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Évolution in silico des protéines monomériques et dimériques.Noirel, Josselin 23 October 2006 (has links) (PDF)
La simulation in silico des gènes codant pour des ARN de transfert et des protéines a connu un développement considérable ces dernières années car elle permet de déduire de modèles simples des comportements inattendus qui découlent de la structure des génotypes dans l'espace des séquences et de la correspondance génotype-phénotype. Le modèle d'évolution le plus élémentaire, la théorie dite "de l'évolution neutre" conçue et défendue par Kimura principalement, donne lieu à un phénomène à présent bien documenté: les génotypes robustes aux mutations et exprimant des protéines se repliant efficacement, sont surreprésentés en comparaison des génotypes "fragiles". De nombreuses questions restent en suspens notamment en ce qui concerne l'incidence que peut avoir une modélisation plus réaliste de la fonctionnalité d'une protéine sur le schéma tracé à partir de considérations purement structurales et cinétiques. Pour cela, nous avons développé un modèle incluant une contrainte sélective imposant une dimérisation spécifique minimale de deux protéines codées par deux gènes pour qu'un individu puisse survivre. Nous démontrons que les réseaux neutres construits d'après des critères structuraux sont grandement plastiques et peuvent s'adapter à une fonction vitale sans souffrir de baisse de stabilité. La surreprésentation des génotypes robustes est maintenue, elle est même amplifiée par l'interaction épistatique existant entre les deux gènes. On observe que cela s'accompagne d'une augmentation en moyenne de la fonctionnalité résultant de l'émergence d'un *superfunnel* fonctionnel dans l'espace des séquences. Cette propriété remarquable pourrait avoir d'importantes implications dans l'explication de l'émergence de nouvelles fonctions biologiques. Une autre question concerne les simplifications impliquées par le choix des modèles protéiques. Puisque les simulations évolutives supposent un coût de calcul important, les protéines sur réseau ont eu la préférence de nombreux modélisateurs. Dans ce mémoire, nous proposons un modèle de protéine hors réseau possédant des cartes de contacts plus complexes que les protéines sur réseau. Il confirme les conclusions tirées des simulations sur les protéines sur réseau.
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Carotenoid translocation and protein evolution in cyanobacterial photoprotection / Translocation des caroténoïdes et évolution des protéines dans la photoprotection des cyanobactériesMuzzopappa, Fernando 02 December 2019 (has links)
Les cyanobactéries sont des organismes photosynthétiques capables de convertir le CO₂ en composés organiques et de produire de l’oxygène en utilisant l’énergie lumineuse. Néanmoins, de fortes intensités lumineuses saturent l'appareil photosynthétique, ce qui conduit à la production d'espèces réactives de l'oxygène, dangereuses pour la cellule. Pour y faire face, la photoactive orange carotenoid protein (OCP) induit une dissipation thermique de l’énergie excédentaire récoltée par le complexe d’antennes, le phycobilisome (PBS), afin de diminuer l’énergie arrivant aux centres photochimiques. L'OCP est composé de deux domaines), le domaine C-terminal (CTD) et le domaine N-terminal (NTD), reliés par un domaine de liason flexible (linker). Pendant la photoactivation, le caroténoïde est transféré vers le NTD, les domaines se séparent et le NTD peut interagir avec le PBS. Trois familles d'OCP coexistent (OCPX, OCP1 et OCP2) dans les cyanobactéries modernes. Outre l'OCP, de nombreuses cyanobactéries contiennent également des homologues des domaines OCP, le CTDH et HCP. Les HCP sont une famille de protéines caroténoïdes présentant différents traits photoprotecteurs. La plupart d'entre eux sont de très bons quenchers d'oxygène singulet, et un subclade est capable d'interagir avec le PBS et d'induire une dissipation de l'énergie thermique comme l'OCP. Le rôle de CTDH était inconnu. La présence de ces homologues parallèlement à l'OCP a conforté l'idée générale que l'OCP a une origine évolutive modulaire et que la CTDH et HCP pourraient interagir pour former un complexe OCP-like ayant des caractéristiques et une fonction similaires à celles de l'OCP. Dans cette thèse, je présente la première caractérisation des protéines CTDH. Les CTDH sont des dimères se liant à une molécule de caroténoïde. Le rôle principal de la CTDH est de transférer son caroténoïde au HCP. De plus, les CTDH sont capables de récupérer les caroténoïdes des membranes contrairement aux HCP. Ces résultats suggèrent fortement que les CTDH sont des transporteurs de