[pt] A descoberta da importância do óxido nítrico na fisiologia humana expandiu a investigação dos mecanismos de interação das espécies reativas derivadas de óxidos de nitrogênio com biomoléculas. S-nitrosotióis são uma fonte conveniente de óxido nítrico para utilização in vivo. Um dos métodos largamente utilizados para S-nitrosilação de compostos contendo o grupo -SH, incluindo proteínas contendo o aminoácido cisteína, é a reação com nitrito em meio ácido. Nesse trabalho investigaram-se as espécies derivadas da reação de albumina sérica, humana e bovina, e de insulina com nitrito, através de espectrofotometria de absorção e de fluorescência. Além da modificação dos resíduos de cisteína, demonstrou-se que resíduos do aminoácido triptofano também sofrem modificação, podendo participar dos processos in vivo. A partir da comparação entre os espectros de absorção dos cromóforos formados em albumina humana e bovina, bem como em insulina, demonstrou-se que a banda de absorção no ultravioleta, descrita na literatura como característica de S-nitrosilação de cisteína, é dominada pelos resíduos de triptofano N-nitrosados. Experimentos de fluorescência confirmaram a modificação dos resíduos de triptofano, já que os espectros apresentaram redução do rendimento quântico e também deslocamento do pico característico desses resíduos. Acompanhou-se a cinética de formação de novos cromóforos, comparando as albuminas nativas e bloqueadas no resíduo de cisteína. Investigou-se a cinética de modificação dos resíduos de triptofano em pH fisiológico através de fluorescência. / [en] The discovery of the importance of nitric oxide to the human physiology expanded the investigation of mechanisms involved in the interactions of nitrogen oxide reactive species with biomolecules. S-nitrosothiols are a convenient source of nitric oxide for in vivo applications. Acid treatment with nitrite of compounds containing the SH group, including proteins containing cysteine residues, is a widely used method to synthesize S-nitrosothiols. In this work, several species derived from the nitrite acid treatment of human and serum albumins as well as insulin were investigated using optical absorption and fluorescence. It was demonstrated that, besides cysteine, tryptophan residues are modified and can participate in processes in vivo. Comparing the absorption spectra from human and bovine serum albumin with that from insulin, it was demonstrated that the ultraviolet absorption band, described in the literature as coming from Snitrosylation, was mainly due to N-nitrosation of tryptophan residues. Fluorescence experiments confirmed the modification of tryptophan residues, since the characteristic fluorescence peak exhibited a reduction and a blue shift. The kinetics of the new chromophores was followed by comparison of native and cysteine-blocked albumins. The kinetics of tryptophan modifications was investigated at the physiological pH using fluorescence.

[pt] As doenças trasmitidas pelo sangue, assim como a necessidade de bancos de sangue para um pronto auxílio em casos de acidentes tem estimulado esforços para desenvolver substitutos do sangue. A albumina serica humana (HSA do ingles Human Serum Albumin) é a proteína mais abundante no plasma sanguíneo. A molécula heme é a transportadora de oxigênio no sangue. Portanto, um estudo detalhado da interação HSA/heme seria útil em pesquisas que visam tornar o complexo HSA-heme em um substituto do sangue. Nesta tese, foram usadas técnicas de dinâmica molecular e ferramentas estatísticas para estudar o sistema HSA-heme em solvente explícito. Tanto o ligante quanto a proteína foram também estudados separadamente em meio aquoso. Dentre outros resultados, nosso estudo revelou a organização da água circundante, os efeitos da ligação do heme na HSA, os mecanismos moleculares da ligação do heme, os movimentos coletivos da proteína livre e ligada, assim como também os aminoácidos que atuam como dobradiças moleculares na mudança conformacional que sofre a proteína ao ligar o heme. / [en] Diseases transmitted through the blood, as well as the need for blood banks to help in case of accidents, stimulated efforts to develop blood substitutes. The human serum albumin (HSA) is the most abundant protein in blood plasma. The heme molecule is the carrier of oxygen in the blood. Therefore, a detailed study of the interaction HSA/heme could give useful insights in the research aimed to convert the HSA-heme complex into a blood substitute. In this thesis, molecular dynamics techniques and statistical tools were applied to study the HSA-heme system in explicit solvent. Both ligand and protein were also studied separately in aqueous medium. Among other results, our study reveals the organization of the surrounding water, the effects of the heme upon its binding to HSA, the molecular mechanisms for heme binding, the collective motions of the protein with and without the heme, as well as the amino acids that act as molecular hinges in the conformational change between the free and bound forms of the protein.