Στην εποχή της συστημικής βιολογίας, οι υψηλής απόδοσης (-ομικές) τεχνικές βιομοριακής ανάλυσης επέτρεψαν την ολιστική ανάλυση των διαφόρων μοριακών επιπέδων κυτταρικής λειτουργίας μέσω της ταυτόχρονης μέτρησης εκατοντάδων έως χιλιάδων αντιπροσωπευτικών μοριακών ποσοτήτων. Η μεταβολομική αναφέρεται στην ποσοτικοποίηση του (σχετικού) προτύπου συγκέντρωσης των ελεύθερων μικρών μεταβολιτών. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν, το ρόλο των μεταβολιτών ως, αντιδρώντα ή/και προϊόντα των μεταβολικών αντιδράσεων, το πρότυπο συγκέντρωσης τους επηρεάζει και επηρεάζεται από την κατανομή των μεταβολικών ροών, αποτελώντας επομένως ένα αποτύπωμα της μεταβολικής κατάστασης ενός βιολογικού συστήματος. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων της μεταβολομικής ανάλυσης είναι ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεταβαλλόμενη κατάσταση φυσιολογίας, ενώ δεν απαιτεί ολοκληρωμένη γνώση του μεταβολικού δικτύου ενός οργανισμού. Αυτά τα χαρακτηριστικά είναι ιδιαίτερα πλεονεκτικά για τη μελέτη της μεταβολικής ενεργότητας του εγκεφάλου, λαμβάνοντας υπ’όψιν την ανατομική, μορφολογική και φαινοτυπική πολυπλοκότητα αυτού του οργάνου και την έως τώρα κατανόηση των μεταβολικών του μηχανισμών. Πιο συγκεκριμένα για την επίδραση του ενήλικου υποθυρεοειδισμού στον μεταβολισμό του εγκεφάλου, η μέχρι σήμερα γνώση παραμένει αποσπασματική, ενώ προέρχεται από διαφορετικά πειράματα και διάφορες εγκεφαλικές περιοχές. Μια ολιστική θεώρηση του μεταβολισμού σε συνθήκες υποθυρεοειδισμού σε συγκεκριμένες εγκεφαλικές περιοχές αναμένεται να αυξήσει σημαντικά τη γνώση μας για την ασθένεια αυτή. Σε μια πρόσφατη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας, που ήταν η πρώτη μεταβολική ανάλυση εγκεφαλικού ιστού σε ζωικό μοντέλο μακρόχρονου υποθυρεοειδισμού, η πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των μεταβολικών προτύπων της παρεγκεφαλίδας μυός έδειξε διαφορές στη μεταβολική φυσιολογία του ιστού στα ευ- σε σχέση με τα υποθυρεοειδικά ζώα, παρέχοντας ισχυρές ενδείξεις ότι ο μεταβολισμός της παρεγκεφαλίδας θηλαστικών επηρρεάζεται από τον μακρόχρονο υποθυρεοειδισμό. Στην παρούσα εργασία, συγκρίθηκε η επίδραση του μακρόχρονου υποθυρεοειδισμού στη μεταβολική φυσιολογία της παρεγκεφαλίδας μεταξύ αρσενικών και θηλυκών Balb/cJ μυών, αφού επεκτάθηκε για επιπλέον μεταβολίτες η αυτοματοποιημένη μέθοδος προσδιορισμού κορυφών στο χρωματογράφημα. Ο μακρόχρονος υποθυρεοειδισμός επήχθη με χορήγηση 1% υπερχλωρικού καλλίου για 64 μέρες στο πόσιμο νερό των ζώων. Αυτή είναι και η πρώτη μελέτη της επίδρασης του ενήλικου υποθυρεοειδισμού στην μεταβολομική φυσιολογία του 4 εγκεφάλου των θηλυκών μυών. Τα μεταβολικά πρότυπα αναλύθηκαν με το λογισμικό ανοικτού κώδικα ΤΜ4/ MEV(www.tm4.org/MEV) για την πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των -ομικών δεδομένων. Τα αποτελέσματα συζητήθηκαν στο πλαίσιο ενός κατάλληλα ανακατασκευασμένου μεταβολικού δικτύου για την παρεγκεφαλίδα μυός με βάση τις μεταβολικές βάσεις δεδομένων KEGG και EXPASY και δεδομένα από τη βιβλιογραφία. Η ανάλυση των προτύπων έδειξε ότι η επίδραση της δίμηνης χορήγησης υπερχλωρικού καλλίου στη μεταβολική φυσιολογία της παρεγκεφαλίδας ήταν πιο οξεία στα αρσενικά απ’ότι στα θηλυκά ζώα. Αυτή η παρατήρηση υποστηριζόταν και απο την σημαντικά μικρότερη μείωση του μέσου βάρους των υποθυρεοειδικών σε σχέση με αυτό των ευθυρεοειδικών ζώων στο τέλος της δίμηνης χορήγησης στα θηλυκά σε σχέση με τα αρσενικά. Τέος, σύγκριση των μεταβολικών προτύπων της παρεγκεφαλίδας των ευθυρεοειδικών αρσενικών και θηλυκών μυών έδειξε τους μισούς από τους μεταβολίτες στην παρεγκεφαλίδα των αρσενικών να έχουν σημαντικά μεγαλύτερη συγκέντρωση απ’ ότι στον ιστό των θηλυκών. Αυτή η παρατήρηση καταδεικνύει την ανάγκη της παρεγκεφαλίδας των θηλυκών σε μικρότερες συγκεντρώσεις ελεύθερων μικρών μεταβολιτών για την εύρυθμη λειτουργία της ως ένα πιθανό παράγοντα «προστασίας» του μεταβολισμού της από την επίδραση του μακρόχρονου ενήλικου υποθυρεοειδισμού. Καθώς η παρεγκεφαλίδα των αρσενικών χρειάζεται μεγαλύτερες ποσότητες