Στον αμφιβληστροειδή επιτελείται η μετατροπή δηλαδή της φωτεινής ενέργειας σε ηλεκτρικό ερέθισμα. Κύριος διεγερτικός διαβιβαστής στον αμφιβληστροειδή είναι το γλουταμινικό οξύ του οποίου η δράση επιτελείται μέσω ιοντοτρόπων, NMDA και μη NMDA, και μεταβοτρόπων υποδοχέων. Οι υποδοχείς ΝΜDA παρουσιάζουν ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, όπως μεγάλη αγωγιμότητα ασβεστίου και τασεοεξαρτώμενη αναστολή από το Μg, ενώ φαίνεται να παίζουν ιδιαίτερο ρόλο σε διαδικασίες συναπτικής πλαστικότητας, στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος καθώς και στην διεγερσιτοξικότητα του γλουταμινικού. Στον αμφιβληστροειδή εντοπίζονται κυρίως στα γαγγλιακά και βραχύϊνα κύτταρα αλλά και σε διάμεσους νευρώνες. Οι υποδοχείς NMDA είναι ετερομερή που αποτελούνται από τις υπομονάδες NR1, NR2 και NR3. Το γονίδιο της βασικής λειτουργικής υπομονάδας NR1 περιέχει τρία εξόνια τα οποία υφίστανται εναλλακτικό μάτισμα προς δημιουργία οχτώ ισομορφών. Οι ισομορφές που περιλαμβάνουν το εξόνιο 21 ή C1 στο καρβοξυτελικό άκρο έχουν την χαρακτηριστική ιδιότητα φωσφορυλίωσης στην θρεονίνη 879 και στις σερίνες 890, 896 και 897. Η φωσφορυλίωση αποτελεί έναν από τους κυριότερους μηχανισμούς ρύθμισης των υποδοχέων του γλουταμινικού οξέος επηρεάζοντας τις ιδιότητες τους, την μεταφορά τους προς την κυτταρική μεμβράνη, αλλά και την υποκυτταρική κατανομή των υπομονάδων τους. Στόχος της εργασίας είναι η μελέτη της φωσφορυλιωμένης υπομονάδας NR1 του υποδοχέα NMDA στις θέσεις σερίνης 896 και 897 (NR1-Ser896 και NR1-Ser897) κατά την ανάπτυξη στον αμφιβληστροειδή. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε επίμυες Wistar ηλικιών 9, 14, 21, 35 και 60 ημερών. Με την μέθοδο ανοσοαποτύπωσης κατά Western μελετήσαμε τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης πρωτείνης. Η ΝR1-Ser897 παρουσιάζει ένα πρότυπο αύξησης μέχρι και την ηλικία των 35 ημερών με επακόλουθη πτώση σε αυτήν των 60 ημερών. Η NR1-Ser896 αυξάνεται μέχρι την ηλικία των 14 ημερών όπου και παρουσιάζει μια σταθερή πορεία μέχρι την ηλικία των 60 ημερών. Συμπερασματικά, οι φωσφορυλιώσεις στις διαφορετικές σερίνες της υπομονάδας NR1 του υποδοχέα NMDA παρουσιάζουν διαφορετικό αναπτυξιακό προφίλ και γενικότερα η φωσφορυλίωση αυτής της υπομονάδας φαίνεται ότι ρυθμίζεται αναπτυξιακά στον αμφιβληστροειδή. / The retina is responsible for the light conversion into nerve signals. Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the retina. Its actions are mediated by glutamate ionotropic (NMDA and non NMDA) and metabotropic receptors. The NMDA receptors (NMDARs) are permeable to Ca++ and are unique among glutamate receptors in that they are blocked by Mg++ in a voltage dependent manner. These receptors also seem to play an important role in the development of the nervous system, in synaptic plasticity as well as in glutamate neurotoxicity. In the retina they are expressed in many ganglion and amacrine cells and occasionally in horizontal and glial cells. Functional NMDARs are heteromers composed of the NR1 NR2 and NR3 subunits. The gene of the NR1 subunit has three exons which undergo alternative splicing to generate theoretically eight NR1 splice variants. Half of them include the exon 21 or C1 in carboxy-terminus domain which can be phosphorylated in the following residues: threonine 879 and serines 890,896 and 897. Protein phosphorylation