Στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ), η ντοπαμίνη ελέγχει σημαντικές φυσιολογικές λειτουργίες όπως η έκκριση ορμονών, η ρύθμιση της κίνησης, γνωστικές πορείες και περίπλοκες συμπεριφορές που έχουν σχέση με το συναίσθημα και την ανταμοιβή. Η επαναπρόσληψη της ντοπαμίνης διαμέσου του μεταφορέα της νευρωνικής πλασματικής μεμβράνης (DAT) είναι σημαντική για τη διατήρηση της ομοιόστασης της στο ΚΝΣ. Πιστεύεται ότι ο DAT ελέγχει την ένταση και τη διάρκεια της ντοπαμινεργικής νευροδιαβίβασης. Ο DAT αποτελεί μοριακό στόχο θεραπευτικών ουσιών για την θεραπεία νοητικών δυσλειτουργιών όπως η σχιζοφρένεια και η κατάθλιψη. Επιπροσθέτως είναι στόχος εθιστικών ουσιών όπως η κοκαΐνη και η αμφεταμίνη. Οι ψυχοδιεγερτικές και οι θεραπευτικές ουσίες δεσμεύονται στον DAT, αλλάζουν την λειτουργία του και ως εκ τούτου επιτείνουν την ένταση και διάρκεια της ντοπαμινεργικής νευροδιαβίβασης. Η παρεγκεφαλίδα δέχεται μια κατεχολαμινεργική νεύρωση η οποία θεωρείται ότι είναι νοραδρενεργική. Εν τούτοις βιοχημικές, φαρμακολογικές και ανατομικές μελέτες υποδεικνύουν ότι επίσης δέχεται μια μικρή ντοπαμινεργική νεύρωση από την κοιλιακή περιοχή της καλύπτρας και την συμπαγή μοίρα της μέλαινας ουσίας. Πρόσφατες ανοσοϊστοχημικές μελέτες μας για τον DAT υπέδειξαν ότι νευρώνες της παρεγκεφαλίδας μπορεί να εκφράζουν τον μεταφορέα. Στην παρούσα μελέτη ο εντοπισμός του μεταφορέα της ντοπαμίνης (DAT) στην παρεγκεφαλίδα φυσιολογικών μυών, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA έγινε με την μέθοδο Western Blot, IP και RT-PCR αντίστοιχα. Η πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε στο κλάσμα των συναπτοσωμάτων, ενώ το mRNA σε ολικό εκχύλισμα παρεγκεφαλίδας. Τα αποτελέσματα έρχονται να επιβεβαιώσουν την ύπαρξη ντοπαμινεργικών κυττάρων στην παρεγκεφαλίδα. / In the Central Nervous System (CNS) the neurotransmitter dopamine (DA) controls important functions including hormone secretion, locomotion, cognitive processes and complex behaviours that are associated with emotion and reward. Dopamine uptake through the neuronal plasma membrane DA transporter is essential for the maintenance of normal DA homeostasis in the brain. It is believed that DAT controls the intensity and the duration of dopamine neurotransmittion. DAT is the molecular target for therapeutic agents used in the treatment of mental disorders, such as schizophrenia and depression. In addition, DAT is the target for cocaine and amphetamine. Psychostimulants and therapeutic substances alter its transporter function and therefore prolong the intensity and duration of dopaminergic neurotransmittion.The cerebellum receives a catecholaminergic input that is generally accepted to be noradrenergic. However, biochemical, pharmacological and anatomical evidence indicate that the cerebellum also receives a small dopaminergic input from ventral tegmental area and substantia nigra pars compacta. Recent immunohistochemical studies have indicated that cerebellar neurons express the transporter. In the current study, cerebellar dopamine transporter protein and mRNA were studied using the methods of western blotting and RT-PCR. Our results confirm the existence of dopaminergic neurons in cerebellum.