ελεύθερων μικρών μεταβολιτών, η αναμενώμενη μείωση της συγκέντρωσης των μεταβολιτών που λαμβάνει ο εγκέφαλος μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού λόγω του υποθυρεοειδισμού θα την επηρεάσει πιο γρήγορα και πιο δραστικά από αυτή των θηλυκών. Αυτές οι σημαντικές παρατηρήσεις χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση μέσω κατάλληλα σχεδιασμένων αναλύσεων μεταβολομικής και φυσιολογίας και άλλων εγκεφαλικών περιοχών, συνδυάζοντας επίσης μετρήσεις των επιπέδων των θυρεοειδικών ορμονών με μεταβολομική ανάλυση του εγκεφαλικού ιστού με Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρίας Μάζας, καθώς και μετρήσεις ομικών αναλύσεων από άλλα επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας, κυρίως της πρωτεωμικής. / In the systems biology era, the high-throughput “omic” technologies have enabled the holistic analysis of the various molecular levels of cellular function through the simultaneous measurement of hundreds to thousands of relevant molecular quantities. Metabolomics refers to the quantification of the (relative) concentration profile of the free small metabolites. Taking into consideration the role of the metabolites as reactants and products of the metabolic reactions, their concentration profile affects and is affected by the metabolic pathway flux distribution. Thus, the metabolic profile provides a fingerprint of the metabolic state of a biological system. Among the advantages of the metabolomic analysis is that it can be easily used to monitor transient metabolic conditions without requiring extensive knowledge of the structure and regulation of the investigated metabolic networks. This characteristic is especially advantageous for the analysis of brain metabolism, considering the anatomical, morphological and phenotypic complexity of this organ and our current shortages in understanding its metabolic mechanisms. For the effect of adult onset hypothyroidism (AOH) on brain metabolism in particular, the current knowledge remains fragmented, concerning different experimental setups and recovered from various brain regions. A holistic view of metabolism under AOH in particular brain regions is expected to significantly enhance the current knowledge about the disease. In a recent study of our group, which was the first metabolomic analysis of brain tissue in a prolonged AOH mouse model, multivariate statistical analysis of the metabolic profiles of the mouse cerebella indicated differences in the metabolic physiology of the tissue in the eu- compared to the hypo- thyroid animals, providing strong evidence that the mammalian cerebellum is metabolically responsive to prolonged AOH. In the present work, we compared the effect of prolonged AOH on the cerebellar metabolic physiology between male and female Balb/cJ mice, after enhancing the metabolite peak identification method to include additional metabolites. The prolonged AOH was induced by a 64-day treatment with 1% potassium perchlorate in the drinking water of the animals. This is the first reported analysis of the effect of AOH on the brain metabolic physiology of female mice. The raw metabolic profiles were normalized and appropriately filtered. The normalized metabolic profiles were analyzed using the open-source TM4/MeV software (www.tm4.org/MeV) for the multivariate statistical analysis of “omic” data. The acquired results were interpreted in the context of an appropriately reconstructed metabolic network for the mouse cerebellum based on the metabolic databases, KEGG and Expasy, and a plethora of information mined from the literature. The analysis of the metabolic profiles 6 indicated that the effect of the 2-month potassium perchlorate treatment on the metabolic physiology of the cerebellum is more acute in the male with respect to the female mice. The time profile of the body weight of the female compared to the male mice indicated a significantly smaller decrease in the mean weight of the hypothyroid compared to the euthyroid mice in the female compared to