Τα τελευταία χρόνια σημαντική ερευνητική δραστηριότητα έχει επικεντρωθεί στην παραγωγή βιοδιασπώμενων βιοπολυμερών, ικανών να αντικαταστήσουν τα συμβατικά πλαστικά, από ανανεώσιμες πηγές. Μεταξύ αυτών, ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει προκύψει στο πεδίο παραγωγής πολυυδροξυαλκανοϊκών οξέων (PolyHydroxyAlkanoates, ΡΗΑs) από διαφορετικούς τύπους αποβλήτων, χρησιμοποιώντας είτε καθαρές είτε μικτές μικροβιακές καλλιέργειες. Προκειμένου να γίνει επιλογή μικτών καλλιεργειών απαιτείται ο πρότερος εγκλιματισμός και εμπλουτισμός τους με τη χρήση κάποιου είδους περιορισμού των θρεπτικών συστατικών σε συστήματα περιοδικής λειτουργίας, ενώ είναι επίσης σύνηθες να περιλαμβάνεται ένα πρώτο βήμα οξίνισης των αποβλήτων πριν από την αξιοποίησή τους για παραγωγή των βιοπολυμερών. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, αναπτύχθηκε μια μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια από εδαφόβιους μικροοργανισμούς, χρησιμοποιώντας αντιδραστήρα άντλησης-πλήρωσης (Draw-Fill) σε συνθήκες περιορισμού αζώτου. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα των πτητικών λιπαρών οξέων οξικό, βουτυρικό και προπιονικό σε αναλογία 1:1:1. Η εγκλιματισμένη και εμπλουτισμένη μικροβιακή καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τον εμβολιασμό καλλιεργειών σε αντιδραστήρα διαδοχικών παρτίδων (SBR) αλλά και άντλησης-πλήρωσης, προκειμένου να διερευνηθεί η δυνατότητα παραγωγής PHAs υπό περιορισμό βασικού θρεπτικού (οργανικό άζωτο) αλλά και υπό διαφορετικής πηγής άνθρακα, όπως: α) μίγματα οξέων, β) καθαρή γλυκερόλη, γ) καθαρή 1,3 προπανοδιόλη δ) μίγματα γλυκερόλης και οξέων και ε) οξινισμένη βιομηχανική γλυκερόλη. Η οξινισμένη γλυκερόλη είναι ουσιαστικά το ζυμωτικό μίγμα που παράγεται κατά την αναερόβια ζύμωση της γλυκερόλης και αποτελείται από υπολειμματική γλυκερόλη που δεν έχει υποστεί ζύμωση, 1,3 προπανοδιόλη, πτητικά λιπαρά οξέα και αιθανόλη. Τα παραγόμενα PHAs ανακτήθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις υπό την μορφή λεπτού υμενίου με τη χρήση χλωροφορμίου και έγινε υπολογισμός των αποδόσεων. Πραγματοποιήθηκε περαιτέρω ανάλυσή των ιδιοτήτων των PHAs ως προς τη δομή, τις θερμοδυναμικές και φυσικοχημικές τους ιδιότητες καθώς και ως προς τις μηχανικές τους σε επιλεγμένες περιπτώσεις. Σε όλες τις περιπτώσεις εκτός αυτής της καθαρής γλυκερόλης, τα προϊόντα ήταν συμπολυμερή, αποτελούμενα κατά κύριο λόγο από PHB, PHV και PHHx, με μοριακά βάρη μεταξύ 76,7.104–181,6.104 Da. Οι υψηλότερες αποδόσεις, από την άποψη της ικανότητας συσσώρευσης, παρατηρήθηκαν για τις τροφοδοσίες οξέων και γλυκερόλης που έχει υποστεί ζύμωση, φθάνοντας τα 0,6±0,04g PHA/g TSS και 0,41±0,04g PHA/g TSS αντίστοιχα, ενώ η υψηλότερη παραγωγικότητα επιτεύχθηκε στην περίπτωση μικτής τροφοδοσίας (οξέα/γλυκερόλη), φθάνοντας σε 0,39±0,01g PHA/g COD που καταναλώνεται. / In recent years a lot of research has been focused on the production of biodegradable bioplastics from renewable resources, in order to replace the conventional plastics. Among them great interest has been shown on the production of Polyhydroxyalkanoates (PHAs) from different types of wastes, using either pure or mixed bacterial cultures. The latter usually requires that microbial mixed cultures have been previously acclimated and enriched using some kind of nutrient limitation under periodic feeding, whereas it is also common to include a first step of acidification of the waste prior to PHAs production. In the present study, a mixed microbial culture derived from soil was developed, using nitrogen limitation in a draw-and-fill reactor (DFR). The carbon source was a mixture of acetate, butyrate and propionate