Orientador: Kleber Luiz de Araujo e Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:13:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roma_LeticiaPrates_D.pdf: 1071638 bytes, checksum: 52777a4c39261ec7137298200cb2b319 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo:Introdução/Objetivos. A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) faz parte de diversos processos fisiológicos. Nos últimos anos, o aumento de EROs têm sido associado ao desenvolvimento de diversas doenças, dentre elas o Diabetes Mellitus Tipo 2. As células beta pancreáticas são notadamente mais suscetíveis ao estresse oxidativo devido a sua baixa capacidade antioxidativa, resultado da menor expressão e atividade de enzimas antioxidantes como superóxido dismutase e peroxidases. A dexametasona, um glicocorticóide sintético, tem efeitos diabetogênicos e citotóxicos em células produtoras de insulina e ilhotas pancreáticas. Entretanto, os mecanismos pelos quais a dexametasona atua sobre as células-alvo não estão bem esclarecidos. Dessa forma, nosso objetivo foi analisar se a dexametasona induz estresse oxidativo em células produtoras de insulina RINm5F e ilhotas pancreáticas. Utilizamos três modelos: 1) células RINm5F controle, que são extremamente sensíveis ao estresse oxidativo; 2) células RINm5F superexpressando a enzima catalase (RINm5F.Cat), que são resistente ao estresse oxidativo e 3) ilhotas de ratos adultos cultivadas por 72 h com dexametasona (Dexa) e ilhotas tratadas concomitantemente com dexametasona e o antioxidante N-acetilcisteína (Dexa+NAC). Resultados: Aumento na produção de EROs foi observado em células RINm5F tratadas com dexametasona. O tratamento com dexametasona aumentou a atividade/clivagem da caspase-3 e apoptose em células RINm5F após 3 dias de cultura. Expressão protéica e atividade de Cu/ZnSOD estava aumentada após o tratamento com dexametasona, enquanto que a expressão/atividade de MnSOD não foi modulada pelo corticóide. A superexpressão da catalase em linhagens de célula beta previniu todos os efeitos citotóxicos da dexametasona, inclusive a morte celular. Elevados níveis de Cu/ZnSOD podem favorecer o aumento na geração de EROs e conseqüentemente, apoptose. Da mesma forma, ilhotas tratadas com dexametasona apresentaramaumento na produção de EROs, efeito que foi revertido quando as ilhotas foram tratadas concomitantemente com dexametasona e NAC. Redução na secreção de insulina estimulada por glicose foi observada em ilhotas cultivadas com dexametasona. O tratamento com dexametasona e NAC restaurou a secreção de insulina a níveis próximos aos controles. Uma menor produção deNAD(P)H no grupo Dexa foi observado, sendo que o grupo Dexa+NAC mostrou níveis semelhantes ao grupo controle. Não ocorreram diferenças nas concentrações intracelulares de cálcio estimulado por glicose em nenhum dos grupos. A dexametasona reduziu a expressão gênica da sinaptotagmina VII, enquanto no grupo Dexa+NAC houve um aumento da expressão desse gene em ilhotas pancreáticas. Interessantemente, o tratamento com NAC diminuiu a expressão gênica da Cu/ZnSOD. Conclusões: Nossos resultados indicam que as ações da dexametasona em células produtoras de insulina e ilhotas pancreáticas são mediadas através do aumento do estresse oxidativo, sendo a Cu/ZnSOD importante nesse processo. A superexpressão da catalase e o uso do antioxidante n-acetilcisteína previnem contra os efeitos citotóxicos do glicocorticóide. / Abstract: Introduction/Aims: Reactive oxygen species (ROS) play a dual role on living organisms, being involved in many physiological processes and also being linked to the development of several pathologies, including the type 2 diabetes mellitus. Pancreatic beta cells are very sensitive to oxidative stress because of their low antioxidant capacity, wich results from their low expression and activity of antioxidant enzymes, especially peroxidases. Dexamethasone is a synthetic diabetogenic glucocorticoid that induces cytotoxic effects on pancreatic beta cells. However, the precise mechanisms of dexamethasone toxicity on target cells are not fully understood. The aim of the present study was to analyzed whether dexamethasone induces oxidative stress in insulinproducing cells and pancreatic islets. Experimental design: The experiments were performed using 3 models: 1) RINm5F control cells, extremely sensitive to oxidative stress; 2) RINm5F cells overexpressing the enzyme catalase (RINm5F.Cat), very resistant to oxidative stress and 3) rat pancreatic islets cultured for 72 h with dexamethasone (Dexa) or cultured concomitantly with dexamethasone and the antioxidant N-acetylcysteine (Dexa+NAC). Results: An increased generation of reative oxygen species (ROS) was observed in dexamethasone-treated insulinproducing cells together with an increase in caspase-3 activity and apoptosis rate. Interestingly, exposure to dexamethasone increased the cytosolic superoxide dismutase Cu/ZnSOD protein expression and activity, while the mitochondrial MnSOD isoform was not affected by the glucocorticoid. Overexpression of catalase in insulin-producing cells prevented all the cytotoxic effects of dexamethasone. Pancreatic islets cultured in the presence of dexamethasone (Dexa) for 72 h showed increased ROS production. Glucose-stimulated insulin secretion was decreased after Dexa treatment. Intracellular ROS levels were decreased and the insulin secretion capacitywas recovered by concomitant treatment with Dexa+NAC. The total insulin content and intracellular Ca+2 levels were not modulated in either Dexa or Dexa+NAC groups. There was a decrease in the NAD(P)H production rate, used as an indicator of viability, after dexamethasone treatment. Concomitant incubation with NAC returned viability to control levels. Dexamethasone also decreased SYT VII gene expression; in contrast, the Dexa+NAC group showed increased expression of SYT VII compared to controls. Surprisingly, treatment with NAC decreased the gene expression of the antioxidant enzyme, Cu/ZnSOD. Conclusions: The cytotoxic effects of dexamethasone in RINm5F insulin-producing cells and pancreatic islets are primarily ROS-mediated. High levels of expression and activity of the Cu/ZnSOD might favour the generation of ROS. The overexpression of catalase and the use of the antioxidant Nacetylcysteine counteract the cytotoxic effects of dexamethasone. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular