ERα Einfluss auf die Körperfettverteilung nimmt. Mit einer phytoestrogenreichen Diät konnten in adulten Ratten physiologisch relevante Gen/Dai-Plasmaspiegel erreicht werden, allerdings blieben hierbei die nach einer subkutanen Applikation beobachteten knochenprotektiven Effekte dieser Phytoestrogene aus. Bei der näheren Betrachtung der Gewebehomöostase im Dünndarm zeigte sich, dass über den im Darm verstärkt exprimierten ERβ antiproliferative und proapoptotische Effekte vermittelt werden und Gen in diesem Gewebe wie ein ERβ-spezifischer Agonist wirkt. Bezogen auf eine hormonell bedingte Osteoporose, wie sie bei einem Großteil postmenopausaler Frauen auftritt, scheint das Phytoestrogen Genistein eine mögliche Alternative zur Hormonersatztherapie darzustellen. Außerdem zeigt sich, dass Genistein gewebe- und estrogenrezeptorsubtypspezifische antagonistische und agonistische Einflüsse hat und somit die Charakterisierung als „Phyto-SERMs“ (pflanzlicher selektiver Estrogenrezeptormodulator) zutreffend ist. Sollten sich in weiterführenden Studien die beobachteten Effekte im Dünndarm auch für die Gewebehomöostase im Kolon beschreiben lassen, können vor diesem Hintergrund Genistein und ERβ-spezifische Liganden für die Darmkrebsprävention diskutiert werden…

L'angiotensine-II (Ang-II), synthétisée à partir de sources extracardiaques et intracardiaques, régule l'homéostasie cardiaque en favorisant des effets mitogéniques et en promouvant la croissance cellulaire résultant d’une altération de l'expression génique. Dans cette étude, nous avons évalué la possibilité que les récepteurs de l'angiotensine-1 (AT1) ou les récepteurs de l'angiotensine-2 (AT2) situés sur l'enveloppe nucléaire régulent l’expression génique des cardiomyocytes. En analysant les noyaux cellulaires retenus des fractions de cœur de rat par immunobuvardage Western, nous avons détecté une co-purification préférentielle des protéines AT1 et AT2 avec un marqueur de la membrane nucléaire (Nup 62), par rapport aux marqueurs de la membrane plasmique (Calpactin I), de l’appareil de Golgi (GRP 78) ou du réticulum endoplasmique (GM130). La microscopie confocale a permis de démontrer la présence des AT1 et AT2 dans les membranes nucléaires. La microinjection de l’Ang-II-FITC sur des cardiomyocytes a provoqué une liaison de préférence aux sites nucléaires. Les enregistrements de transients calciques ont illustré que les AT1 nucléaires régulent le relâchement du Ca2+. L’incubation des ligands spécifiques d’AT1 et d’AT2 avec l’UTP [α32P] a résulté en une synthèse de novo d’ARN (par exemple, 16,9 ± 0,5 cpm/ng ADN contrôle vs 162,4 ± 29,7 cpm/ng ADN-Ang II, 219,4 ± 8,2 cpm/ng ADN L -162313 (AT1) et 126,5 ± 8,7 cpm/ng ADN CGP42112A (AT2), P <0,001). L’incubation des noyaux avec Ang-II augmente de façon significative l’expression de NFκB, une réponse qui est réprimée partiellement par la co-administration de valsartan ou de PD123177. Les expériences dose-réponse avec Ang-II administrée à l'ensemble des noyaux purifiés vs. aux cardiomyocytes seuls a montré une augmentation plus importante dans les niveaux d'ARNm de NFκB avec une affinité de ~ 3 fois plus grande (valeurs d’EC50 = 9 contre 28 pmol/L, respectivement), suggérant un rôle préférentiel nucléaire dans la signalisation. Par conséquent, nous avons conclu que les membranes cardiaques nucléaires possèdent des récepteurs d’Ang-II couplés à des voies de signalisation et à la transcription génique. La signalisation nucléaire pourrait jouer un rôle clé dans les changements de l'expression de gènes cardiaques, entraînant ainsi des implications mécanistiques et thérapeutiques diverses. / Angiotensin-II (Ang-II) from extracardiac sources and intracardiac synthesis regulates cardiac homeostasis, with mitogenic and growth-promoting effects largely due to altered gene-expression. In this study, the possibility that angiotensin-1 (AT1R) or angiotensin-2 (AT2R) receptors are located on the nuclear envelope and mediate effects on cardiomyocyte gene expression was assessed. Western blot tests of nucleus-enriched rat heart fractions indicated the presence of AT1R and AT2R proteins that preferentially copurified with a nuclear membrane marker (Nup 62) but not markers of plasma (Calpactin I), Golgi apparatus (GRP 78) or endoplasmic reticulum (GM130) membranes. Confocal microscopy revealed the existence of AT1R and AT2R proteins on nuclear membranes. Microinjected Ang-II preferentially bound to nuclear sites of isolated cardiomyocytes. Ca2+i-recordings on nuclear preparations demonstrated an AT1R-mediated Ca2+ release. AT1R and AT2R ligands enhanced de novo RNA synthesis in isolated cardiomyocyte nuclei incubated with [α32P]UTP (e.g. 16.9 ± 0.5 cpm/ng for DNA control vs. 162.4 ± 29.7 cpm/ng for DNA Ang-II, 219.4 ± 8.2 cpm/ng for DNA L-162313 (AT1) and 126.5 ± 8.7 cpm/ng for DNA CGP42112A (AT2), P<0.001). Ang-II application to isolated cardiomyocyte nuclei enhanced NFκB mRNA-expression, a response that was suppressed by co-administration of valsartan or PD123177. Dose-response experiments with Ang-II applied to purified nuclei vs. to whole cardiomyocytes showed a greater increase in NFκB mRNA levels at saturating concentrations with ~3 fold greater affinity (EC50 values 9 vs. 28 pmol/L, respectively), suggesting preferential nuclear signaling. These results lead us to conclude that cardiac nuclear membranes possess angiotensin receptors that couple to nuclear signaling pathways and regulate transcription. Signaling within the nuclear envelope (e.g. from intracellularly synthesized Ang-II) may play a role in Ang-II-mediated changes in cardiac gene-expression, with potentially important mechanistic and therapeutic implications.