has been recognized as a major mechanism for the regulation of glutamate receptor function, changing their properties and because of its proposed role in trafficking and targeting of the NMDARs, as well as in clustering NR1 subunits into receptor-rich domains. The aim of the present work is to study the phosphorylated subunit NR1 at the serine residues 896 and 897 of the NMDAR (NR1-Ser896 and NR1-Ser897) during retinal development. Wistar rats at postnatal days 9, 14, 21, 35 and 60 are used for the developmental studies. The protein levels of the phosphorylated NR1 subunit were evaluated in Western blots. NR1-Ser897 increased gradually with a peak value observed at postnatal day 35, followed by a decrease at P60. NR1-Ser 896 was also increased to its peak level at the age of 14 and its levels sustained until the age of 60.These data reveal that the developmental profiles of the phoshorylated NR1 subunits at the serine residues 896 and 897 are different, and that the phosphorylation of the NR1 subunit is, in general, subject to regulation during development of the retina

Η πλαστικότητα - η ικανότητα του εγκεφάλου να αναδιοργανώνει τις συνδέσεις του δομικά και λειτουργικά σε απάντηση μεταβολών της αισθητικής εμπειρίας - είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των νευρικών κυκλωμάτων και την δυνατότητα προσαρμογής του νευρικού συστήματος στο περιβάλλον. Το οπτικό σύστημα έχει για χρόνια αποτελέσει το έδαφος των περισσότερων μελετών της εξαρτώμενης από την εμπειρία πλαστικότητας και αυτό χάριν του εύκολου χειρισμού της οπτικής εμπειρίας καθώς και των συνεπειών αυτής, που δύνανται να μελετηθούν σε ανατομικό και μοριακό επίπεδο αλλά και σε επίπεδο φυσιολογίας. Σε ζώα που μεγάλωσαν στο σκοτάδι από την γέννηση, οι φλοιϊκοί νευρώνες εμφανίζουν ιδιότητες ανώριμου οπτικού συστήματος όπως μεγαλύτερα υποδεκτικά πεδία, μειωμένη ικανότητα προσανατολισμού και κατεύθυνσης και μειωμένη οπτική οξύτητα, όπως αυτών που παρατηρείται κατά την στιγμή του ανοίγματος των οφθαλμών. Η πιο κλασική μορφή πλαστικότητας που χρησιμοποιήθηκε σαν μοντέλο για την κατανόηση του τρόπου με τον οποίο η δραστηριότητα συμμετέχει στην δημιουργία των νευρικών κυκλωμάτων είναι αυτή της οφθαλμικής επικράτησης (Hubel and Wiesel, 1963). Παρά το γεγονός ότι το οπτικό σύστημα αποτελεί για πολλά χρόνια ένα από τα καλύτερα μοντέλα για την μελέτη του φαινομένου της πλαστικότητας, εντούτοις οι περισσότερες εργασίες αναφέρονται κυρίως στον οπτικό φλοιό, στο έξω γονατώδες σώμα και στο άνω διδύμιο. Λιγότερες μελέτες αναφέρονται στον αμφιβληστροειδή όπου από τα πειράματα των Chalupa et al (1993) αλλά και Tian et al (2003) φαίνεται ότι η πλαστικότητα ίσως δεν είναι προνόμιο μόνο του οπτικού φλοιού. Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι τόσο φαρμακολογικοί παράγοντες όσο και η οπτική αποστέρηση δύνανται να οδηγήσουν σε αναδιοργάνωση της φυσιολογικής δομής του ιστού του αμφιβληστροειδούς. Το γλουταμινικό οξύ είναι ο κύριος διεγερτικός νευροδιαβιβαστής στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Ένας από τους υποδοχείς μέσω των οποίων ασκεί τη δράση του είναι οι υποδοχείς του Ν-μέθυλο-D-ασπαρτικού οξέος (NMDA) οι οποίοι έχουν σημαντικό ρόλο στην πλαστικότητα λόγω της διττής ιδιότητας του να είναι ιοντο-εξαρτώμενοι και τασο-εξαρτώμενοι υποδοχείς. Πληθώρα ερευνών έχει δείξει ότι οι υποδοχείς αυτοί