[pt] O principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de métodosespectrofluorimétricos e de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa(RP-HPLC, reversed-phase liquid chromatography) para análise de óleosessenciais cítricos (OEC). Para este fim, microemulsões livres de surfactante(SFMEs, surfactante-free microemulsions) foram utilizadas como uma abordagempara o tratamento das amostras.Primeiramente, a região de formação das SFMEs foi avaliada para diferentesproporções água:OE (1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, m/m) na presença de propano-1-ol eoctan-1-ol (10:3 m/m). Titulações condutométricas indicaram agregados micelarescontendo OE (microemulsão do tipo óleo-em-água) para a proporção 4:1 (compartículas dispersas de raio hidrodinâmico de 95,7 ± 5,3 nm). Nessas condições, afluorescência aumentou, permitindo o uso da espectroscopia de fluorescência 3Dpara obtenção de padrões de impressão digital que foram utilizados para análisediscriminante de nove marcas brasileiras, juntamente com análise de componentes principais com desdobramento dos dados (UPCA, unfold principal components analysis). Uma variância cumulativa de 96,7 por cento foi obtida para os três primeiros componentes principais e os gráficos de pontuação mostraram uma localização distinta para cada grupo. Um estudo preliminar também mostrou a capacidade desses sistemas em avaliar condições de armazenamento e adulteração. O impacto das condições de armazenamento foi realizado ao longo de 21 dias expostos à luz, com resultados mostrando grandes diferenças espectrais em comparação com uma amostra armazenada em frasco âmbar a 22 graus C. A adulteração de OEs por fortificação com óleo de canola e óleo mineral foi detectada em diferentes níveis (1, 5, 10 e 20 por cento, m/m) e, além das diferenças espectrais, observou-se uma mudança na estabilidade da micro emulsão. Em uma segunda etapa do estudo, esses sistemas foram replicados para diferentes OEC, incluindo laranja doce e azeda, tangerina, limão e grape fruit. Estudos foram empregados para avaliar condições ótimas para a formação do sistema, visando abranger todos os OECs avaliados sem comprometer a reprodutibilidade da medição. A nova condição SFME adotada foi de 15 microL da fase oleosa contendo OE e octan-1-ol (1:2 v/v), 19 mL de água e propan-1-ol até o volume final de 25 mL. Além do baixo consumo de amostra, obteve-se um aumento significativo na fluorescência, apesar da menor proporção da fase oleosa. Os dados da matriz de excitação-emissão foram utilizados para análise de agrupamento. OUPCA foi aplicado com sucesso, com uma variância cumulativa de 99,5 por cento para os três primeiros componentes principais. A decomposição dos auto vetores revelou uma influência significativa dos comprimentos de onda de excitação/emissão de336/436 nm. Análises complementares por HPLC confirmaram a relação entre fluoróforos e a fração não volátil, característica dos OECs. A combinação de baixo consumo de amostra e alto teor de água torna a aplicação desses sistemas vantajosa para a diferenciação de OECs. A transparência e a baixa viscosidade também são consideradas aspectos positivos. Em uma terceira e última etapa, o efeito do meio de amostragem na análise de polimetoxiflavo nas (PMFs) no OE de laranja doce por RP-HPLC foi avaliado, utilizando o conhecimento adquirido nas etapas anteriores em relação à formação de sistemas SFMEs. Este estudo teve como foco a análise de PMFs presentes na fração não volátil do OE de laranja doce, que inclui tetra-O-metil-scutelareína, sinensetina, tangeretina, nobiletina e heptametoxiflavona. Dois métodos utilizando eluição isocrática com diferentes fases móveis, (A) água/metanol e (B)água/acetonitrila, foram empregados usando detecção absorciométrica e fluorimétrica. O meio de amostragem influenciou significativamente a eluição cromatográfica, afetando potencialmente a largura dos picos e o tempo de retenção, especialmente para tangeretina, onde um aumento de 300 e 103 por cento na intensidade de pico foi obtido para as fases móveis A e B, quando misturas com octan-1-ol foram utilizadas. Devido à coeluição entre nobiletina e tetra-O-metil scutelareína observada com a