L'angiotensine-II (Ang-II), synthétisée à partir de sources extracardiaques et intracardiaques, régule l'homéostasie cardiaque en favorisant des effets mitogéniques et en promouvant la croissance cellulaire résultant d’une altération de l'expression génique. Dans cette étude, nous avons évalué la possibilité que les récepteurs de l'angiotensine-1 (AT1) ou les récepteurs de l'angiotensine-2 (AT2) situés sur l'enveloppe nucléaire régulent l’expression génique des cardiomyocytes. En analysant les noyaux cellulaires retenus des fractions de cœur de rat par immunobuvardage Western, nous avons détecté une co-purification préférentielle des protéines AT1 et AT2 avec un marqueur de la membrane nucléaire (Nup 62), par rapport aux marqueurs de la membrane plasmique (Calpactin I), de l’appareil de Golgi (GRP 78) ou du réticulum endoplasmique (GM130). La microscopie confocale a permis de démontrer la présence des AT1 et AT2 dans les membranes nucléaires. La microinjection de l’Ang-II-FITC sur des cardiomyocytes a provoqué une liaison de préférence aux sites nucléaires. Les enregistrements de transients calciques ont illustré que les AT1 nucléaires régulent le relâchement du Ca2+. L’incubation des ligands spécifiques d’AT1 et d’AT2 avec l’UTP [α32P] a résulté en une synthèse de novo d’ARN (par exemple, 16,9 ± 0,5 cpm/ng ADN contrôle vs 162,4 ± 29,7 cpm/ng ADN-Ang II, 219,4 ± 8,2 cpm/ng ADN L -162313 (AT1) et 126,5 ± 8,7 cpm/ng ADN CGP42112A (AT2), P <0,001). L’incubation des noyaux avec Ang-II augmente de façon significative l’expression de NFκB, une réponse qui est réprimée partiellement par la co-administration de valsartan ou de PD123177. Les expériences dose-réponse avec Ang-II administrée à l'ensemble des noyaux purifiés vs. aux cardiomyocytes seuls a montré une augmentation plus importante dans les niveaux d'ARNm de NFκB avec une affinité de ~ 3 fois plus grande (valeurs d’EC50 = 9 contre 28 pmol/L, respectivement), suggérant un rôle préférentiel nucléaire dans la signalisation. Par conséquent, nous avons conclu que les membranes cardiaques nucléaires possèdent des récepteurs d’Ang-II couplés à des voies de signalisation et à la transcription génique. La signalisation nucléaire pourrait jouer un rôle clé dans les changements de l'expression de gènes cardiaques, entraînant ainsi des implications mécanistiques et thérapeutiques diverses. / Angiotensin-II (Ang-II) from extracardiac sources and intracardiac synthesis regulates cardiac homeostasis, with mitogenic and growth-promoting effects largely due to altered gene-expression. In this study, the possibility that angiotensin-1 (AT1R) or angiotensin-2 (AT2R) receptors are located on the nuclear envelope and mediate effects on cardiomyocyte gene expression was assessed. Western blot tests of nucleus-enriched rat heart fractions indicated the presence of AT1R and AT2R proteins that preferentially copurified with a nuclear membrane marker (Nup 62) but not markers of plasma (Calpactin I), Golgi apparatus (GRP 78) or endoplasmic reticulum (GM130) membranes. Confocal microscopy revealed the existence of AT1R and AT2R proteins on nuclear membranes. Microinjected Ang-II preferentially bound to nuclear sites of isolated cardiomyocytes. Ca2+i-recordings on nuclear preparations demonstrated an AT1R-mediated Ca2+ release. AT1R and AT2R ligands enhanced de novo RNA synthesis in isolated cardiomyocyte nuclei incubated with [α32P]UTP (e.g. 16.9 ± 0.5 cpm/ng for DNA control vs. 162.4 ± 29.7 cpm/ng for DNA Ang-II, 219.4 ± 8.2 cpm/ng for DNA L-162313 (AT1) and 126.5 ± 8.7 cpm/ng for DNA CGP42112A (AT2), P<0.001). Ang-II application to isolated cardiomyocyte nuclei enhanced NFκB mRNA-expression, a response that was suppressed by co-administration of valsartan or PD123177. Dose-response experiments with Ang-II applied to purified nuclei vs. to whole cardiomyocytes showed a greater increase in NFκB mRNA levels at saturating concentrations with ~3 fold greater affinity (EC50 values 9 vs. 28 pmol/L, respectively), suggesting preferential nuclear signaling. These results lead us to conclude that cardiac nuclear membranes possess angiotensin receptors that couple to nuclear signaling pathways and regulate transcription. Signaling within the nuclear envelope (e.g. from intracellularly synthesized Ang-II) may play a role in Ang-II-mediated changes in cardiac gene-expression, with potentially important mechanistic and therapeutic implications.