συμμετέχουν στους κυτταρικούς μηχανισμούς για την πλαστικότητα των νευρωνικών κυκλωμάτων όπως LTP (μακρόχρονη ενδυνάμωση) και LTD (μακρόχρονη καταστολή). Μελέτες είτε με φαρμακολογικό αποκλεισμό είτε με γενετική τροποποίηση των υποδοχέων NMDA έχουν δείξει την εξάρτηση της πλαστικότητας των κυκλωμάτων του οπτικού συστήματος από τους υποδοχείς NMDA. Γνωρίζουμε ότι μεταφραστικές και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, καθώς και ρύθμιση της διακίνησης των υποδοχέων NMDA παίζουν ενεργό ρόλο στον μηχανισμό πλαστικότητας της γλουταμινεργικής σύναψης. Ένας από τους βασικούς μηχανισμούς ρύθμισης των υποδοχέων NMDA είναι η φωσφορυλίωση που παίζει ρόλο τόσο στην ενδοκυττάρια διακίνηση του υποδοχέα όσο και στις ιδιότητες του διαύλου του υποδοχέα μεταβάλλοντας κατά αυτόν τον τρόπο την συναπτική ισχύ και εν τέλει συμμετέχοντας σε διάφορες μορφές συναπτικής πλαστικότητας. Με βάση τα παραπάνω, σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνήσει τη συμβολή του γλουταμινεργικού υποδοχέα NMDA στην πλαστικότητα του αναπτυσσόμενου οπτικού συστήματος. Η παρούσα διατριβή μελετά την επίδραση της οπτικής εμπειρίας στην ρύθμιση των υπομονάδων του υποδοχέα NMDA στον αμφιβληστροειδή και τον οπτικό φλοιό επίμυων. Συγκεκριμένα, πρώτος στόχος της εργασίας είναι να μελετήσουμε την μεταβολή των επιπέδων έκφρασης των υπομονάδων NR2A και NR2B του υποδοχέα NMDA κατά την ανάπτυξη των επίμυων στο σκοτάδι (οπτική αποστέρηση) στον αμφιβληστροειδή. Δεύτερος στόχος να μελετήσουμε την επίδραση του οπτικής αποστέρησης στην φωσφορυλίωση της υπομονάδας ΝR2B στον αμφιβληστροειδή και στον οπτικό φλοιό. Τρίτος στόχος είναι να μελετήσουμε τα επίπεδα έκφρασης και φωσφορυλίωσης των υπομονάδων του υποδοχέα NMDA μετά από έκθεση στο φως των επίμυων που μεγάλωσαν στο σκοτάδι με σκοπό να εξετάσουμε εάν η ρύθμιση τους από την οπτική εμπειρία είναι αμφίδρομη. / Experimental manipulation of experience during development can have profound effects on the functioning of the resulting circuits. N-methyl-d-aspartate glutamate receptor (NMDAR) activity is required for the establishment and refinement of neural circuits during development. In the present study, the authors addressed the issue of experience-dependent regulation of NMDARs by examining the effects of visual experience and deprivation on subunit composition and subunit phosphorylation of NMDAR in the retina and visual cortex. Methods. Total homogenates were prepared from retinas and visual cortices of 30-day-old (P30) Wistar rats, raised either in a normal 12-hour light/12-hour dark cycle (normal-reared [NR]) or in complete darkness from birth (dark-reared [DR]). Some of the DR animals were exposed to light for 6 hours at P30 (DR+6h). Immunoblotting was performed for the NMDAR subunits, NR2A and NR2B, and for the phosphorylated NR2B subunit protein at serine 1303 (pNR2B-Ser1303). Results. Dark rearing for 1 month decreased the NR2A/NR2B ratio and increased the level of phosphorylation of NR2B subunit at Ser1303 in the retina and visual cortex. Light exposure at P30 reversed the effects of visual deprivation on NMDAR composition and NR2B phosphorylation in both regions. Conclusions. These results indicated that NMDAR subunit composition and NR2B phosphorylation at Ser1303 is regulated bidirectionally by visual experience and deprivation in rat retina and visual cortex.