caroténoïde qui assurent le chargement en caroténoïde sur les HCP. Ce nouveau mécanisme de translocation des caroténoïdes pourrait être multidirectionnel. La résolution de deux structures tridimensionnelles de l'ApoCTDH d'Anabaena a montré que la queue C-terminale du CTDH (CTT) peut adopter différentes conformations. De plus, l'analyse de mutation a démontré que le CTT joue un rôle essentiel dans la translocation des caroténoïdes. Enfin, je rapporte une caractérisation moléculaire du linker reliant les domaines de différents OCP modernes et son rôle au cours de l'évolution de l'OCP. Tout d’abord, j’ai caractérisé les OCP des trois subclades, y compris l’OCPX non caractérisé. OCPX et OCP2 présentent une désactivation rapide par rapport à OCP1. Alors que OCP1 et OCPX peuvent dimériser, OCP2 est stable en tant que monomère. Enfin, j'ai constaté que le linker est essentiel pour la désactivation de l'OCP et qu'il régule la photoactivation. Dans OCP1 et OCPX, le linker ralentit la photoactivation, tandis que dans OCP2, il augmente le taux de photoactivation. L'analyse bioinformatique complète cette caractérisation et fournit une image claire de l'évolution de l'OCP pour répondre efficacement aux conditions de stress. / Cyanobacteria are photosynthetic organisms capable of CO₂ conversion into organic compounds and production of O2 by using light energy. Nevertheless, high light intensities saturate the photosynthetic apparatus leading to production of reactive oxygen species, which are dangerous for the cell. To cope with this, the photoactive Orange Carotenoid Protein (OCP) induces thermal dissipation of the excess energy harvested by the antenna complex, the phycobilisome (PBS) to decrease the energy arriving at the photochemical centers. The OCP is composed of two domains connected by a flexible linker, the C-terminal domain (CTD) and the N-terminal domain (NTD). During photoactivation, the carotenoid is translocated to the NTD, the domains separate and the NTD is able to interact with the PBS. Three OCP families co-exist (OCPX, OCP1 and OCP2) in modern cyanobacteria. In addition to the OCP, many cyanobacteria also contain homologs of OCP domains, the CTDH and HCP. The HCPs are a family of carotenoid proteins with different photoprotective traits. Most of them are very good singlet oxygen quenchers, and one sub-clade is able to interact with the PBS and to induce thermal energy dissipation like OCP. The role of CTDH was unknown. The presence of these homologs in parallel to the OCP supported the general idea that the OCP has a modular evolutionary origin and that the CTDH and HCP can interact forming an OCP-like complex with similar characteristics and function than the OCP.In this thesis, I present the first characterization of the CTDH proteins. CTDHs are dimers binding a carotenoid molecule. The main role of the CTDH is to transfer its carotenoid to the HCP. In addition, CTDHs are able to uptake carotenoids from membranes but not HCPs. These results strongly suggested that the CTDHs are carotenoid carriers that ensure the proper carotenoid loading into HCPs. This novel carotenoid translocation mechanism could be multidirectional. The resolution of two tridimensional structures of the ApoCTDH from Anabaena showed that the C-terminal tail of the CTDH (CTT) can populate different conformations. Moreover, mutational analysis demonstrated that the CTT has an essential role in carotenoid translocation. Finally, I report a molecular characterization of the flexible linker connecting the domains of different modern OCPs and its role during the evolution of the OCP. First, I characterized OCPs from the three subclades, including the uncharacterized OCPX. OCPX and OCP2 present a fast deactivation compared with OCP1. While OCP1 and OCPX can dimerize, OCP2 is stable as monomer. Finally, I found that the linker is essential for the OCP deactivation and it regulates the photoactivation. In OCP1 and OCPX the linker slows down the photoactivation, while in OCP2 it increases the photoactivation rate. Bioinformatic analysis complements this characterization and provides a clear picture of the evolution of the OCP to respond efficiently to stress conditions.
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Modeling protein evolution using secondary structuresMohaddes, Zia 08 1900 (has links)
L’évolution des protéines est un domaine important de la recherche en bioinformatique et catalyse l'intérêt de trouver des outils d'alignement qui peuvent être utilisés de manière fiable et modéliser avec précision l'évolution d'une famille de protéines. TM-Align (Zhang and Skolnick, 2005) est considéré comme l'outil idéal pour une telle tâche, en termes de rapidité et de précision.
