Το κακόηθες μελάνωμα του δέρματος είναι το αποτέλεσμα της κακοήθους εξαλλαγής των μελανοκυττάρων της επιδερμίδας και χαρακτηρίζεται απο συνεχώς αυξανόμενη επίπτωση και θνησιμότητα παγκοσμίως. Η αξιοσημείωτη δε ανθεκτικότητα που επιδεικνύει το προχωρημένο μεταστατικό μελάνωμα στα χημειοθεραπευτικά σχήματα και στην ακτινοθεραπεία κάνει επιτακτική την ανάγκη για νέους, πιο αποτελεσματικούς θεραπευτικούς παράγοντες. Ένας αυξανόμενος όγκος δεδομένων υποστηρίζει τη παρουσία και ενεργό συμμετοχή καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων (cancer stem cells, CSCs) στην ανάπτυξη και μετάσταση του μελανώματος. Οι μεταγραφικοί παράγοντες EZH2, SOX2 και Oct4 αποτελούν μόρια – κλειδιά στον έλεγχο του ρυθμιστικού δικτύου του stemness των εμβρυϊκών stem κυττάρων (ESCs). Είναι πλέον γνωστό ότι η χρωματίνη στα ESCs περιλαμβάνει περιοχές με «αντιμαχόμενες» τροποποιήσεις ιστονών (bivalent domain), οι οποίες φυσιολογικά σχετίζονται είτε με ενεργή (Η3Κ4me3) ή με ανενεργή κατάσταση της χρωματίνης (H3K27me3), ενώ η απορρύθμιση των επιγενετικών μηχανισμών ελέγχου σε συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους έχει συσχετισθεί με τη καρκινογένεση στον άνθρωπο. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αυτών των bivalent domain φαίνεται να έχουν οι πρωτεΐνες της οικογένειας Polycomb, και ιδιαίτερα ο EZH2 που δρα σαν μεθυλοτρανσφεράση στην επιγενετική τροποποίηση H3K27. Πρόσφατα, μια σειρά από μελέτες έδειξαν ότι CScs στη διηθητική παρυφή του όγκου ενδέχεται να συμμετέχουν ενεργά στη καρκινογένεση. Επιπλέον, η ανακάλυψη ότι η βιολογική διαδικασία της επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετάβασης (EMT) οδηγεί υποπληθυσμούς καρκινικών κυττάρων εντός του όγκου να αποκτήσουν ιδιότητες stem κυττάρων, φαίνεται να αποτελεί τον σύνδεσμο μεταξύ μετάστασης και κατάστασης πολυδυναμίας (stemness). Σύμφωνα λοιπόν με τη θεώρηση αυτή, είναι πιθανό τα CSCs να εντοπίζονται κυρίως στη διηθητική παρυφή ενός όγκου, ενώ επιπλέον οι ιδιότητες stem κυττάρων που έχουν αποκτήσει είναι το αποτέλεσμα κυρίως της ΕΜΤ. Σε αυτό το πλαίσιο, παρουσιάζει επομένως εξαιρετικό ενδιαφέρον η προσεκτική και στοχευμένη εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης παραγόντων που σχετίζονται με τα stem κύτταρα στην διηθητική παρυφή του μελανώματος, και αυτός ήταν ένας από τους στόχους της παρούσας διαδακτορικής διατριβής. Σκοπός. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, Oct4, SOX2 όπως επίσης και την παρουσία των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 (bivalent domain) στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος. Παράλληλα, μελετήθηκε η πιθανότητα αναγνώρισης και στοχοποίησης καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων, με ιδιαίτερη έμφαση στη διηθητική παρυφή του όγκου. Υλικό και μέθοδος. Το ποσοστό κυττάρων με ανοσοθετικότητα για τα αντισώματα έναντι των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, SOX2 και Oct4 όπως επίσης και των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 εκτιμήθηκε σε 89 δείγματα ιστών από 79 ασθενείς με κακόηθες μελάνωμα 250 του δέρματος, εφαρμόζοντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Για την επιλογή των κατάλληλων δειγμάτων έγινε ανασκόπηση των αρχείων του εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών των ετών 2001 έως 2010. Από αυτό το σύνολο των 89 δειγμάτων τα 70 αφορούν πρωτοπαθές μελάνωμα δέρματος, ενώ τα υπόλοιπα 19 προέρχονται από υλικό που εξαιρέθηκε κατά τη χειρουργική εκτομή του μεταστατικού μελανώματος. Επιπλέον 14 δείγματα περιείχαν εκτός από καρκινικά κύτταρα μελανώματος και κύτταρα σπίλων. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) και H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA). Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση (Labeling Index, LI). Η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 19.0). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Πυρηνική χρώση ανιχνεύθηκε για τα αντισώματα έναντι των EZH2, H3K4me2 και H3K27me3, ενώ αντίθετα βρέθηκε πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση για τους παράγοντες SOX2 και Oct4. Παρατηρήθηκε ανομοιογενές προφίλ ανοσοθετικότητας στα κύτταρα μελανώματος με σημαντικά αυξημένο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με θετική ανοσοχρώση H3K4me2 και H3K27me3 στη διηθητική παρυφή του όγκου. Αντίστοιχη τάση για αυξημένη έκφραση έδειξε και ο μεταγραφικός παράγοντας EZH2, χωρίς όμως η διαφορά να είναι στατιστικά σημαντικά, ενώ παρατηρήθηκε και σε ορισμένες μεμονωμένες περιπτώσεις με τον SOX2. Όσον αφορά τον ΕΖΗ2, βρέθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του παράγοντα στα κύτταρα μελανώματος σε σχεση με τα σπιλοκύτταρα (p=0.02). H πυρηνική έκφραση SOX2 ήταν σημαντικά υψηλότερη στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της βασική στιβάδας (p=0.02), όπως επίσης και στα σπιλοκύτταρα συγκριτικά με τα κερατινοκύτταρα της βασικής (p=0.0016) και της υπερβασικής στιβάδας (p=0.027). Η συσχέτιση της πυρηνικής έκφρασης με διάφορες παραμέτρους των ασθενών έδεξε υψηλότερα επίπεδα SOX2 στα πρωτοπαθή σε σχέση με τα μεταστατικά μελανώματα (p=0.045), στα κύτταρα μελανώματος με πάχος όγκου κατά Breslow <1mm (p=0.023), χωρίς εξέλκωση (p=0.009) και με αριθμό μιτώσεων ≤6 μιτ/mm2 (p=0.016). Τα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης Oct4 βρέθηκαν υψηλότερα στα σπιλοκύτταρα σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα (p<0.001) αλλά και με τα κύτταρα μελανώματος (p=0.004). Η μελέτη ωστόσο της κυτταροπλασματικής ανοσοθετικότητας έδειξε σημαντική μείωση των επιπέδων Oct στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της υπερβασικής στιβάδας (p<0.001), όπως επίσης στα μεταστατικά σε σχέση με τα πρωτοπαθή μελανώματα (p=0.025). Αξιοσημείωτο είναι επίσης ότι το προφίλ έκφρασης του Oct4 βρέθηκε σε ορισμένες περιπτώσεις να αυξάνεται τοπικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα αγγείων εντός των μελανωμάτων. Τα μελανώματα με υψηλό επίπεδο διήθησης κατά Clark (IV-V) (p=0.038) ή μεγάλο 251 πάχος όγκου κατά Breslow (>1mm) (p<0.001) εμφάνισαν χαμηλότερο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με ανοσοθετικότητα για το αντίσωμα H3K4me2 σε σχέση με τους όγκους με μικρότερο βαθμό διήθησης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι μεταστατικοί όγκοι είχαν χαμηλότερα ποσοστά θετικής ανοσοχρώσης και για τις δύο επιγενετικές τροποποιήσεις, H3K4me2 και H3K27me3, συγκριτικά με τους πρωτοπαθείς όγκους (p=0.0065 και p=0.027 αντίστοιχα). Τέλος, η ανάλυση της παράλληλης ανοσοϊστοχημικής έκφρασης στα κύτταρα μελανώματος έδειξε θετική συσχέτιση των δύο επιγενετικών τροποποιήσεων (p<0.01), όπως επίσης και μεταξύ του EZH2 και της επιγενετικής τροποποίησης H3K27me3 (p=0.03). Ισχυρή συσχέτιση βρέθηκε παρομοίως μεταξύ των επιπέδων έκφρασης Oct4 και SOX2, τόσο για την πυρηνική όσο και την κυτταροπλασματική εντόπιση (p<0.001 και p<0.001 αντίστοιχα). Συμπεράσματα. Λαμβάνοντας υπόψη τη λειτουργική σημασία των τριών υπό μελέτη μεταγραφικών παραγόντων και του ρόλου των επιγενετικών μηχανισμών στην καρκινογένεση, τα ευρήματα μας εισηγούνται ότι οι ΕΖΗ2, SOX2, Oct4 όπως επίσης και οι επιγενετικές τροποποιήσεις Η3Κ4me3 και H3K27me3 αποτελούν εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων στο κακόηθες μελάνωμα, και ιδιαίτερα στη διηθητική παρυφή του όγκου. Η υπόθεση αυτή πρέπει να διεριευνηθεί περαιτέρω, καθώς θα μπορούσε να αποτελέσει, σε συνδυασμό και με άλλες μελέτες, ένα μικρό βήμα προς τη κατεύθυνση της στοχευμένης αντικαρκινικής θεραπείας του μελανώματος στα πλαίσια της Ιατρικής του μέλλοντος. / Cutaneous malignant melanoma originates from melanocytes and is characterized by constantly growing incidence and mortality rates world-wide. The substantial unresponsiveness of advanced metastatic melanomas to most forms of chemotherapy and radiation indicates an urgent need for more effective agents to overcome chemoresistance. Accumulating evidence strongly suggests the presence and involvement of cancer cells with properties of stem cells (CSCs) in the initiation, progression and metastasis of malignant melanoma. EZH2, SOX2 and Oct4 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. Genome-wide analyses of chromatin states of embryonic stem and progenitor cells suggest a ‘bivalent’ colocalization of the activating H3K4 methylation and the repressive H3K27me3 in development-associated genes, while the misregulation of histone modifications on specific residues actively contributes to human cancer. PcG proteins and mainly EZH2 are responsible for maintaining the balance of the bivalent chromatin domain through the methylation of H3K27. Recently a number of studies have shown