fase móvel A, o método foi validado utilizando a fase móvel B(acetonitrila/água, 50:50 por cento, v/v). A detecção de fluorescência forneceu valores delimites de detecção e quantificação mais baixos para sinensetina (1 e 3 microg mL-1) enobiletina (13 e 44 microg mL-1) do que os relatados na literatura. O método foi aplicado a amostras comerciais de OE de laranja doce, fornecendo resultados consistentes para todas as PMFs. / [en] The main goal of this work was the development of spectrofluorimetric and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) methods for citrus essential oils (CEO) analysis. For this purpose, surfactant-free microemulsions (SFMEs) were used as an approach for sample treatment. First, the SFME formation region was studied at different water:EO weight proportions (1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 w/w) in the presence of propan-1-ol and octan-1-ol (10:3 w/w). Conductometric titrations indicated micellar aggregates containing EO (oil-in-water microemulsion) for the 4:1 proportion (droplets of hydrodynamic radius of 95.7 ± 5.3 nm). In such conditions, fluorescence increased allowing the use of 3D fluorescence spectroscopy to obtain spectroscopic fingerprint pattern that was used aiming discriminant analysis, considering nine EO Brazilian brands, along with unfold principal component analysis(UPCA). A cumulative variance of 96.7 percent was obtained for the first three principal components and score plots showed distinct location for each group. Preliminary study showed the capability of these systems in evaluating storage conditions, and adulteration. The impact of storage conditions was made over 21 days exposed to light with results showing large spectral differences compared to a sample stored in amber flask at 22 degrees C. Adulteration of EOs by canola and mineral oil fortification was detected at different levels (1, 5, 10 and 20 percent, w/w) and, in addition to the spectral differences, a change in microemulsion stability was observed. In a second stage of the study, these systems were replicated for different CEOs, including sweet and sour orange, tangerine, lemon, and grapefruit. Studies were employed to assess optimal conditions for system formation, aiming to encompass all evaluated CEOs without compromising measurement reproducibility. The new SFME condition adopted was 15 microL of the oily phase containing EO and octan-1-ol (1:2 v/v), 19 mL of water, and propan-1-ol up to the 25 mL final volume. In addition to low sample consumption, a significant increase in fluorescence was achieved, despite the lower proportion of the oily phase. Excitation-emission matrix data were utilized for clustering analysis. UPCA was successfully applied, with cumulative variance of 99.5 percent for the first three principal components. Eigenvectors decomposition revealed a significant influence of the 336/436 nm excitation/emission wavelengths. Complementary analyses by HPLC confirm the relationship between fluorophores and the non-volatile fraction, characteristic of CEOs. The combination of low sample consumption and high-water content makes the application of these systems advantageous for CEO differentiation. Transparency and low viscosity are also considered positive aspects. In a third and final stage, the effect of the sampling medium on the analysis of polymethoxyflavones (PMFs) in sweet orange EO by RP-HPLC was evaluated, utilizing the knowledge acquired in previous stages regarding the formation of SFME systems. This study was focused on analyzing PMFs present in the non-volatile fraction of sweet orange EO, which includes tetra-O-methyl-scutellarein, sinensetin, tangeretin, nobiletin, and heptamethoxyflavone. Two methods utilizing isocratic elution with different mobile phases, (A) water/methanol and (B) water/acetonitrile, were employed using absorciometric and fluorimetric detection. The sampling medium significantly influenced chromatographic elution, potentially affecting peak width and retention time, especially for tangeretin, where a 300 percent and 103 percent increase in peak intensity was obtained for mobile phases A and B, respectively, when mixtures with octan-1-ol were used. Due to co-elution between nobiletin and tetra-O-methyl scutelarein observed with mobile phase A, the method was validated using mobile phase B (acetonitrile and water 50:50 percent, v/v). Fluorescence detection provided lower LOD and LOQ values for sinensetin (1 and 3 microg mL -1 ) and nobiletin (13 and 44 microg mL -1 ) than reported in the literature. The method was applied to commercial sweet orange EOs samples, yielding consistent results for all PMFs.