Par conséquent, dans cette étude, TM-Align a été utilisé comme point de référence pour faciliter la détection des autres outils d'alignement qui sont en mesure de préciser l'évolution des protéines. En parallèle, nous avons élargi l'actuel outil d'exploration de structures secondaires de
protéines, Helix Explorer (Marrakchi, 2006), afin qu'il puisse également être utilisé comme un outil pour la modélisation de l'évolution des protéines. / Protein evolution is an important field of research in bioinformatics and catalyzes the requirement of finding alignment tools that can be used to reliably and accurately model the evolution of a protein family. TM-Align (Zhang and Skolnick, 2005) is considered to be the ideal tool for such a task, in terms of both speed and accuracy. Therefore in this study, TM-Align has been used as a
point of reference to facilitate the detection of other alignment tools that are able to accurately model protein evolution. In parallel, we expand the existing protein secondary structure explorer tool, Helix Explorer (Marrakchi, 2006), so that it can also be used as a tool to model protein
evolution.
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Modeling protein evolution using secondary structuresMohaddes, Zia 08 1900 (has links)
L’évolution des protéines est un domaine important de la recherche en bioinformatique et catalyse l'intérêt de trouver des outils d'alignement qui peuvent être utilisés de manière fiable et modéliser avec précision l'évolution d'une famille de protéines. TM-Align (Zhang and Skolnick, 2005) est considéré comme l'outil idéal pour une telle tâche, en termes de rapidité et de précision.
Par conséquent, dans cette étude, TM-Align a été utilisé comme point de référence pour faciliter la détection des autres outils d'alignement qui sont en mesure de préciser l'évolution des protéines. En parallèle, nous avons élargi l'actuel outil d'exploration de structures secondaires de
protéines, Helix Explorer (Marrakchi, 2006), afin qu'il puisse également être utilisé comme un outil pour la modélisation de l'évolution des protéines. / Protein evolution is an important field of research in bioinformatics and catalyzes the requirement of finding alignment tools that can be used to reliably and accurately model the evolution of a protein family. TM-Align (Zhang and Skolnick, 2005) is considered to be the ideal tool for such a task, in terms of both speed and accuracy. Therefore in this study, TM-Align has been used as a
point of reference to facilitate the detection of other alignment tools that are able to accurately model protein evolution. In parallel, we expand the existing protein secondary structure explorer tool, Helix Explorer (Marrakchi, 2006), so that it can also be used as a tool to model protein
evolution.
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Towards higher predictability in enzyme engineering : investigation of protein epistasis in dynamic ß-lactamases and Cal-A lipaseAlejaldre Ripalda, Lorea 12 1900 (has links)
L'ingénierie enzymatique est un outil très avantageux dans l'industrie biotechnologique. Elle permet d'adapter les enzymes à une activité ou à une condition de réaction spécifique. En outre, elle peut permettre de déchiffrer les éléments clés qui ont facilité leur modification. Bien que l'ingénierie enzymatique soit largement pratiquée, elle comporte encore plusieurs goulets d'étranglement. Certains de ces goulets d'étranglement sont techniques, comme le développement de méthodologies pour la création de banques de mutations ciblées ou la réalisation de criblages à haut débit, et d'autres sont conceptuels, comme le déchiffrage des caractéristiques clés pertinentes d'une protéine cible pour la réussite d'un projet d'ingénierie. Parmi ces défis, l'épistasie intra-génique, ou la non-additivité des effets phénotypiques des mutations, est une caractéristique qui entrave grandement la prévisibilité. L'amélioration de l'ingénierie enzymatique nécessite une approche multidisciplinaire qui inclut une meilleure compréhension des relations structure-fonction-évolution.
Cette thèse vise à contribuer à l'avancement de l'ingénierie enzymatique en étudiant deux systèmes modèles. Premièrement, des variantes dynamiques de la ß-lactamase TEM-1 ont été choisies pour étudier le lien entre la dynamique des protéines et l'évolution. La ß-lactamase TEM-1 a été largement caractérisée dans la littérature, ce qui s'est traduit par des connaissances approfondies sur son mécanisme de réaction, ses caractéristiques structurelles et son évolution. Les variantes de la ß-lactamase TEM-1 utilisées comme système modèle dans cette thèse ont été largement caractérisées, montrant une dynamique accrue à l'échelle temporelle pertinente pour la catalyse (µs à ms) mais maintenant la reconnaissance du substrat. Dans cette thèse, l'évolution in vitro de ces variantes dynamiques a été réalisée par des cycles itératifs de mutagenèse et de sélection aléatoires pour permettre une exploration impartiale du paysage de ‘fitness’. Nous démontrons que la présence de ces mouvements particuliers au début de l'évolution a permis d'accéder à des voies de mutations connues. De plus, des interactions épistatiques connues ont été introduites dans les variantes dynamiques. Leur caractérisation in silico et cinétique a révélé que les mouvements supplémentaires sur l'échelle de temps de la catalyse ont permis d'accéder à des conformations conduisant à une fonction améliorée, comme dans le TEM-1 natif. Dans l'ensemble, nous démontrons que l'évolution de la b-lactamase TEM-1 vers une nouvelle fonction est compatible avec divers mouvements à l'échelle de temps µs à ms. Il reste à savoir si cela peut se traduire par d'autres enzymes ayant un potentiel biotechnologique.
