Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Une nouvelle lignée homozygote de souris « humanisé » HLA transgéniques : HLA-A2.1+/+HLA-DP4+/+hCD4+/+mCD4-/-IAβ-/-β2m-/- (HLA-A2/DP4), a été obtenue en croisant entre les souris HLA transgéniques HLA-A2.1+/+β2m-/-(A2) et les souris HLA transgéniques HLA-DP4+/+hCD4+/+mCD4-/-IAβ-/-(DP4). Chez les souris HLA-A2/DP4, les réponses cellulaire T HLA-A2 restreint ou HLA-DP4 restreint contre l’antigène HBs du virus de l’Hépatite B suite à une immunisation avec le vaccin anti-AgHBs sont similaires à ceux observés chez les souris A2, chez les souris DP4, chez les humains infectés par le virus ou immunisés avec le même vaccin. Ces résultats montrent que les réponses cellulaires induites les souris HLA-A2/DP4 miment fidèlement les réponses homologues humaines. Ainsi, ces souris représentent un excellent modèle d’expérimentations précliniques animal pour évaluer ou comparer l’efficacité des réponses « humain » induites in vivo par des candidates vaccins. Le modèle facilitera également l'identification de nouvelles épitopes HLA-A2 et HLA-DP4 restreints, qui constituera de futurs réactives de suivi clinique des réponses contre l'infection chez les humains.En exploitant ces souris HLA-A2/DP4, nous avons identifié quatre nouveaux HLA-DP4-restricted épitopes issus de l'AgHBs et deux nouveaux HLA-A2 restreint épitopes dérivés de protéines M1. / A new homozygous humanized HLA transgenic mouse strain, HLA-A2.1+/+HLA-DP4+/+hCD4+/+mCD4-/-IAβ-/-β2m-/- (HLA-A2/DP4), was obtained by crossing the HLA transgenic HLA-A2.1+/+β2m-/-(A2) mice and HLA transgenic HLA-DP4+/+hCD4+/+mCD4-/-IAβ-/-(DP4) mice. In HLA-A2/DP4 mice, HLA-A2 restricted or HLA-DP4 restricted T cell responses against HBs antigen of hepatitis B virus after immunization with the HBsAg vaccine are similar to those induced in A2 mice, in DP4 mice, in HBV-infected or HBsAg-vaccinated humans. These results show that cellular responses induced in HLA-A2/DP4 mice faithfully mimic human responses counterparts. Thus, these mice represent an excellent animal model for preclinical experimentations to evaluate or compare the effectiveness of responses "human" induced in vivo by candidate vaccines. The model will also facilitate the identification of new epitopes HLA-A2 and HLA-DP4 restricted, which will be of future reactive for clinical monitoring response against infection in humans. By exploiting these HLA-A2/DP4 mice, we identified four new HLA-DP4-restricted epitopes from HBsAg and two new HLA-A2 restricted epitopes derived from protein M1.

La Glomérulonéphrite extra-membraneuse est une maladie auto-immune rare mais grave qui conduit dans 30% des cas à une insuffisance rénale chronique terminale nécessitant le recours à la dialyse ou la greffe rénale. Dans les suites d’une greffe, la GEM récidive dans 30 à 40% des cas. En 2009, l’équipe du Pr. Salant en collaboration avec notre équipe a montré que 70% des patients présentant une GEM étaient porteurs d’anticorps (Ac) dirigés contre le récepteur des phospholipases A2 (PLA2R1). Le titre d’anticorps est corrélé à l’activité de la maladie. Il n’existe actuellement aucun biomarqueur permettant de prédire l’évolution de la fonction rénale d’un patient lors de sa prise en charge : dans 30% des cas les patients présentent une rémission spontanée sans traitement immunosuppresseur. Le traitement de la GEM repose sur un traitement symptomatique et une réévaluation après 6 mois. En cas de maladie active persistante, il faut débuter un traitement immunosuppresseur. Dans les formes graves, cette période d’observation de 6 mois peut être à l’origine de lésions irréversibles. Nous avons validé un test ELISA permettant de quantifier les Ac anti-PLA2R1 au cours du suivi de patients porteurs d’une GEM. Ce test nous a permis de montrer sur une cohorte de 15 patients greffés dans les suites d’une GEM qu’un titre d’Ac anti-PLA2R1 persistant après la greffe était associé à un risque de récidive de la maladie sur le greffon. Nous avons ensuite produit dans des cellules HEK les orthologues de PLA2R1 (les récepteurs humain, lapin et murin). / Membranous Nephropathy (MN) is a major cause of nephrotic syndrome in adults. It is a rare but severe kidney disease with different etiologies and outcomes. In most cases (85%), the disease is idiopathic (iMN) and has an autoimmune origin. One third of patients develop end-stage kidney disease and are on kidney transplant waiting list. MN recurred in 30% after transplantation. Another third enter in spontaneous remission under renin-angiotensin system blockade. The treatment of iMN is controversial. KDIGO guidelines recommend a supportive symptomatic treatment with RAS-blockade and diuretics in all patients with iMN, and immunosuppressive therapy in case of renal function deterioration or persistent nephrotic syndrome. Therefore, immunosuppressive treatments are often started only after significant and potentially irreversible complications. No biological markers can predict clinical outcome and orient therapy. A major breakthrough was the discovery of autoantibodies to the phospholipase A2 receptor (PLA2R1, 180 kDa) in 70% of iMN patients in 2009, which has now allowed to develop diagnosis and prognosis tests for better medical care. During my PhD, I have first participated to the development of an ELISA which is now commercially available. I then used this latter to demonstrate that persistent anti-PLA2R1 activity can predict iMN recurrence after transplantation in a retrospective cohort of 15 patients. We then screened 50 patients with iMN on native kidney for their cross-reactivity to human (h), rabbit (rb) and mouse (m) PLA2R1 by western blot (WB) and antigen-specific ELISAs.