[pt] Métodos baseados na cromatografia líquida micelar (MLC) com detecção fluorimétrica foram desenvolvidos para dois estudos de caso. No primeiro deles, seis B-carbolinas (harmol, harmalol, harmane, norharmane, harmine e harmaline) foram plenamente separadas de modo a se aplicar o método para a determinação dos alcaloides em formulações de Passiflora incarnata L., extrato seco de Passiflora alata Dryander e em urina. A separação foi realizada em coluna cromatográfica C18, utilizando fase móvel tamponada (pH 8,0) contendo 220 mmol L-1 de dodecilsulfato de sódio (SDS)/acetonitrila (97/3 por cento v/v). A detecção fluorimétrica permitiu que se atingissem limites de detecção (LOD) abaixo de 3,6 ng g-1 com repetibilidade e precisão intermediária entre 0,1 e 5 por cento. As incertezas combinadas associadas à concentração das B-carbolinas ficaram entre 1 e 9 por cento. O método proposto foi comparado ao método baseado na cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) com detecção absorciométrica e os resultados com MLC se mostraram superiores do ponto de vista da capacidade de detecção (por serem os alcaloides naturalmente muito fluorescentes) e de recuperação. Para as amostras de fitoterápicos, o harmol foi quantificado tanto nas amostras de medicamento de Passiflora incarnata quanto em urina de voluntário após a administração de fitoterápico. O harmine foi detectado apenas na amostra de medicamento. Os alcaloides norharmane, harmine e harmaline foram identificados no chá misto de Maracujá, no qual continha em sua composição extrato seco de Passiflora alata Dryander. Na segunda abordagem, um método por MLC foi desenvolvido para a determinação de galantamina e de seus principais metabólitos (N-desmetil galantamina, O-desmetil galantamina, epigalantamina e N-óxido galantamina). A separação da galantamina e dos metabólitos foi feita utilizando coluna cromatográfica C18 com porosidade de 300 angstroms e fase móvel constituída de tampão (pH 5,0) contendo 25 mmol L-1 de SDS/acetonitrila (97/3 por cento v/v). A detecção fluorimétrica permitiu limites de detecção abaixo de 343 ng g-1, repetibilidade e precisão intermediária entre 2,2 e 4 por cento. As incertezas combinadas associadas à concentração de galantamina e dos metabólitos ficaram entre 0,3 e 11 por cento. Ensaios de recuperação foram realizados em amostra de urina fortificada com padrões da galantamina e metabólitos e os resultados obtidos ficaram entre de 91,4 e 114,8 por cento. A comparação entre o método por MLC e o método por cromatografia líquida de alta eficiência com fase reversa foram feitas com amostras de medicamento cujo princípio ativo era o hidrobrometo de galantamina. Os resultados dos teores de galantamina e as variâncias das medidas obtidas por ambos os métodos foram estatisticamente iguais. A sensibilidade da curva analítica obtida por MLC foi duas vezes maior do que a encontrada por cromatografia por fase reversa. Análises de urina de ratos coletadas após a administração do medicamento foram realizadas com o método proposto, sendo que a galantamina mais os metabólitos N-óxido galantamina e N-desmetil galantamina foram identificados nas amostras. Para melhor avaliar o efeito de amplificação de fluorescência da galantamina pelo ambiente organizado, experimentos foram feitos com a separação cromatográfica de fase reversa e com a adição de solução rica em micelas de SDS após a passagem do analito pela coluna cromatográfica. As condições de separação incluíram o uso de coluna cromatográfica C18, fase móvel constituída por tampão (pH 5,0) contendo 2 por cento de propano-2-ol (v/v)/ acetonitrila (80/20 por cento v/v). A solução micelar de SDS (100 mmol L-1), misturada à fase móvel após a coluna cromatográfica, foi