that cancer cells with properties of stem cells at the tumor invasion front might be involved in the development of metastasis. The discovery that the epithelial to mesenchymal transition (EMT) generates cells with properties of stem cells and a more invasive and metastatic phenotype, brings a connection between metastasis and stem-cell state. According to this model, cells with stem cell properties are located predominantly at the invasion front of the tumor and can derive through the acquisition of transient EMT phenotype. In this context, a comparative analysis of the expression profile of putative CSC markers between the invasion front and the inner tumor mass could test this hypothesis in the case of cutaneous melanoma as well. Purpose. Taking these data into account, we performed the current study in order to evaluate the immunohistochemical expression of EZH2, SOX2 and Oct4 as well as H3K4me2 and H3K27me3, which constitute stem cell-like "bivalent"domains, in cutaneous malignant melanoma, investigating besides the potential identification of cancer cells with stem cells properties at the invasion front of the tumor. Materials and methods. Expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 was evaluated in 89 malignant melanoma (MM) lesions, deriving from 79 patients, using immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. The analyzed cases were accessioned over the time interval 2001-2010 and retrieved from an electronic database maintained by the Department of Pathology of the University General Hospital of Patras (Rion, Greece). The sample consists of 70 primary and 19 metastatic specimens. 14 specimens contained both melanoma cells and nevus cells. Analysis and comparative studies were carried out on the expression of the proteins tested in nevus cells (where existed), melanoma cells, melanoma cells at the invasion front, basal and suprabasal 253 keratinocytes as well. Polymer based technique (Envision, Dako, USA) or MACH4 Universal HRPPolymer Detection (Biocare Medical, USA) and primary antibodies against EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) and H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 19.0). The level of significance was set at p-value <0.05. Results. The three markers studied, EZH2, H3K4me2 and H3K27me3, were identified in the cell nuclei of melanoma cells, nevus cells and normal epidermal keratinocytes, while SOX2 και Oct4 showed nuclear as well as cytoplastik expression. A specific distribution pattern of H3K4me2 and H3K27me3 was found, as stronger levels were localized at the invasion front of the tumor (p=0.034 and p<0.01 respectively). A similar trend was also observed for EZH2, whithout achieving however statistical significance (p=0.08), and similarly for SOX2 in a few sporadic cases. Significantly increased EZH2 immunohistochemical expression was observed in melanoma cells with respect to nevus cells (p=0.02). Nuclear SOX2 levels were also higher in melanoma cells than basal keratinocytes (p=0.02) and in nevus cells than basal keratinocytes (p=0.0016) and suprabasal keratinocytes (p=0.027). Furthermore LIs in melanoma cells presented significantly higher values in primary with respect to metastatic malignant melanoma lesions (p=0.045) as well as in melanoma cells with low Breslow’s depth (≤1mm) (p=0.023), under the absence of ulceration (p=0.009) and with low (≤6/mm2) mitotic rate (p=0.016). As well as nuclear expression of Oct4 is concerned, it was found increased in nevus cells with compared to keratinocytes (p<0.001) and melanoma cells (p=0.004). Cytoplastic expression of Oct4 followed an opposite trend, with decreasing levels in melanoma cells with respekt to suprabasal keratinocytes (p<0.001) and in metastic compared to to primary melanoma cases (p=0.025). Remarkably occasionally increased Oct4 expression in endothelial cells of the tumor microvasculature in melanoma tissues was observed. Furthermore, H3K4me2 and H3K27me3 levels were lower in metastatic with respect to primary melanoma cases (p=0.0065 and p=0.027 respectively). Advanced melanoma demonstrated significantly lower H3K4 immunohistochemical expression than cases of lowest Clark’s level (I) (p=0.038) or low Breslow’s depth (≤1 mm) (p<0.001). Moreover, EZH2 expression in melanoma cells was higher compared