Le développement d'un traitement curatif du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est devenu le défi majeur pour le futur mais les réservoirs et une réponse immunitaire insuffisamment efficace constituent des barrières pour l’élimination du virus. La réponse immune contre l’infection VIH dépend en partie de la capacité des cellules hôtes à présenter correctement les épitopes viraux pour induire une réponse spécifique des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL). Cette présentation des épitopes viraux qui pourrait être optimisée par vaccination, dépend du système HLA (Human Leukocyte Antigen) du patient présentant un déterminisme génétique individuel. Correctement pré-stimulés, les CD8 cibleraient et détruiraient efficacement les cellules productrices du virus. Les précédents essais vaccinaux stimulant la réponse CTL n’ont pas montré d’efficacité dans la réponse virologique, probablement parce qu’ils sont composés d’épitopes "génériques" et qu’ils ne prennent pas en compte la variabilité du VIH ni l’immunogénétique des patients.L’objectif de ce travail est d’identifier des épitopes archivés dans l’ADN proviral, susceptibles d’induire une réponse CTL en considérant la variabilité du VIH-1 et la variabilité immunogénétique des patients infectés par le VIH-1 en succès thérapeutique. L’idée, à terme, est d’utiliser les peptides correspondants comme base de vaccin thérapeutique et de permettre au système immunitaire de prendre le relai du traitement antirétroviral pour contrôler l’infection virale.Cent quarante patients infectés par le VIH-1, suivis au CHU de Bordeaux en succès thérapeutique depuis plus de 6 mois ont été inclus dans le projet Provir/Latitude 45 entre 2012 et 2017. Une cartographie de la répartition des sous-types viraux du VIH-1 en Aquitaine a d’abord été réalisée. L’analyse de plus de 3200 génotypes de résistance VIH-1 effectués entre 2012 et 2016 a permis de déterminer que le sous-type viral majoritaire infectant les patients vivants avec le VIH dans la région est le sous-type B, suivi du CRF02_AG qui est majoritaire parmi les sous-types viraux non B. Si l’on se focalise sur les patients inclus dans ce projet on retrouve des répartitions similaires. Suite à cette première analyse, un nouveau virus recombinant composé de CRF06_cpx et de sous-type B a pu être identifié. Il est référencé en tant que CRF98_cpx. Un des patients inclus au sein du projet est d’ailleurs infecté par ce virus. Afin d’identifier des épitopes candidats pouvant servir de base à un vaccin thérapeutique pour l’ensemble de la population ou pour un groupe de la population en fonction de leurs caractéristiques immunogénétiques, nous avons combiné les données des séquences virales avec le typage HLA des patients afin de prédire in silico l’affinité entre un HLA et un peptide via les algorithmes d’IEDB. Pour automatiser l’analyse des données, un logiciel, TutuGenetics, a été développé. Ce logiciel instrumentalise les algorithmes d’IEDB et permet d’étudier la variabilité de la présentation des épitopes par les différents HLA du patient grâce à un score MHC IC50 déterminé pour chaque couple HLA-séquence virale. Ce logiciel a été validé en comparant l’analyse des données issues du séquençage Next Generation Sequencing avec le séquençage Sanger. Finalement, pour les 140 patients inclus dans le projet Provir, TutuGenetics a effectué un découpage des séquences virales par pas de 8 à 10 acides aminés et les valeurs MHC IC50 ont été définies pour toutes les combinaisons HLA-épitope. Une analyse plus fine nous a ensuite permis de déterminer une liste de 15 épitopes avec une forte affinité in silico pour les HLA majoritaires finalement retenue pour une cocktail vaccinal.Ces données in silico vont dans une prochaine phase être confirmées in vitro via des tests d’immunologie fonctionnelle, puis in vivo chez le macaque. / HIV (Human Immunodeficiency Virus) cure is the major challenge of the future but latent reservoir and inefficient immune response do not allow virus elimination. The immune response against HIV infection depends on host cells ability to correctly present viral epitopes to induce specific cytotoxic CD8+ T lymphocytes (CTL) response. This presentation of viral epitopes which could be improved by vaccination