at ratio 1:1:1. The acclimated culture was then used as inoculums in Sequencing Batch Reactors (SBR) and DFRs in order to produce PHAs under nutrient limitation and different kinds of carbon sources such as a) acids mixture, b) pure glycerol, c) pure 1.3 propanediol d) mixture of glycerol and acids and e) anaerobically fermented waste glycerol (acidified industrial glycerol). The latter consisted from residual glycerol, acids, 1.3 propanediol and ethanol. The produced bioplastics were recovered in all cases in the form of films using chloroform as extractant, and PHAs yields were estimated. PHAs films were further analyzed in terms of their chemical structure, thermal properties and in selected cases, their mechanical properties. It was shown that in all cases, but for pure glycerol, co-polymers consisting mainly from PHB, PHV and PHH were obtained, with molecular weighs ranging from 76.7.104–181.6.104Da. The highest yields in terms of accumulation capacity were observed for acids and fermented glycerol as carbon source reached 0,6±0,04g PHA/g TSS and 0.41±0.04g PHA/g TSS, whereas the highest productivity was achieved for mixed acids/glycerol as carbon source reached 0.39±0.01g PHA/g COD consumed.

Η παρούσα διατριβή εξειδίκευσης αποτελεί το προοίμιο μιας μακρόπνοης εμπλοκής του εργαστηρίου υλοποίησής της στη μελέτη ενδεχόμενης μετανάστευσης ουσιών που χρησιμοποιούνται ως ενισχυτικά φραγής ή/και ως χημικοί αισθητήρες σε βιοπολυμερικές συσκευασίες τροφίμων και αποδέσμευσής τους σε προσομοιωτές τροφίμων. Στο πλαίσιο αυτό, η εργασία αυτή αποτελεί μια προσπάθεια ανάδειξης της μεθόδου επιφανειακής ενίσχυσης της σκέδασης Raman (Surafce Enhanced Raman Scattering) ως κατάλληλης για τον ποσοτικό προσδιορισμό μικρού μοριακού βάρους ενώσεων που ενδεχομένως αποδεσμεύονται σε υδατικά διαλύματα ή/και συγκεκριμένους προσομοιωτές τροφίμων. Η μελέτη εστιάστηκε στην ελεγχόμενη αποδέσμευση φαρμακευτικών ουσιών από μια βιοπολυμερική μήτρα κυρίως κατά το πρώιμο στάδιο της μελέτης και τις παραμέτρους που επηρεάζουν το φαινόμενο αυτό. Βασικός στόχος της μελέτης ήταν η κατά το δυνατό μείωση του ορίου ανίχνευσης με SERS της αποδεσμευόμενης ουσίας με την εμβάπτιση της βιοπολυμερικής μήτρας που την εμπεριέχει σε πρότυπα υδατικά διαλύματα. Πραγματοποιήθηκε μια διεξοδική μελέτη των υποστρωμάτων που χρησιμοποιούνται στο SERS και συγκεκριμένα του νανοκολλοειδούς αργύρου (Ag). Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα τα οποία έδειξαν την εξάρτηση της έντασης SERS από τη συσσωμάτωση των υποστρωμάτων Ag συναρτήσει του χρόνου και του παράγοντα συσσωμάτωσης, NaCl. Η εφαρμογή του SERS σε μελέτες ουσιών εξαιρετικά χαμηλών συγκεντρώσεων αναδεικνύεται ως ένα πολύ ενδιαφέρον πεδίο έρευνας. Επίσης, ως πρότυπο πείραμα, παρουσιάζεται μεθοδολογία μελέτης με την τεχνική SERS της αποδέσμευσης του αντικαρκινικού φαρμάκου Μitoxantrone (ΜΤΧ) από εμπορικά ράμματα Maxon. Για το σκοπό αυτό, παρασκευάστηκαν πολυμερικά υμένια με εγκλωβισμένη τη δραστική ουσία και η μελέτη της αποδέσμευσης της σε νερό και PBS (phosphate buffered saline) πραγματοποιήθηκε με SERS και UV-Vis, αντίστοιχα. Η φασματοσκοπία UV-Vis χρησιμοποιήθηκε συμπληρωματικά. Στηριζόμενοι στη μεθοδολογία που αναπτύξαμε εξάγαμε ποσοτικά αποτελέσματα από τρία διαφορετικά εργαστηριακά δείγματα, τα οποία προήλθαν από ανάμιξη εμπορικών ραμμάτων Maxon με 1% κ.