the male population at the end of the KClO4 treatment, an observation that further supports the metabolic profiling results. Finally, comparison between the metabolic profiles of the euthyroid male and female cerebellum indicated a significantly higher concentration in half of the measured free metabolites in the male compared to the female animals. This indicates the “leanness” of the metabolic profile of the female cerebellum as a potential “protective” parameter to the effect of AOH on its metabolic physiology, in the sense that the expected due to AOH decrease in the concentrations of the metabolites that are transferred to the brain through the blood brain barrier may affect more the male cerebellum that requires higher levels of free metabolites for its regular activity. These significant observations are in need of further investigation through appropriately designed physiological and metabolomic studies, integrating also thyroid hormone measurements from Liquid Chromatography-MS metabolomic analysis of brain tissue as well as omic measurements from other molecular levels of cellular function, mainly from proteomics.

Στην μετα-γονιδιωματική εποχή, την εποχή της συστημικής βιολογίας, η κατανόηση της πολυπλοκότητας της κυτταρικής φυσιολογίας απαιτεί την ανάλυση της δυναμικής των δικτύων βιομοριακών αλληλεπιδράσεων σε όλα τα μοριακά επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας. Με τη σειρά της, η λειτουργική γονιδιωματική, ένας θεμελιώδης λίθος της συστημικής βιολογίας, στοχεύει στον πολυδιάστατο χαρακτηρισμό ενός γονιδίου, συνδυάζοντας δεδομένα από τις τεχνολογίες υψηλής απόδοσης. Είναι αυτή ακριβώς η ενοποίηση όλων των μοριακών προτύπων για ένα διαταραγμένο βιολογικό σύστημα που μπορεί να δώσει πληροφορίες αναφορικά με την λειτουργία ενός αγνώστου γονιδίου. Στο πλαίσιο αυτό, η παρούσα Διπλωματική Εργασία αποτελεί μέρος της ολιστικής λειτουργικής ανάλυσης δύο αλληλεπιδρώντων, αγνώστου βιολογικού ρόλου, πρωτεϊνών, της DGCR14 και της FRA10AC1, οι οποίες έχουν απομονωθεί ως συστατικά του σωματιδίου συναρμογής και έχουν συσχετιστεί με νευρολογικές ασθένειες. Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στην μεταβολομική μελέτη των μοριακών επιπτώσεων της υπερέκφρασης της DGCR14 σε ένα ανθρώπινο κυτταρικό μοντέλο, τα κύτταρα HeLa, με την χρήση της αέριας χρωματογραφίας - φασματομετρία μάζας. Ωστόσο, για να επιτευχθεί αυτό, θέματα σχετικά με τις δυνατότητες ποσοτικοποίησης των πολυβηματικών ομικών αναλύσεων έπρεπε να επιλυθούν. Μια σημαντική παράμετρος αφορά στην γρήγορη αδρανοποίηση των ενζυματικών διεργασιών έτσι ώστε οι αποκτηθέντες μετρήσεις να αντικατοπτρίζουν την πραγματική κυτταρική φυσιολογία. Για τον σκοπό αυτό, ο πειραματικός σχεδιασμός πρέπει να τροποποιείται κατάλληλα έτσι ώστε οποιεσδήποτε απαιτούμενες προ-αναλυτικές διαδικασίες χειρισμού των κυττάρων να έχουν ελάχιστη επίδραση στην φυσιολογία τους. Μελετήσαμε συνεπώς την επίδραση τεσσάρων πρωτοκόλλων συλλογής προσκολλημένων κυττάρων και δύο διαφορετικών διαλυμάτων έκπλυσης στο μεταβολικό πρότυπο κυττάρων HeLa. Τα μεταβολομικά δεδομένα αξιολογήθηκαν στο πλαίσιο της καρκινικής μεταβολικής φυσιολογίας και το πρωτόκολλο με την ελάχιστη δυνατή επίδραση στην κυτταρική φυσιολογία καθορίστηκε. Μεταξύ των αποτελεσμάτων αυτής της μελέτης, πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την μεταβολική φυσιολογία των αθανατοποιημένων κυτταρικών σειρών προέκυψαν, οι οποίες ενίσχυσαν σημαντικά την υπάρχουσα γνώση γύρω από τον καρκινικό μεταβολισμό, σε σταθερές ή μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Επακόλουθα, η βελτιστοποίηση της διαδικασίας συλλογής είχε ως αποτέλεσμα την δημιουργία ενός αντιπροσωπευτικού μεταβολικού προτύπου κυττάρων HeLa πάνω στο οποίο πραγματοποιήθηκε η αξιολόγηση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης DGCR14 χωρίς να επισκιάζεται από πειραματικές αποκλίσεις εισαγόμενες από την διαδικασία χειρισμού των κυττάρων. Αναφορικά με τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την DGCR14, η μεταβολομική ανάλυση εντόπισε μια αλλαγή