- / -

Η παρεγκεφαλίδα των πτηνών, μια μορφολογικά μοναδική δομή του εγκεφάλου, αποτελείται από 10 λοβούς (μερικοί από τους οποίους φέρουν δευτερογενείς υποδιαιρέσεις), οι οποίοι σχηματίζονται κατά τα ενδιάμεσα εμβρυϊκά αναπτυξιακά στάδια. Ο πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση των κυττάρων της εξωτερικής κοκκώδους στιβάδας είναι το κύριο γεγονός κατά την διαδικασία ανάπτυξης των παρεγκεφαλιδικών λοβών. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση του μηχανισμού σχηματισμού των λοβών στην αναπτυσσόμενη παρεγκεφαλίδα. Για τον προσδιορισμό του ρυθμού του πολλαπλασιασμού των πρόγονων κοκκωδών κύτταρων, εφαρμόσθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος της 5-βρωμο-2-δεοξυουριδίνης (BrdU). Η BrdU, που ενσωματώνεται στο DNA κατά την S-φάσης του κυτταρικού κύκλου, ενέθηκε in ovo (100μg/gr βάρους αυγού σε φυσιολογικό ορό) στις εμβρυικές μέρες E10, E13, E15 και E17, και μετά από διαφορετικούς χρόνους επιβίωσης, τα έμβρυα θυσιάστηκαν (1, 2 και 3 ώρες μετά την ένεση), μονιμοποιήθηκαν με ενδοκάρδια έγχυση, και αφαιρέθηκε ο εγκέφαλος, έγινε κρυο-προστασία, μετά –μονιμοποίηση και φύλαξη του εγκεφάλου στους -80°C. Την E10 ημέρα, παρατηρήθηκε πλήρως ανεπτυγμένη πρωτογενής σχισμή, ενώ από την E13 ημέρα, όλοι οι λοβοί της παρεγκεφαλίδας έχουν σχηματιστεί και μέχρι την E17 μέρα όλες οι υποδιαιρέσεις τους είναι εμφανείς. Με πειράματα απλής και διπλής ανοσοϊστοχημείας, σε διατομές 20μm, προσδιορίσθηκε ο αριθμός των μιτωτικά ενεργών κυττάρων στην S-φάση (BrdU σήμανση), ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων (σήμανση κασπάσης 3). Έγινε χαρτογράφηση των προτύπων πολλαπλασιασμού και απόπτωσης (με τη χρήση camera lucida) και υπολογίστηκε σε συγκεκριμένους λοβούς ο αριθμός των προγονικών κοκκωδών κυττάρων σε διαφορετικούς χρόνους επιβίωσης. Μόνο μικρός αριθμός αποπτωτικών κυττάρων παρατηρήθηκε στη μελλοντική εσωτερική κοκκώδη στιβάδα, τον τελικό προορισμό των κυττάρων της εξωτερικής κοκκώδους στιβάδας, και συνεπώς η απόπτωση δεν παίζει καθοριστικό ρόλο στον σχηματισμό των λοβών. / The cerebellum (Cb), a highly conserved structure of the vertebrate brain, is a morphologically unique laminated structure made up of a set of folia separated by fissures. The avian cerebellum consists of ten folia, (some of them are subdivided in secondary folia) which are mainly developed during mid and late embryonic stages. External granule cell proliferation is the major event that coincides with the fissure formation. The present study aimed to address the question of the mechanisms that underlie the cerebellar fissure development. For this, the proliferation pattern in the external granule cell layer of the developing embryonic chick cerebellum was mapped, by means of 5-bromo-2’-deoxyurinine (BrdU) immunohistochemistry. BrdU, an S-phase marker was injected in ovo, (100μg/gr egg weight in physiological saline) at the embryonic days E10, E13, E15 and E17 and embryos were allowed to survive for different survival times. The embryos were fixed, cryo-protected and adjacent cerebellar sections were processed for BrdU labelling to determine proliferating cells, for caspase 3 labelling to determine the pattern of apoptotic cells and for double immunofluorescence to characterize the phenotype of BrdU+ cells. Cell proliferation and apoptotic patterns were determined throughout the individual lobules, by image analysis and camera lucida mapping. At day E10, mid-sagittal sections of cerebellum showed that primitive fissure is formed, with well infolded the fissure prima. From day E13, all primary folia were present and by E17 day all subdivisions were developed. While mitotic activity characterized all external granule cell layer folia, low numbers of cells undergoing apoptosis were found mainly in the future granule cell layer, the site of the final destination of external granule cells. Estimation of the density of BrdU+ granule cell precursors revealed that differences determined in the proliferation rate between the fissure’s wall and floor, but not in the apoptotic cell death, may account for the formation of fissures and folia.

