Το γένος Pseudomonas ανήκει στην οικογένεια Pseudomonadaceae και περιλαμβάνει πολλά είδη. Το συχνότερο είδος ψευδομονάδας που προκαλεί νόσο στον άνθρωπο είναι η Pseudomonas aeruginosa. Η P.aeruginosa είναι ένα Gram αρνητικό, αυστηρά αερόβιο βακτηρίδιο, το οποίο αναπτύσσεται στους 37-42οC και καλλιεργείται σχετικά εύκολα σε κοινά θρεπτικά υλικά. Η P. aeruginosa έχει χαρακτηριστεί ως ένα από τα σημαντικότερα και σοβαρότερα ευκαιριακά παθογόνα βακτηρία, τα οποία είναι υπεύθυνα για νοσοκομειακές λοιμώξεις σε διάφορες ειδικές ομάδες ασθενών όπως ανοσοκατασταλμένα άτομα, άτομα με κυστική ίνωση (cystic fibrosis), ασθενείς με νεοπλασίες, κ.α. Οι λοιμώξεις που προκαλεί η P. aeruginosa χαρακτηρίζονται σοβαρές και επικίνδυνες αφενός μεν γιατί προκαλεί νόσο σε άτομα ήδη επιβεβαρυμένα από άλλες καταστάσεις, αφετέρου δε γιατί εμφανίζει ανθεκτικότητα στα περισσότερα αντιβιοτικά. Ο τρόπος με τον οποίο η P. aeruginosa ασκεί την παθογόνο δράση της είναι πολύπλοκος και δεν έχει διευκρινισθεί επακριβώς. Διάφοροι κυτταρικοί παράγοντες αλλά και εξωκυττάρια προϊόντα θεωρούνται υπεύθυνα για την έκφραση της παθογόνου δράσης του μικροοργανισμού. Οι πιο σημαντικοί κυτταρικοί παράγοντες είναι: ο λιποπολυσακχαρίτης, οι φίμπριες, οι πρωτεΐνες της εξωκυττάριας μεμβράνης, ο εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης (Slime), καθώς επίσης και ο βλεννώδης πολυσακχαρίτης (αλγινικό οξύ) που σχετίζεται με τα βλεννώδη στελέχη. Επίσης διάφορα εξωκυττάρια προϊόντα-παράγοντες τα οποία θεωρούνται υπεύθυνα για τη λοιμογόνο δράση του βακτηρίου, είναι διάφορα ένζυμα και κυρίως το Εξωένζυμο-S και η Εξωτοξίνη-A. Στους μηχανισμούς άμυνας του ξενιστή έναντι της P. aeruginosa τα μακροφάγα που προσελκύονται στην εστία της λοίμωξης παίζουν το σπουδαιότερο ρόλο. Οι κυτταροκίνες που παράγονται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα καθορίζουν την έκταση της βλάβης και την έκβαση της λοίμωξης. Σε πειραματικά μοντέλα σήψης από P. aeruginosa η παραγωγή του παράγοντα νεκρώσεως όγκου (TNF-α) σε μικρά ποσά έχει συσχετισθεί με προστασία σε σοβαρές λοιμώξεις, ενώ η υπερπαραγωγή του οδηγεί σε σηπτικό σοκ. Η ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α αντικατοπτρίζει τη ρύθμιση της ενεργοποίησης του μακροφάγου. Διαφορετικοί υποδοχείς επιφανείας όπως οι TLR’s, συμβάλουν στην αναγνώριση του μικροβίου και την επακόλουθη ενεργοποίηση του μακροφάγου. Τα ενδοκυττάρια γεγονότα που σχετίζονται με τη μετάδοση του σήματος ενεργοποίησης στα μακροφάγα δεν είναι απόλυτα αποσαφηνισμένα. Πρώιμα συμβάντα ενεργοποίησης των μακροφαγων που ρυθμίζουν την παραγωγή του TNF-α, είναι η ενεργοποίηση των MAP κινασών. Η οικογένεια των MAPK’s περιλαμβάνει 3 κινάσες: την p38, την Erk1,2 και την JNK, που έχουν ταυτοποιηθεί ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι σε πειραματικά μοντέλα σήψης. Η διαδοχική φωσφορυλίωση υποστρωμάτων ενεργοποιεί διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες, χαρακτηριστικότεροι των οποίων είναι ο NF-κΒ και ο AP-1, ο οποίοι συμμετέχουν στη μεταγραφή των γονιδίων των κυτταροκινών που εκφράζονται στη διάρκεια της σηπτικής καταπληξίας. Σημαντικότερη από αυτές είναι ο TNF-α. Η ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α είναι αντιπροσωπευτικός στόχος μελέτης των μηχανισμών που διέπουν την ενεργοποίηση των μακροφάγων. Αυτή η ρύθμιση γίνεται τόσο στο επίπεδο