φυσιολογίας συνδεόμενη με συγκεκριμένα μεταβολικά μονοπάτια τα οποία υποδηλώνουν έντονο μεταβολικό στρες. Για να διερευνήσουμε την συσχέτιση της υπερέκφρασης της DGCR14 με τον παραπάνω μεταβολικό φαινότυπο, χρησιμοποιήσαμε το ανακατασκευασμένο δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του σωματιδίου συναρμογής στον άνθρωπο και το δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων στον άνθρωπο από την μετα-βάση δεδομένων PICKLE, προκειμένου να αντλήσουμε επιπλέον πληροφορίες για τον ρόλο της DGCR14 βάσει της θέσης της σε σχέση με άλλους κόμβους και υπερ-κόμβους. Μια πιθανή λειτουργική συσχέτιση της DGCR14 με αυτοφαγικούς και λυσοσωμικούς μηχανισμούς βρέθηκε, η οποία θα αξιολογηθεί και μελλοντικά μέσω της ανάλυσης, ξεχωριστά και συνδυαστικά, των μοριακών συνεπειών της υπερ- και υπο-έκφρασης σε όλα τα μοριακά επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας. / In the post-genomic, systems biology era, developing a systems level understanding of a physiological process requires the analysis of biomolecular network dynamics at all molecular levels of cellular function. Likewise, functional genomics, an essential foundation of systems biology research, aims to define and analyze gene function at a global level by integrating data obtained from multiple high-throughput technologies. It is the integration of all the molecular profiles for a systematically perturbed system that can provide insight about the function of unknown genes. Along these lines, the present study is part of the systematic functional analysis of two interacting, but yet of unknown biological role, spliceosomal proteins, DGCR14 and FRA10AC1, that have both been implicated in neurological diseases. The present work focuses on studying the molecular consequences of DGCR14 overexpression in a human cell model, HeLa cells, at the metabolic level using Gas Chromatography-(ion trap) Mass Spectrometry. However, to succeed in this, issues regarding the quantification capabilities of the multistep omic analysis procedures needed to be resolved. A major concern refers to the fast quenching of any enzymatic processes, so that the acquired measurements indeed reflect the cellular physiology in vivo. To this end, the experimental design should be appropriately adjusted so that any required sample handling actions before quenching have a minimal effect on cellular physiology. Thus, we investigated the effect of four cell collection protocols and two different washing solutions on the intracellular metabolic profile measurements of a HeLa cell culture. The measurements were interpreted in the context of the known cancer cell metabolic physiology and the protocol with the minimum possible effect on cellular physiology was specified. Among the results of this study, valuable information about the metabolic physiology of the immortal cell line arise, which improved our knowledge about cancer metabolism under steady or varying environmental conditions. Subsequently, the optimization of the collection procedure enabled us to establish a representative metabolic profile of HeLa cells against which the overexpression of DGCR14 was evaluated without being obscured by the effect of the sample handling. Regarding the overexpressing cells, the metabolomic analysis detected a trend of physiological change connected to specific metabolic pathways indicating strong metabolic stress. To understand how DGCR14 overexpression generates this particular metabolic phenotype, we used the human spliceosomal complex protein-protein interaction (PPI) network and the integrated human PPI meta-database PICKLE to extract additional information about DGCR14 role based on its location with respect to other nodes and hubs. A possible functional correlation of DGCR14 to autophagic and lysosomal mechanisms was established, that will be further evaluated in the future through the analysis, separately and in combination, of the consequences of DGCR14 over- and under-expression at all molecular levels of cellular function.