Μελετήθηκαν αλληλεπιδράσεις μεταξύ της παρεγκεφαλίδας και των βασικών γαγγλίων στον εγκέφαλο ενήλικων μυών. Για τη μελέτη της επίδρασης της παρεγκεφαλίδας στα βασικά γάγγλια εξετάστηκαν οι επιπτώσεις της εκφύλισης του παρεγκεφαλιδικού φλοιού στη νευροχημεία των βασικών γαγγλίων. Χρησιμοποιήθηκαν δύο μοντέλα εκφύλισης: το μεταλλαγμένο στέλεχος μυός PCD που εμφανίζει πλήρη εκφύλιση των κυττάρων Purkinje και μύες με μερική δεξιά εκφύλιση του παρεγκεφαλιδικού φλοιού μετά από ένεση καϊνικού οξέος στην περιοχή του παρασκώληκα. Ιn vitro ποσοτική αυτοραδιογραφία έδειξε αναβάθμιση των υποδοχέων ντοπαμίνης D1 στα βασικά γάγγλια και των δύο μοντέλων εκφύλισης. Για τη μελέτη της επίδρασης των βασικών γαγγλίων στην παρεγκεφαλίδα μελετήθηκε ο μεταφορέας της ντοπαμίνης στον παρεγκεφαλιδικό ιστό μυών με μεθόδους ποσοτικής αυτοραδιογραφίας, μεμβρανικής δέσμευσης και ανοσοϊστοχημείας. Τα αποτελέσματα έδειξαν την ύπαρξη, την ανατομική κατανομή και τις ιδιότητες του μεταφορέα της νοτπαμίνης στην παρεγκεφαλίδα. / The study of the interactions between the cerebellum and the basal ganglia was the aim of this thesis. To study cerebellar influences on the basal ganglia I investigated the effects of cerebellar cortical degeneration on basal ganglia neurochemistry. Two models of cerebellar degeneration were used: the mutant mouse strain \\\"Purkinje cell degenaration\\\" that completely lacks Purkinje cells, and mice with partial Purkije cell lesion after kainic acid injections in the right paravermis. In vitro quantitative receptor autoradiography showed an up-regulation of D1 dopamine receptors in the basal ganglia of both cerebellar degeneration models. This may reflect a compensatory adaptation. To study basal ganglia influences on the cerebellum I characterized the dopamine transporter of the mouse cerebellum by using receptor binding and determined its anatomical distribution by using receptor autoradiography and immunoistochemistry.

- / -

- / -

- / -

Στην εποχή της συστημικής βιολογίας, οι υψηλής απόδοσης (-ομικές) τεχνικές βιομοριακής ανάλυσης επέτρεψαν την ολιστική ανάλυση των διαφόρων μοριακών επιπέδων κυτταρικής λειτουργίας μέσω της ταυτόχρονης μέτρησης εκατοντάδων έως χιλιάδων αντιπροσωπευτικών μοριακών ποσοτήτων. Η μεταβολομική αναφέρεται στην ποσοτικοποίηση του (σχετικού) προτύπου συγκέντρωσης των ελεύθερων μικρών μεταβολιτών. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν, το ρόλο των μεταβολιτών ως, αντιδρώντα ή/και προϊόντα των μεταβολικών αντιδράσεων, το πρότυπο συγκέντρωσης τους επηρεάζει και επηρεάζεται από την κατανομή των μεταβολικών ροών, αποτελώντας επομένως ένα αποτύπωμα της μεταβολικής κατάστασης ενός βιολογικού συστήματος. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων της μεταβολομικής ανάλυσης είναι ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεταβαλλόμενη κατάσταση φυσιολογίας, ενώ δεν απαιτεί ολοκληρωμένη γνώση του μεταβολικού δικτύου ενός οργανισμού. Αυτά τα χαρακτηριστικά είναι ιδιαίτερα πλεονεκτικά για τη μελέτη της μεταβολικής ενεργότητας του εγκεφάλου, λαμβάνοντας υπ’όψιν την ανατομική, μορφολογική και φαινοτυπική πολυπλοκότητα αυτού του οργάνου και την έως τώρα κατανόηση των μεταβολικών του μηχανισμών. Πιο συγκεκριμένα για την επίδραση του ενήλικου υποθυρεοειδισμού στον μεταβολισμό του εγκεφάλου, η μέχρι σήμερα γνώση παραμένει αποσπασματική, ενώ προέρχεται από διαφορετικά πειράματα και διάφορες εγκεφαλικές περιοχές. Μια ολιστική θεώρηση του μεταβολισμού σε συνθήκες υποθυρεοειδισμού σε συγκεκριμένες εγκεφαλικές περιοχές αναμένεται να αυξήσει σημαντικά τη γνώση μας για την ασθένεια αυτή. Σε μια πρόσφατη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας, που ήταν η πρώτη μεταβολική ανάλυση εγκεφαλικού ιστού σε ζωικό