μεταγραφής του γονιδίου όσο και στο μετά-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο. Συνεργασία μεταξύ των πρωτεϊνών μεταγραφής και αυτών που δεσμεύονται στη 3-UTR περιοχή του mRNA του TNF-α συμβάλουν στην εκλεκτική ρύθμιση της παραγωγής του από τα μακροφάγα. Οι μηχανισμοί που ενέχονται στην ενεργοποίηση των μακροφάγων από την P. aeruginosa δεν έχουν πλήρως μελετηθεί. Ταυτοποίηση των συγκεκριμένων μορίων-στόχων στη μετάδοση του σήματος ενεργοποίησης στα μακροφάγα συμβάλει στην κατανόηση των μηχανισμών ελέγχου της σηπτικής καταπληξίας. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η αποσαφήνιση της δράσης της P. aeruginosa στα διάφορα στάδια ενεργοποίησης των μακροφάγων όπως: α) το επίπεδο της φωσφορυλίωσης-ενεργοποίησης διαφόρων πρωτεϊνικών κινασών (π.χ. MAPK’s), β) την ενεργοποίηση-δράση μεταγραφικών παραγόντων με αντιπροσωπευτικότερους τον NF-κΒ και AP-1, και τέλος, γ) την διερεύνηση των υποδοχέων επιφανείας όπως οι Toll-like υποδοχείς στη μετάδοση του σήματος ενεργοποίησης, αλλά και σύνδεση αυτών με την ενεργοποίηση των MAPK’s. Σε επίπεδο παραγωγής TNF-α πρωτεΐνης και ενεργοποίησης μεταγραφικών παραγόντων, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι: α) Το Slime-GLP είναι ισχυρότερος διεγέρτης από τον LPS P. aeruginosa για την παραγωγή TNF-α σε υπερκείμενα μονοκυτταρικών καλλιεργειών. β) Αυτή η διαφορετική ρύθμιση της παραγωγής πρωτεϊνικού TNF-α, αντικατοπτρίζεται και σε επίπεδο ενεργοποίησης μεταγραφικών παραγόντων. Συγκεκριμένα, το Slime-GLP μπορεί και επάγει περισσότερο την ενεργοποίηση του NF-κΒ από ότι ο LPS της P. aeruginosa και αυτή η ενεργοποίηση είναι σχεδόν ίση με αυτή που προκαλεί ολόκληρο το ζωντανό κύτταρο της P. aeruginosa. γ) Ο NF-κΒ που ενεργοποιείται με Slime-GLP αποτελείται από το ετεροδιμερές p50/p65. δ) Ο μεταγραφικός παράγοντας AP-1 ενεργοποιείται σχετικά πιο καθυστερημένα από ότι ο NF-κΒ, αλλά και σε αυτή την περίπτωση το Slime-GLP φαίνεται να είναι ισχυρότερος διεγέρτης από τον LPS P. aeruginosa. Σε επίπεδο ενεργοποίησης των MAP κινασών τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η διαφορετική ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α, σε επίπεδο πρωτεΐνης, μετά από διέγερση με LPS ή Slime-GLP αντικατοπτρίζεται και σε επίπεδο ενεργοποίησης των διαφορετικών MAP κινασών. Συγκεκριμένα το Slime-GLP ενεργοποιεί τις p38 και Εrk1,2 σε μεγαλύτερο βαθμό από ότι ο LPS της P. aeruginosa. Η ενεργοποίηση των p38 και Erk1,2 που αποτυπώνεται με αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσής τους, αντιστοιχεί και με αύξηση της ενεργότητάς τους. Η χρήση ειδικών αναστολέων έναντι των p38 (SB203580) και Erk1,2 (PD98059) μπορεί και αναστέλλει σημαντικά την παραγωγή του πρωτεϊνικού TNF-α κατά 80-95% και 60-80% αντίστοιχα. Το Slime- GLP διαφέρει από τον ομόλογο LPS της P. aeruginosa μόνο στο βαθμό της ενεργοποίησης των MAP κινασών, δηλαδή μπορεί και επάγει ισχυρότερα τις MAP κινάσες από ότι ο ομόλογος LPS. Η συμμετοχή των Toll-like υποδοχέων στη μετάδοση του σήματος αυτής της διαφορετικής ενεργοποίησης των MAP κινασών από τους LPS και Slime-GLP της P. aeruginosa, μελετήθηκε με τη χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων (anti-TLR2) και (anti-TLR4). Συγκεκριμένα, η ενεργοποίηση της p38, μετά από διέγερση με Slime-GLP, μειώνεται σημαντικά παρουσία του anti-TLR2, ενώ παρουσία του anti-TLR4 η μείωση της ενεργοποίησης της p38 δεν είναι τόσο προφανής. Αντίθετα, μείωση της ενεργοποίησης της p38, όταν αυτή επάγεται από τον LPS της P. aeruginosa, παρατηρούμε μόνο στην περίπτωση που αδρανοποιούμε τον TLR4. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έναν μοριακό μηχανισμό με τον οποίο ο LPS και ο εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης Slime-GLP της P. aeruginosa, χρησιμοποιούν διαφορετικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των μακροφάγων για την διαφορετική ενεργοποίηση των MAP κινασών και τη ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α στα ανθρώπινα μακροφάγα κύτταρα / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic Gram-negative pathogen that is associated with severe infections of immunocompromized or critically ill patients. P. aeruginosa infections both chronic and acute, are associated with high incidence of morbidity and mortality. Many gene products of the bacterium, involving lipolysaccharide (LPS), extracellular slime glycolipoprotein (Slime-GLP), exotoxin- A, and exoenzyme-S, contribute to the pathophysiology of P. aeruginosa infection, by stimulating different cell types of the immune system. Macrophages play a key role in execution of the innate and adaptive arms of the immune response to Pseudomonas infection. Activated macrophages exert their effects by producing several types of cytokines and/or other mediators. TNF-α an early proinflammatory cytokine produced by activated macrophages is probably the most important mediator of systemic toxicity. TNF-α production primarily by cells of monocytic lineage is a crucial event in the course of these infections. During in vivo infections with P. aeruginosa, both LPS and Slime-GLP produced by mucoid and non-mucoid strains are being released. Extracellular Slime-GLP causes systemic toxicity when administered in vivo. Signal transduction pathways and early activation intracellular events that mediate induction of TNF-α by human monocytes have been the subject of great interest by many investigators. A key component of many intracellular signaling pathways are the mitogen-activated protein (MAP) kinases. This superfamily includes the extracellular signal response kinases (ERK’s), c-jun N-terminal kinases and the p38 family of kinases. A wide range of bacterial compounds including LPS of Gram-negative bacteria, LTA and peptidoglycan of Gram-positive bacteria and Treponema components differentially activate the MAP kinase family members. Recently it has been shown that cell surface Toll-like receptor (TLR) proteins participate in the ability of the host to discriminate different LPS structural features, and/or other components of the bacterial cell. Although it is now clear that the TLR family of membrane proteins is linked to the activation of MAP kinase family members by different microbial components the subsequent pathways that lead to inflammatory mediator production are still being elucidated. The aim of our study was to delineate the molecular mechanisms leading to differential TNF-α induction by P. aeruginosa LPS and Slime-GLP, specifically theIdentification of specific molecular targets of P. aeruginosa Slime-GLP in human monocytes-macrophages may have important therapeutic implications for P. aeruginosa mediated systemic toxicity.