Στόχος: Ο υποδοχέας του γλουταμινικού οξέος ΝMDA (N-methyl-D-aspartate), αποτελεί μόριο-κλειδί που διαμεσολαβεί πολλούς τύπους συναπτικής πλαστικότητας στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Στο οπτικό σύστημα η πλαστικότητα ξεκινά στο επίπεδο του αμφιβληστοειδούς χιτώνα. Κατά την ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς οι υποδοχείς NMDA συμμετέχουν σε φαινόμενα πλαστικότητας εξαρτώμενα από την εμπειρία όπως ο λειτουργικός διαχωρισμός των ON και OFF μονοπατιών. Η ανάπτυξη και η οπτική αποστέρηση επηρεάζουν επίσης τις ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες των υποδοχέων NMDA στον αμφιβληστροειδή του επίμυος καθώς και την έκφραση των υπομονάδων του NR1 και NR2. Η βασική υπομονάδα NR1 υφίσταται εναλλακτικό μάτισμα με αποτέλεσμα να εμφανίζεται σε οκτώ διαφορετικές ισομορφές που προσδίδουν μοριακή ποικιλότητα στον υποδοχέα. Το ερώτημα που ετέθη ήταν εάν η έκφραση των ισομορφών της υπομονάδας NR1 ρυθμίζεται κατά την ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς χιτώνα του επίμυος και εάν μεταβάλλεται από την οπτική εμπειρία. Μέθοδος: Χρησιμοποιήθηκαν αμφιβληστροειδείς επίμυων (Wistar) που μεγάλωσαν είτε σε φυσιολογικό ημερήσιο κύκλο 12 ώρες φως/12 ώρες σκοτάδι [normal-reared (NR)], είτε σε διαρκές σκοτάδι [dark-reared (DR)] από την 9η έως την 60η ημέρα μετά τη γέννηση. Η μελέτη της έκφρασης των ισομορφών του αμινοτελικού (NR1a, NR1b) και του καρβοξυτελικού (NR1-1, NR1-2, NR1-3, NR1-4) άκρου της υπομονάδας NR1 έγινε με τη μέθοδο της real-time PCR. Αποτελέσματα: Το αναπτυξιακό προφίλ όλων των ισομορφών εμφάνισε διαφορετική αύξηση κατά τη διάρκεια της δεύτερης και τρίτης εβδομάδας, με μέγιστη έκφραση στο τέλος της τρίτης εβδομάδας. Μεταξύ των ισομορφών του αμινοτελικού άκρου, η NR1b εκφραζόταν σταθερά σε υψηλότερα επίπεδα σε σχέση με την NR1a, ενώ μεταξύ των ισομορφών του καρβοξυτελικού άκρου, η NR1-2 εκφραζόταν σε υψηλότερα επίπεδα από την NR1-4, ενώ τόσο η NR1-1 όσο και η NR1-3 εκφράζονταν σε χαμηλά επίπεδα. Η ανάπτυξη στο σκοτάδι μείωσε την έκφραση όλων των ισομορφών σε πολλά αναπτυξιακά στάδια και στο ενήλικο ζώο. Σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ ηλικίας και οπτικής εμπειρίας προέκυψε για τις ισομορφές NR1a, NR1-2 και NR1-4. Συμπεράσματα: Η έκφραση όλων των ισομορφών της υπομονάδας NR1 μεταβάλλεται κατά την ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς του επίμυος, ενώ ορισμένες (NR1a, NR1-2 and NR1-4) ρυθμίζονται τόσο από την ηλικία όσο και από την οπτική εμπειρία. Τέτοιες μεταβολές μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο σε φαινόμενα πλαστικότητας που λαμβάνουν χώρα στον αμφιβληστροειδή χιτώνα. / Purpose: The N-methyl-D-aspartate (NMDA) type of glutamate ionotropic receptor is a key molecule mediating plasticity related processes in the central nervous system. Visual system plasticity begins in the retina. During postnatal retinal development NMDA receptor has been shown to be involved in experience dependent plasticity such as the functional segregation of ON and OFF pathways. Development and visual deprivation have been found to affect the kinetics of NMDA receptor in rat retina and the expression of its main subunits NR1 and NR2. The NR1 fundamental subunit of NMDA receptor exists in eight distinct splice isoforms. Knowing that alternative splicing of the NR1 subunit offers a further molecular diversity to the receptor, we have addressed the question of whether the alternative splicing of NR1 subunit of the NMDA receptor is regulated during postnatal retinal development and whether this regulation is altered by visual experience. Methods: Retinas were dissected from eyes of Wistar rats raised either in normal 12-hour light/12-hour dark cycle [normal-reared (NR)], or in complete darkness [dark-reared (DR)] at postnatal days 9 to 60. Real-time PCR was performed in order to assess the mRNA expression of NR1 isoforms using oligonucleotide primers specific for N- terminal (NR1a, NR1b) and C-terminal splice variants (NR1-1, NR1-2, NR1-3, NR1-4). Results: The developmental profiles of mRNA expression levels of both N- and C-terminal NR1 isoforms showed differential increases during the second and third postnatal weeks, while their expression peaked at the end of the third week. Among N-terminal isoforms NR1b was constantly expressed at higher levels compared to NR1a and among the C-terminal isoforms, NR1-2 was expressed at higher levels than NR1-4, while both NR1-1 and NR1-3 were expressed at low levels. Dark-rearing led to reductions in both N- and C-terminal NR1 variants in several developmental ages and in adult retina. A significant age and experience interaction was observed at NR1a N-terminal isoform, and at the most abundant C-terminal isoforms NR1-2 and NR1-4. Conclusions: Our results have demonstrated that all NR1 splice isoforms are developmentally regulated in rat retina and some of them (NR1a, NR1-2 and NR1-4) are also bidirectionally regulated by age and visual experience. Such changes may play an important role in the plastic and activity-dependent events taking place in retina.