μοντέλο μακρόχρονου υποθυρεοειδισμού, η πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των μεταβολικών προτύπων της παρεγκεφαλίδας μυός έδειξε διαφορές στη μεταβολική φυσιολογία του ιστού στα ευ- σε σχέση με τα υποθυρεοειδικά ζώα, παρέχοντας ισχυρές ενδείξεις ότι ο μεταβολισμός της παρεγκεφαλίδας θηλαστικών επηρρεάζεται από τον μακρόχρονο υποθυρεοειδισμό. Στην παρούσα εργασία, συγκρίθηκε η επίδραση του μακρόχρονου υποθυρεοειδισμού στη μεταβολική φυσιολογία της παρεγκεφαλίδας μεταξύ αρσενικών και θηλυκών Balb/cJ μυών, αφού επεκτάθηκε για επιπλέον μεταβολίτες η αυτοματοποιημένη μέθοδος προσδιορισμού κορυφών στο χρωματογράφημα. Ο μακρόχρονος υποθυρεοειδισμός επήχθη με χορήγηση 1% υπερχλωρικού καλλίου για 64 μέρες στο πόσιμο νερό των ζώων. Αυτή είναι και η πρώτη μελέτη της επίδρασης του ενήλικου υποθυρεοειδισμού στην μεταβολομική φυσιολογία του 4 εγκεφάλου των θηλυκών μυών. Τα μεταβολικά πρότυπα αναλύθηκαν με το λογισμικό ανοικτού κώδικα ΤΜ4/ MEV(www.tm4.org/MEV) για την πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των -ομικών δεδομένων. Τα αποτελέσματα συζητήθηκαν στο πλαίσιο ενός κατάλληλα ανακατασκευασμένου μεταβολικού δικτύου για την παρεγκεφαλίδα μυός με βάση τις μεταβολικές βάσεις δεδομένων KEGG και EXPASY και δεδομένα από τη βιβλιογραφία. Η ανάλυση των προτύπων έδειξε ότι η επίδραση της δίμηνης χορήγησης υπερχλωρικού καλλίου στη μεταβολική φυσιολογία της παρεγκεφαλίδας ήταν πιο οξεία στα αρσενικά απ’ότι στα θηλυκά ζώα. Αυτή η παρατήρηση υποστηριζόταν και απο την σημαντικά μικρότερη μείωση του μέσου βάρους των υποθυρεοειδικών σε σχέση με αυτό των ευθυρεοειδικών ζώων στο τέλος της δίμηνης χορήγησης στα θηλυκά σε σχέση με τα αρσενικά. Τέος, σύγκριση των μεταβολικών προτύπων της παρεγκεφαλίδας των ευθυρεοειδικών αρσενικών και θηλυκών μυών έδειξε τους μισούς από τους μεταβολίτες στην παρεγκεφαλίδα των αρσενικών να έχουν σημαντικά μεγαλύτερη συγκέντρωση απ’ ότι στον ιστό των θηλυκών. Αυτή η παρατήρηση καταδεικνύει την ανάγκη της παρεγκεφαλίδας των θηλυκών σε μικρότερες συγκεντρώσεις ελεύθερων μικρών μεταβολιτών για την εύρυθμη λειτουργία της ως ένα πιθανό παράγοντα «προστασίας» του μεταβολισμού της από την επίδραση του μακρόχρονου ενήλικου υποθυρεοειδισμού. Καθώς η παρεγκεφαλίδα των αρσενικών χρειάζεται μεγαλύτερες ποσότητες ελεύθερων μικρών μεταβολιτών, η αναμενώμενη μείωση της συγκέντρωσης των μεταβολιτών που λαμβάνει ο εγκέφαλος μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού λόγω του υποθυρεοειδισμού θα την επηρεάσει πιο γρήγορα και πιο δραστικά από αυτή των θηλυκών. Αυτές οι σημαντικές παρατηρήσεις χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση μέσω κατάλληλα σχεδιασμένων αναλύσεων μεταβολομικής και φυσιολογίας και άλλων εγκεφαλικών περιοχών, συνδυάζοντας επίσης μετρήσεις των επιπέδων των θυρεοειδικών ορμονών με μεταβολομική ανάλυση του εγκεφαλικού ιστού με Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρίας Μάζας, καθώς και μετρήσεις ομικών αναλύσεων από άλλα επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας, κυρίως της πρωτεωμικής. / In the systems biology era, the high-throughput “omic” technologies have enabled the holistic analysis of the various molecular levels of cellular function through the simultaneous measurement of hundreds to thousands of relevant molecular quantities. Metabolomics refers to the quantification of the (relative) concentration profile of the free small metabolites. Taking into consideration the role of the metabolites as reactants and products of the metabolic reactions, their concentration profile affects and is affected by the metabolic pathway flux distribution. Thus, the metabolic profile provides a fingerprint of the metabolic state of a biological system. Among the advantages