depends on the HLA (Human Leukocyte Antigen) system of the patient which is extremely variable. Accurately pre-stimulated, CTL would target and destroy efficiently virus-producing cells. Previous vaccine trials stimulating CTL response haven’t shown efficient virological response, presumably because epitopes used are generic without taking into account HIV-1 or patient’ immunogenetic variability.The aim of this work is to identify epitopes archived in the proviral DNA, considered to induce CTL response according to the HIV-1 and immunogenetic variability of the patients at therapeutic success. The goal is to use these peptides for a therapeutic vaccine and educate the immune system to control the viral replication without any antiretroviral treatment.One hundred and forty patients infected with HIV-1, followed at the University Hospital of Bordeaux, at therapeutic success for more than 6 months have been included in the Provir/Latitude 45 project between 2012 and 2017. A mapping of the distribution of viral subtypes of HIV-1 in Aquitaine was first performed. Analysis of more than 3200 HIV-1 genotypes conducted from 2012 to 2016 determined that the major viral subtype infecting patients living with HIV in the region is subtype B, followed by CRF02_AG which is predominant among the non-B viral subtypes. Focusing on the patients included in this project led us to find similar distributions. Following this initial analysis, a new recombinant virus composed of CRF06_cpx and subtype B could be identified. It is now referenced as CRF98_cpx. One of the patients included in the project is infected with this virus. In order to identify candidate epitopes that can serve as a therapeutic vaccine for the entire population or for a population group based on their immunogenetic characteristics, we combined the viral sequence data with the HLA typing of patients to predict the affinity in silico between an HLA and a peptide via IEDB algorithms. To automate data analysis, a software package, TutuGenetics, has been developed. This software exploits IEDB algorithms and makes it possible to study the variability of the presentation of epitopes by the different HLAs of the patient thanks to an MHC IC50 score determined for each HLA-viral sequence pair. This software has been validated by comparing the analysis of data from Next Generation Sequencing (NGS) with Sanger sequencing. Finally, for 140 patients included in the Provir project, TutuGenetics sliced the viral sequences in steps of 8 to 10 amino acids and MHC IC50 values were defined for all HLA-epitope combinations. A finer analysis allowed us to determine a list of 15 epitopes with high in silico affinity for major HLAs. These epitopes were selected by applying different filters and only HLA-peptide couples with more than 10 patients sequenced per position and by HLA were kept in this "Optimal_Provir" list.These in silico data will in a next phase be confirmed in vitro via functional immunology tests, then in vivo in macaques.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Introduction: Les cadres de lectures alternatifs (CLA) sont utilisés par de multiples virus afin de générer plusieurs protéines à partir d'une seule séquence nucléotidique. Les épitopes dits « cryptiques », c’est-à-dire les épitopes dérivés de protéines codées dans des CLAs, ont étés dernièrement l’objet de différentes études portant sur la réponse immunitaire antivirale et les lymphocytes T cytotoxiques. Méthodologie: Afin de vérifier le potentiel immunogène d'épitopes encodés dans des CLAs programmés, trois cassettes ont été construites pour mener à l'expression de trois épitopes bien caractérisés (épitope GAG77–85 du virus de l'immunodéficience humaine de type 1; épitope NS31406-1415 du virus de l'hépatite C; épitope core18-27 du virus de l'hépatite B) à partir de trois cadres de lectures superposés. La première cassette permet une initiation alternative de la traduction, la deuxième comprend deux signaux bipartites en tandem permettant un frameshift ribosomique et la troisième est une cassette contrôle. Ces éléments ont été introduits dans des vecteurs adénoviraux. Les virions générés ont servi à immuniser des souris C57BL/6 transgéniques pour HLA-A*0201 et HLA-DR1. La réponse immunitaire induite une semaine post-immunisation a été mesurée par essai ELISpot IFN . Résultats: Dans le contexte de cassettes vaccinales, les peptides dérivés d'une initiation alternative de traduction et de changement de cadre de lecture ribosomique ribosomal peuvent être exprimés et détectés par le système immunitaire dans un modèle animal. Conclusion: Ces expériences suggèrent la possibilité de développer de nouvelles stratégies vaccinales dans le but de prévenir ou de guérir certaines maladies associées aux infections virales chroniques telles que celles causées par le virus de l’immunodéficience humaine et le virus de l’hépatite C. / Introduction: Alternative reading frames (ARFs) are used by multiple viruses in order to generate