Deuxièmement, la lipase Cal-A, pertinente sur le plan industriel, a été choisie pour identifier les caractéristiques qui pourraient faciliter son ingénierie. La lipase Cal-A présente des caractéristiques telles que la polyvalence du substrat et une grande stabilité thermique et réactivité qui la rendent attrayante pour la modification des triglycérides ou la synthèse de molécules pertinentes dans les industries alimentaire et pharmaceutique. Contrairement à TEM-1, la plupart des études d'évolution in vitro de la lipase Cal-A ont été réalisées dans un but industriel, avec une exploration limitée de l'espace de mutation. Par conséquent, les caractéristiques qui définissent la fonction de la lipase Cal-A restent insaisissables. Dans cette thèse, nous faisons état de la mutagenèse ciblée de la lipase Cal-A, confirmant l'existence d'une région clé pour la reconnaissance du substrat. Cela a été fait en combinant une nouvelle méthodologie de création de bibliothèque basée sur l'assemblage Golden-gate avec une visualisation structurelle basée sur des scripts pour identifier et cartographier les mutations sélectionnées dans la structure 3D. La caractérisation et la déconvolution de deux des plus aptes ont révélé l'existence d'une épistasie dans l'évolution de la lipase Cal-A vers une nouvelle fonction. Dans l'ensemble, nous démontrons que l’identification d'une variété de propriétés suite à la mutagenèse ciblée peut grandement améliorer la connaissance d'une enzyme. Cette information peut être appliquée pour améliorer l'efficacité de l'ingénierie dirigée. / Enzyme engineering is a tool with great utility in the biotechnological industry. It allows to tailor enzymes to a specific activity or reaction condition. In addition, it can allow to decipher key elements that facilitated their modification. While enzyme engineering is extensively practised, it still entails several bottlenecks. Some of these bottlenecks are technical such as the development of methodologies for creating targeted mutational libraries or performing high-throughput screening and some are conceptual such as deciphering the key relevant features in a target protein for a successful engineering project. Among these challenges, intragenic epistasis, or the non-additivity of the phenotypic effects of mutations, is a feature that greatly hinders predictability. Improving enzyme engineering needs a multidisciplinary approach that includes gaining a better understanding of structure-function-evolution relations.
This thesis seeks to contribute in the advancement of enzyme engineering by investigating two model systems. First, dynamic variants of TEM-1 ß-lactamase were chosen to investigate the link between protein dynamics and evolution. TEM-1 ß-lactamase has been extensively characterized in the literature, which has translated into extensive knowledge on its reaction mechanism, structural features and evolution. The variants of TEM-1 ß-lactamase used as model system in this thesis had been extensively characterized, showing increased dynamics at the timescale relevant to catalysis (µs to ms) but maintaining substrate recognition. In this thesis, in vitro evolution of these dynamic variants was done by iterative rounds of random mutagenesis and selection to allow an unbiased exploration of the fitness landscape. We demonstrate that the presence of these particular motions at the outset of evolution allowed access to known mutational pathways. In addition, known epistatic interactions were introduced in the dynamic variants. Their in silico and kinetic characterization revealed that the additional motions on the timescale of catalysis allowed access to conformations leading to enhanced function, as in native TEM-1. Overall, we demonstrate that the evolution of TEM-1 b-lactamase toward new function is compatible with diverse motions at the µs to ms timescale. Whether this can be translated to other enzymes with biotechnological potential remains to be explored.
Secondly, the industrially relevant Cal-A lipase was chosen to identify features that could facilitate its engineering. Cal-A lipase presents characteristics such as substrate versatility and high thermal stability and reactivity that make it attractive for modification of triglycerides or synthesis of relevant molecules in the food and pharmaceutical industries. Contrary to TEM-1, most in vitro evolution studies of Cal-A lipase have been done towards an industrially-specified goal, with limited exploration of mutational space. As a result, features that define function in Cal-A lipase remain elusive. In this thesis, we report on focused mutagenesis of Cal-A lipase, confirming the existence of a key region for substrate recognition. This was done by combining a novel library creation methodology based on Golden-gate assembly with script-based structural visualization to identify and map the selected mutations into the 3D structure. The characterization and deconvolution of two of the fittest revealed the existence of epistasis in the evolution of Cal-A lipase towards new function. Overall, we demonstrate that mapping a variety of properties following mutagenesis targeted to specific regions can greatly improve knowledge of an enzyme that can be applied to improve the efficiency of directed engineering.
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