of the metabolomic analysis is that it can be easily used to monitor transient metabolic conditions without requiring extensive knowledge of the structure and regulation of the investigated metabolic networks. This characteristic is especially advantageous for the analysis of brain metabolism, considering the anatomical, morphological and phenotypic complexity of this organ and our current shortages in understanding its metabolic mechanisms. For the effect of adult onset hypothyroidism (AOH) on brain metabolism in particular, the current knowledge remains fragmented, concerning different experimental setups and recovered from various brain regions. A holistic view of metabolism under AOH in particular brain regions is expected to significantly enhance the current knowledge about the disease. In a recent study of our group, which was the first metabolomic analysis of brain tissue in a prolonged AOH mouse model, multivariate statistical analysis of the metabolic profiles of the mouse cerebella indicated differences in the metabolic physiology of the tissue in the eu- compared to the hypo- thyroid animals, providing strong evidence that the mammalian cerebellum is metabolically responsive to prolonged AOH. In the present work, we compared the effect of prolonged AOH on the cerebellar metabolic physiology between male and female Balb/cJ mice, after enhancing the metabolite peak identification method to include additional metabolites. The prolonged AOH was induced by a 64-day treatment with 1% potassium perchlorate in the drinking water of the animals. This is the first reported analysis of the effect of AOH on the brain metabolic physiology of female mice. The raw metabolic profiles were normalized and appropriately filtered. The normalized metabolic profiles were analyzed using the open-source TM4/MeV software (www.tm4.org/MeV) for the multivariate statistical analysis of “omic” data. The acquired results were interpreted in the context of an appropriately reconstructed metabolic network for the mouse cerebellum based on the metabolic databases, KEGG and Expasy, and a plethora of information mined from the literature. The analysis of the metabolic profiles 6 indicated that the effect of the 2-month potassium perchlorate treatment on the metabolic physiology of the cerebellum is more acute in the male with respect to the female mice. The time profile of the body weight of the female compared to the male mice indicated a significantly smaller decrease in the mean weight of the hypothyroid compared to the euthyroid mice in the female compared to the male population at the end of the KClO4 treatment, an observation that further supports the metabolic profiling results. Finally, comparison between the metabolic profiles of the euthyroid male and female cerebellum indicated a significantly higher concentration in half of the measured free metabolites in the male compared to the female animals. This indicates the “leanness” of the metabolic profile of the female cerebellum as a potential “protective” parameter to the effect of AOH on its metabolic physiology, in the sense that the expected due to AOH decrease in the concentrations of the metabolites that are transferred to the brain through the blood brain barrier may affect more the male cerebellum that requires higher levels of free metabolites for its regular activity. These significant observations are in need of further investigation through appropriately designed physiological and metabolomic studies, integrating also thyroid hormone measurements from Liquid Chromatography-MS metabolomic analysis of brain tissue as well as omic measurements from other molecular levels of cellular function, mainly from proteomics.