preparada com a mesma composição da fase móvel. A sensibilidade da curva analítica de galantamina foi três vezes maior quando o meio micelar foi usado. O resultado prova que o ambiente micelar favorece a medição fluorimétrica de galantam / [en] Methods based on micellar liquid chromatography (MLC) with fluorimetric detection have been developed for two case studies. In the first, six B-carbolines (harmol, harmalol, harmane, norharmane, harmine and harmaline) were fully separated allowing the application of the method for the determination of these alkaloids in Passiflora incarnata L. formulations, in Passiflora alata Dryander dry extract and in urine. The chromatographic separation was performed on a C18 column using a buffered mobile phase consisting of disodium hydrogen phosphate (pH 8.0) containing 220 mmol L-1 of sodium dodecyl sulfate (SDS)/acetonitrile (97/3 percent v/v). The fluorimetric detection allowed limits of detection (LOD) below than 3.6 ng g-1 to be achieved with intermediary precision and repeatability between 0.1 and 5 percent. The calculated combined uncertainties of the concentration of B-carbolines were between 1 and 9 percent. The proposed method was compared with the method based on micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with absortionmetric detection. The MLC results were superior from the viewpoint of the detection power (since they are very fluorescent alkaloids) and also in terms of recovery. The harmol was quantified in Passiflora incarnata phitotherapic samples and in urine collected from a voluntary after of the administration of herbal medicine. The harmine was detected only in the phitotherapic sample. The norharmane, harmine and harmaline alkaloids were identified in Passion Fruit tea, which contained dry extract of Passiflora alata Dryander. In the second approach, a method for MLC was developed for the determination of galantamine and its main metabolites (N-demethyl galantamine, O-demethyl galantamine, epigalantamine and N-oxide galantamine). The separation was performed using a C18 chromatography column with porosity of 300 angstroms and with mobile phase consisting of buffer (pH 5.0) containing SDS (25 mmol L-1)/acetonitrile (97/3 percent v/v). The fluorimetric detection enabled LOD below 343 ng g-1 with intermediate precision and repeatability between 2.2 and 4 percent. Combined uncertainties for concentration of galantamine and metabolites were between 0.3 and 11 percent. Recovery experiments were performed on urine samples fortified with galantamine standards and metabolites with results between 91.4 and 114.8 percent. A comparison between the proposed MLC method and reverse phase high performance liquid chromatography was made using medicine samples containing galantamine hydrobromide as the active principle. Galantamine levels and variances achieved with these methods were statistically equal. The analytical curve sensitivity by MLC was two times higher than that found with reverse phase high performance liquid chromatography. Analysis of rat urine, collected after the administration of the medicine, were performed with the proposed method enabling the identification of galantamine, N-oxide galantamine and N-demethyl galantamine. To better evaluate the fluorescence amplification effect of galantamine in the organized environment, experiments were made with conventional chromatographic separation and post-column addition of the aqueous solution rich in micelles. The separation conditions included the use of C18 chromatographic column, mobile phase consisting of buffer (pH 5.0) containing 2 percent of propan-2-ol (v/v)/acetonitrile (80/20 percent v/v). The micellar solution of SDS (100 mmol L-1), added after the chromatographic column, was prepared with the same composition of the mobile phase. The column temperature was 25 degrees C and the sample volume was 20 uL. The sensitivity of the analytical curve of galantamine was three times higher when the micellar solution was mixed, proving that the organized environment favors the galantamine fluorescence even at flow regime. Recoveries with or without post-column mixing with the micelle rich solution were between 97.5 and 102.2 percent.