Σκοπός της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας είναι η ανάπτυξη συγκεκριμένης μεθοδολογίας και αλγορίθμων ψηφιακής επεξεργασίας εικόνων για την αυτόματη εκτίμηση των διαμέτρων αγγείων σε οφθαλμολογικές εικόνες. Η συγκεκριμένη μέτρηση της διαμέτρου των αγγείων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην έγκαιρη διάγνωση παθήσεων καθώς έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει συσχετισμός μεταξύ των μεταβολών των τιμών των εν λόγω διαμέτρων και της εμφάνισης αλλοιώσεων στον αμφιβληστροειδή. Στα πλαίσια της εργασίας, υλοποιήθηκαν δύο μεθοδολογίες για τον υπολογισμό των διαμέτρων αγγείων οφθαλμολογικών εικόνων, οι οποίες συλλέγονται με χρήση κάμερας πυθμένα (fundus camera). Η πρώτη μεθοδολογία στηρίζεται στην εύρεση των σημείων που αποτελούν τους κεντρικούς άξονες των υπό εξέταση αγγείων με χρήση διαφορικού λογισμού. Ακολούθως, σε κάθε σημείο που ανήκει σε κεντρικό άξονα αγγείου, υπολογίζονται οι παράμετροι μιας συνάρτησης. Η εν λόγω συνάρτηση περιγράφει βέλτιστα τα επίπεδα φωτεινότητας της εικόνας κατά μήκος του ευθύγραμμου τμήματος που διέρχεται από το σημείο και είναι κάθετο στο αγγείο. H εύρεση των παραμέτρων της συνάρτησης πραγματοποιείται με χρήση τεχνικών βελτιστοποίησης. Το τελικό βήμα της μεθοδολογίας είναι η εκτίμηση της διαμέτρου των αγγείων από τις τιμές των παραμέτρων που έχουν υπολογιστεί. Η δεύτερη μεθοδολογία στηρίζεται στον αλγόριθμο που προτείνει ο P.H. Gregson. Αρχικά, πραγματοποιείται κατάτμηση της εικόνας με κατωφλίωση και εφαρμόζονται μορφολογικοί τελεστές συστολής και διαστολής στην εικόνα. Στη συνέχεια, εφαρμόζεται ο αλγόριθμος λέπτυνσης (thinning algorithm) με σκοπό την εύρεση των κεντρικών αξόνων των αγγείων και τέλος εκτιμάται η διάμετρος σε κάθε σημείο του κεντρικού άξονα με χρήση των επιπέδων του γκρίζου των εικονοστοιχείων που κείνται στην ευθεία που είναι κάθετη στο αγγείο σε κάθε σημείο του. / The scope of this Thesis is the development of a methodology and advance image processing techniques in order to automatically estimate vessel diameters in ophthalmological images. Motivation for the thesis is the fact that the measurement of vessel diameter plays significant role in the seasonable diagnosis of vascular disorders, as it is believed to be a relation between the variation in diameters and the detection of retinal disorders. In this thesis, two methodologies are developed in order to be applied in ophthalmological images that are collected by using a fundus camera. The first methodology is based on the detection of the pixels that constitute the centerlines of vessels, by using differential calculus. Specifically, at each pixel that belongs to a centerline of vessel, the parameters of a specific function are calculated. This function describes as accurately as possible the intensity levels along the segment that passes through the specific pixel and is perpendicular to the vessel. The parameters of this function are estimated using optimization techniques. The final step of the methodology is the assessment of the diameters of vessels using the values of the parameters. The second methodology is based on the algorithm that P.H.Gregson has proposed. At first, the vessels are detected by tresholding and a morphological closing algorithm is applied. Then, a thinning algorithm is used in order to detect the pixels that constitute the centerlines of the vessels and ultimately the diameter at each pixel of the centerlines is assessed using the gray levels of the pixels that constitute the segment that is perpendicular to the vessel at each specific pixel.