β. MTX: (α) στην άμορφη φάση έπειτα από ταχεία ψύξη του τήγματος, (β) στην ημικρυσταλλική φάση με σχετικά χαμηλό ποσοστό κρυσταλλικότητας, που λάβαμε έπειτα από ανόπτηση της άμορφης φάσης για περιορισμένο χρόνο στη θερμοκρασία κρυστάλλωσης και (γ) σε μια επίσης ημικρυσταλλική φάση με αρκετά μεγάλο ποσοστό κρυστάλλωσης (όσης και τα εμπορικά ράμματα). Τα αποτελέσματα δείχνουν πως υπάρχει συσχέτιση μεταξύ κρυσταλλικότητας και αποδέσμευσης του φαρμάκου, με τα μικρότερα ποσά αποδέσμευσης στην περίπτωση του άμορφου δείγματος. Αυτό που παρατηρήθηκε στα πρώιμα στάδια της αποδέσμευσης από τις μετρήσεις SERS φαίνεται να επαληθεύεται από αντίστοιχα αποτελέσματα σε μεταγενέστερα στάδια αποδέσμευσης που λάβαμε με εφαρμογή της συμβατικής τεχνικής απορρόφησης ορατού – υπεριώδους (UV-Vis). Ωστόσο, οι ποσοτικές μετρήσεις με τη χρήση του SERS σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις έδειξαν μεγαλύτερη ανιχνευτική ευαισθησία σε σχέση με αυτές που πραγματοποιήθηκαν με την απορρόφηση UV-Vis. Συμπερασματικά, το SERS δείχνει ικανό στον ποσοτικό προσδιορισμό ενεργών ουσιών που αποδεσμεύονται από βιοσυμβατά πολυμερικά συστήματα μεταφοράς δραστικών ουσιών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. / This thesis of specialization is the precursor of a long-term involvement of the laboratory of Applied Molecular Spectroscopy of FORTH/ICE-HT in the implementation of the study of the migration of substances used as barrier and/or as chemical sensors in biopolymer based food packaging and their release into food simulants. In this context, this work attempts to highlight the method of surface enhanced Raman scattering (SERS) as appropriate for quantifying low molecular weight compounds that may be released in aqueous solutions and/or specific food simulants. The study focused on the controlled release of pharmaceuticals from a biopolymeric matrix mainly during the early stage of the study and the parameters affecting this phenomenon. The main objective of the study was to reduce SERS detection limit of the released substance by emerging the substance-incorporated biopolymeric matrix in standard aqueous solutions. In this context, we developed methods to maximize SERS enhancement and consequently reduce the limit of detection of an active substance, Mitoxantrone (MTX). This was achieved by a thorough study of the substrates used in SERS, namely nanocolloidal silver (Ag) suspensions. For this purpose, we contacted experiments which show the dependence of the SERS intensity on the aggregation of Ag substrates as a function of both time and the aggregating agent, NaCl. Also, as a standard experiment, present SERS methodology was applied in the study of the release of the anticancer drug Mitoxantrone (MTX) from commercially available sutures, Maxon. For this purpose, polymeric films prepared with the encapsulated active substance were immersed either in water or/and in PBS (phosphate buffered saline) and the release of MTX was probed by both SERS and UV-Vis. Based on the developed methodology we obtained quantitative results from three different laboratory samples produced by mixing commercial Maxon sutures with 1 wt% MTX: (a) an almost completely amorphous mixture produced by quenching from the melt, (b) a semi-crystalline one possessing low crystallinity that was produced by annealing the amorphous sample at the temperature close to the crystallization one and (c) a semi-crystalline one possessing high crystallinity similar to the commercial product. The results indicate a correlation between crystallinity and drug release rate; the more amorphous the sample is the less quantity of the drug is released. SERS was able to probe the active agent at the early state of release; UV-Vis has supported these results at a later state of the release process. In conclusion, SERS may enable low concentration quantitative assessment of controlled release of drugs from biopolymer-based delivery systems.