different proteins from a single nucleotide sequence. Cryptic epitopes, which comprise antigens derived from proteins encoded in ARFs, have recently been the focus of studies pertaining to antiviral immunity and cytotoxic T lymphocytes. Methodology: In order to verify the immunological potential of epitopes encoded in programmed ARFs, three cassettes were constructed to permit the expression of three welldescribed epitopes (GAG77–85 epitope of human immunodeficiency virus type 1; NS31406-1415 epitope of hepatitis C virus; core18-27 epitope of hepatitis B virus) from three overlapping reading frames. The first cassette permits alternative translation initiation, the second cassette includes signals inducing ribosomal frameshifting and the third cassette serves as a control. These elements were introduced into adenoviral vectors. Recombinant adenoviruses were used to immunize C57BL/6 transgenic mice expressing HLA-A*0201 and HLA-DR1. The immune response induced was measured one week following immunization using IFN ELISpot assays. Results: In the context of vaccine cassettes, peptides derived from alternative translation initiation and ribosomal frameshifting can be expressed and detected by the immune system in an animal model. Conclusion: These findings suggest the possibility of designing vaccination strategies in the hope of preventing or curing certain diseases associated with chronic viral infections, such as those caused by human immunodeficiency virus and hepatitis C virus.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Introduction: Les cadres de lectures alternatifs (CLA) sont utilisés par de multiples virus afin de générer plusieurs protéines à partir d'une seule séquence nucléotidique. Les épitopes dits « cryptiques », c’est-à-dire les épitopes dérivés de protéines codées dans des CLAs, ont étés dernièrement l’objet de différentes études portant sur la réponse immunitaire antivirale et les lymphocytes T cytotoxiques. Méthodologie: Afin de vérifier le potentiel immunogène d'épitopes encodés dans des CLAs programmés, trois cassettes ont été construites pour mener à l'expression de trois épitopes bien caractérisés (épitope GAG77–85 du virus de l'immunodéficience humaine de type 1; épitope NS31406-1415 du virus de l'hépatite C; épitope core18-27 du virus de l'hépatite B) à partir de trois cadres de lectures superposés. La première cassette permet une initiation alternative de la traduction, la deuxième comprend deux signaux bipartites en tandem permettant un frameshift ribosomique et la troisième est une cassette contrôle. Ces éléments ont été introduits dans des vecteurs adénoviraux. Les virions générés ont servi à immuniser des souris C57BL/6 transgéniques pour HLA-A*0201 et HLA-DR1. La réponse immunitaire induite une semaine post-immunisation a été mesurée par essai ELISpot IFN . Résultats: Dans le contexte de cassettes vaccinales, les peptides dérivés d'une initiation alternative de traduction et de changement de cadre de lecture ribosomique ribosomal peuvent être exprimés et détectés par le système immunitaire dans un modèle animal. Conclusion: Ces expériences suggèrent la possibilité de développer de nouvelles stratégies vaccinales dans le but de prévenir ou de guérir certaines maladies associées aux infections virales chroniques telles que celles causées par le virus de l’immunodéficience humaine et le virus de l’hépatite C. / Introduction: Alternative reading frames (ARFs) are used by multiple viruses in order to generate different proteins from a single nucleotide sequence. Cryptic epitopes, which comprise antigens derived from proteins encoded in ARFs, have recently been the focus of studies pertaining to antiviral immunity and cytotoxic T lymphocytes. Methodology: In order to verify the immunological potential of epitopes encoded in programmed ARFs, three cassettes were constructed to permit the expression of three welldescribed epitopes (GAG77–85 epitope of human immunodeficiency virus type 1; NS31406-1415 epitope of hepatitis C virus; core18-27 epitope of hepatitis B virus) from three overlapping reading frames. The first cassette permits alternative translation initiation, the second cassette includes signals inducing ribosomal frameshifting and the third cassette serves as a control. These elements were introduced into adenoviral vectors. Recombinant adenoviruses were used to immunize C57BL/6 transgenic mice expressing HLA-A*0201 and HLA-DR1. The immune response induced was measured one week following immunization using IFN ELISpot assays. Results: In the context of vaccine cassettes, peptides derived from alternative translation initiation and ribosomal frameshifting can be expressed and detected by the immune system in an animal model. Conclusion: These findings suggest the possibility of designing vaccination strategies in the hope of preventing or curing certain diseases associated with chronic viral infections, such as those caused by human immunodeficiency virus and hepatitis C virus.