to nevus cells (p=0.02). Finally statistical analysis further revealed a positive correlation in melanoma cells betwenn EZH2 and H3K27me3 (p=0.03), H3K4me2 and H3K27me3 (p<0.01), as well as between Oct4 and SOX2 for both nuclear and cytoplastik expression (p<0.001 and p<0.001 respektively). Conclusions. Our results suggest the possibility that combined immunohistochemical expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 might identify cancer cells with potential stem cell properties, particularly at the invasion front of this malignancy. This hypothesis should be further investigated, as many of the epigenetic changes are reversible via pharmacologic manipulations and new CSC-directed therapies, overpassing the resistance of advanced melanoma, may be developed.

Οι φυλετικές ορμόνες επηρεάζουν τη βιολογική συμπεριφορά του μελανώματος. Μετά την ανακάλυψη των οιστρογονικών υποδοχέων (ER) και ιδίως του υποδοχέα βήτα, η άποψη πως τα μελανώματα εκφράζουν χαμηλές συγκεντρώσεις ER αναθεωρήθηκε. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει το βαθμό έκφρασης των ER στο πρωτοπαθές μελάνωμα αλλά και στο λεμφαδένα φρουρό αυτού που παριστά ένα σημαντικό σταθμό στη μεταστατική διαδικασία και να εκτιμήσει πιθανή συσχέτιση με την πρόγνωση και τη συνολική επιβίωση. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση δεδομένων 60 ασθενών, μέσης ηλικίας 54,4 ± 14,5 ετών, με διάγνωση μελανώματος κατά την περίοδο 2001-2012. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε βιοψία λεμφαδένα φρουρού, μετά την αναγνώρισή του με ραδιοϊσοτοπική λεμφαγγειογραφία. Εάν η ιστοπαθολογική εξέταση αναδείκνυε διήθηση του λεμφαδένα από το νεόπλασμα, διενεργείτο συμπληρωματικός λεμφαδενικός καθαρισμός, σε δεύτερο χρόνο. Με ανοσοϊστοχημική μέθοδο εκτιμήθηκε η έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων (ERα και ERβ) σε όλες τις δυνατές περιπτώσεις. Η έκφραση του ERα ήταν εξαιρετικά ασθενής, αναδεικνύοντας τον ERβ σαν τον επικρατούντα οιστρογονικό υποδοχέα, τόσο στον πρωτοπαθή όγκο, όσο και στο λεμφαδένα φρουρό. H εντονότερη ανοσοέκφραση του ERβ καταδείχθηκε σε λεπτά, λιγότερο διηθητικά μελανώματα με αρνητικούς λεμφαδένες φρουρούς. Επιπρόσθετα, η έκφραση του ERβ στον πρωτοπαθή όγκο σχετιζόταν σαφώς με το κυτταρικό μικροπεριβάλλον του, πιθανά επηρεάζοντας τη λεμφογενή διασπορά. Τα επίπεδα έκφρασης του ERβ είναι ελαττωμένα σταθερά σε επιθετικά μελανώματα, μεγάλου πάχους με μεταστατική νόσο στο λεμφαδένα φρουρό. Η αξιολόγησή τους υποδεικνύει έναν πιθανό δείκτη του μεταστατικού δυναμικού των μελανωμάτων και κατ’ επέκταση της πρόγνωσης της νόσου. / Steroid hormones seem to affect the biological behavior of melanoma. Prior to the discovery of estrogen receptor beta (ERb), melanomas were considered to contain low estrogen receptor concentrations. Furthermore, no studies have examined the role of estrogen receptor expression in sentinel lymph nodes (SLNs) of melanomas. The purpose of this study was to investigate the immunoexpression of estrogen receptors in malignant melanomas and SLNs and to examine any possible association with prognosis and overall survival. A retrospective analysis of prospectively collected data was conducted during a 12-year period (2001-2012). Sixty patients with mean age of 54.4 ± 14.5 years old diagnosed with melanomas after excision biopsy of pre-existing melanocytic lesions, were included in the study. All patients underwent wide excision of the primary tumor and SLN identification. Therapeutic lymph node dissection was conducted in cases where the final pathological report was indicative of SLN tumor invasion. Determination of estrogen receptor alpha (ERa) and beta (ERb) status by immunohistochemistry on tumor and nodal paraffin blocks was performed in all feasible cases. ERb but not ERa was the predominant estrogen receptor found in all primary tumors and SLNs examined. The most intense ERb immunostaining was seen in negative SLNs associated with thinner, less invading melanomas. ERb expression in the primary tumor seems to correlate with the cellular microenvironment, possibly altering the process of SLN invasion. ERb expression is down-regulated in aggressive melanomas with sentinel nodal disease, suggesting its possible usefulness as a surrogate marker for metastatic potential and prognosis in malignant melanoma.