L’interféron-α pegylé en combinaison avec la ribavirin est le seul traitement approuvé pour le traitement de l’infection au virus de l’hépatite C (VHC). L’efficacité est de 50-75%, la thérapie est coûteuse et induit beaucoup d’effets secondaires. Il est impératif d’avoir une meilleure compréhension de la pathogenèse du VHC afin de développer des traitements plus efficaces ou un vaccin. À cette fin, notre approche est de caractériser la réponse immunitaire cellulaire induite par ARFP, un antigène nouveau et conservé chez le VHC, et de cartographier les épitopes de la réponse immunitaire cellulaire d’un patient infecté au génotype 3a ayant résolu spontanément. Le génotype 3a, étant prévalant chez les utilisateurs de drogues intraveineuses (IDUs) constitue 60% des nouvelles infections. Peu d’épitopes furent identifiés auparavant pour ce génotype, ce qui rend l’étude de la réponse immunitaire difficile chez cette population. Dans cette étude, pour la réponse immunitaire cellulaire dirigée contre ARFP, nous n’avons pas observé de différence significative entre les patients ayant résolu spontanément comparativement avec ceux ayant développé une infection persistante. Ceci suggère fortement que ARFP ne joue pas un rôle majeur lors de la résolution de l’infection aigue au VHC. Pour la caractérisation de la réponse immunitaire cellulaire chez un des patients infectés au génotype 3a, nous avons identifié et caractérisé 5 épitopes spécifiquement reconnus par des lymphocytes T, CD3+, CD4+ et CD8- : E2504-521, NS31064-1081, NS4b1759-1776, NS5a2074-2091, NS5b2421-2436. Nous avons comparé avec ceux connus pour le génotype 1a. Nous avons identifié 4 nouveaux épitopes. Enfin, l’épitope NS4b1759-1776, identifié auparavant, pourrait s’avérer être un candidat intéressant dans la mise au point d’un vaccin à base de peptides immunogéniques contre le VHC. / Interferon-α combined with ribavirin is the only approved treatment of hepatitis c virus (HCV) infection. The efficiency is between 50-75%, the therapy is expensive and has numerous side-effects. It is imperative to have a better understanding of HCV pathogenesis to develop better treatments or a vaccine. To this end, our approach is to characterize the immune cellular response against ARFP, a newly identified and conserved antigen of HCV; and to characterize and fine map cellular immune response of a patient infected with genotype 3a that spontanously resolved. Genotype 3a is most prevelant in intravenous drug users (IDUs) where nearly 60% of all new HCV infections happen. Very few epitopes are known for genotype 3a which makes it difficult to study HCV-specific immune responses in this population. In this study, for ARFP specific cellular responses, we observed no significant difference between patients that spontanously resolved compared to those who developped persistent infection. This strongly suggests that ARFP does not play a major role in acute HCV infection resolution. For the charaterization of immune cellular response developped against genotype 3a, we identified and characterized 5 epitopes recognized by lymphocytes T, CD3+, CD4+, CD8-: E2504-521, NS31064-1081, NS4B1759-1776, NS5A2074-2091, NS5B2421-2436. We compared them with epitopes known for genotype 1a. We have identified 4 novel epitopes. Finally, NS4B1759-1776, previously identified, could be a good candidate in the developement of a peptide based vaccine against HCV.

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