Το περιβάλλον διαθέτει πλούτο παραγόντων, οι οποίοι επηρεάζουν με θετικό ή αρνητικό τρόπο την ανάπτυξη και τη λειτουργία των οργανισμών. Μεταξύ των μετάλλων, ο μόλυβδος (Pb) θεωρείται ο σημαντικότερος νευροτοξικός περιβαλλοντικός παράγοντας, με τις κυριότερες αρνητικές επιδράσεις του να αφορούν νεαρούς οργανισμούς ή οργανισμούς που βρίσκονται στα πρώτα στάδια ανάπτυξης. Το περιβάλλον, ωστόσο, διαθέτει και πολλούς παράγοντες οι οποίοι δύνανται να χρησιμοποιηθούν για τις ευεργετικές τους ιδιότητες. Τα τελευταία χρόνια το επιστημονικό ενδιαφέρον έχει στραφεί στην εξεύρεση φυτών και φυτικών συστατικών που θα μπορούσαν να δρουν ενάντια της νευροτοξικής δράσης των μετάλλων. Η ελληνική χλωρίδα είναι πλούσια σε κοινά και ενδημικά φυτά που διαθέτουν νευροπροστατευτικές ιδιότητες. Ο σκοπός της εργασίας ήταν η διερεύνηση της πιθανής συσσώρευσης του μολύβδου στον ολικό εγκέφαλο (-παρεγκεφαλίδα) ενήλικων μυών και της πιθανής επαγωγής νευροτοξικών δράσεων, εστιάζοντας στη διεργασία μνήμη/μάθηση και την ενεργότητα του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση, ύστερα από χορήγηση διαλύματος μολύβδου (500 ppm) για διάστημα 4 εβδομάδων. Επιπλέον, διερευνήθηκε η πολυφαινολική σύσταση και η πιθανή προστατευτική δράση ενάντια στο μέταλλο των αφεψημάτων δυο φυτών της ελληνικής χλωρίδας, του κοινού Rosmarinus officinalis (δενδρολίβανο) και του υπενδημικού Hypericum vesiculosum, ύστερα από χορήγηση των αφεψημάτων σε ενήλικους μύες, καθώς και μετά από συγχορήγησή τους με το μόλυβδο για χρονικό διάστημα 4 εβδομάδων. To Η. vesiculosum δεν έχει μελετηθεί ποτέ ξανά ως προς τη σύσταση και τις ιδιότητές του. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι και τα δυο αφεψήματα έχουν πλούσιο πολυφαινολικό περιεχόμενο, και ιδιαιτέρως το H. vesiculosum που υπερισχύει του δενδρολίβανου. Επιπλέον, με τη χρήση δυο φασματομετρικών μεθόδων (Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης/AAS, Φασματομετρία Μάζας με Πηγή Επαγωγικά Συζευγμένου Πλάσματος/ICP-MS) αποδείχτηκε ότι ο Pb συσσωρεύεται στον εγκέφαλο ενήλικων μυών και αυτή η συσσώρευση δεν επηρεάζεται σε σημαντικό βαθμό από την συγχορήγηση των δυο αφεψημάτων με το μέταλλο. Ακόμα, η μελέτη της μνήμης και της μάθησης με τη χρήση της δοκιμασίας της Παθητικής Αποφυγής και η μελέτη της ενεργότητας της AChE στον ολικό εγκέφαλο (-παρεγκεφαλίδα) και στην παρεγκεφαλίδα [SS (διαλυτό σε άλας) κλάσμα που περιέχει κυρίως την G1 ισομορφή της AChE και DS (διαλυτό σε απορρυπαντικό κλάσμα) που περιέχει κυρίως την G4 ισομορφή της AChE, η οποία είναι πολύ σημαντική για το νευρικό σύστημα] απέδειξε ότι (α) ο μόλυβδος ασκεί τις νευροτοξικές του επιδράσεις προκαλώντας γνωστικές βλάβες και δυσλειτουργία του χολινεργικού συστήματος. Η ελάττωση της ενεργότητας της AChE μπορεί να οφείλεται στην αποικοδόμηση των χολινεργικών νευρώνων του ιππόκαμπου και της παρεγκεφαλίδας. (β) Τα δυο αφεψήματα αναστέλλουν την AChE με το δενδρολίβανο να είναι πιο αποδοτικό ακολουθώντας ιστοειδική δράση. Η διαδικασία της μνήμης/μάθησης δε φάνηκε να επηρεάζεται από τα δυο αφεψήματα αν και το δενδρολίβανο έδειξε ένα θετικό αποτέλεσμα που δεν ήταν στατιστικά σημαντικό. (γ) Η συγχορήγηση καθενός από τα αφεψήματα με το διάλυμα του Pb προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στην ενεργότητα της AChE (ειδικά στο DS κλάσμα) και το R. officinalis ήταν περισσότερο αποτελεσματικό από το H. vesiculosum. Ολοκληρώνοντας, η συγχορήγηση υποδεικνύει ότι και τα δυο αφεψήματα επηρέασαν με παρόμοιο θετικό τρόπο τη γνωστική λειτουργία σε σχέση με τη δυσλειτουργία που είχε προκαλέσει ο Pb. / There are many environmental factors that can affect positively or negatively both the development and the functions of organisms. Among heavy metals, lead (Pb) is considered to be the most neurotoxic environmental factor, which exerts its negative effects especially in young or developmental organisms. However, there are many environmentally-based factors that could be used for their beneficial properties. In recent years, scientists have turned their interest to the discovery of plants and phenols that could protect the neural system against the neurotoxic effects of heavy metals. Hellenic flora is very rich in common and endemic plants with possible neuroprotective properties. The aim of the present study was to investigate the possible accumulation of lead in adult mice brain and the induction of neurotoxic effects, with emphasis on learning/memory process and acetylcholinesterase (AChE) activity, after the consumption of a lead solution (500 ppm), for 4 weeks. Furthermore, we investigated the polyphenolic content and the possible neuroprotective effects of two beverages (2%w/v), one of the common Rosmarinus officinalis (rosemary) and one of the endemic Hypericum vesiculosum, against metal’s toxicity after consumption/coadministration of each beverage with the lead solution, for 4 weeks. H. vesiculosum has never been studied before for its phenolic content, nor for its biological actions. Our results showed that the two beverages are rich in polyphenols, with H. vesiculosum been richer than R. officinalis. Moreover, the use of two spectrometric methods (Atomic Absorption Spectrometry/AAS, Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry/ICP-MS) indicated that lead accumulates in adult mice brain, which was not affected after its co-administration with each beverage. Furthermore, the study of cognitive function, as assessed by Passive Avoidance test and determination of AChE activity in whole mice brain and cerebellum, [SS (salt soluble) fraction which contains the G1 isoform of AChE; and DS (detergent soluble) fraction which contains the G4 isoform of AChE that is very important for the neural system], demonstrated that: (a) lead exerts its neurotoxic effects by causing learning and memory deficits and dysfunction of the cholinergic system. The decrease of AChE activity may be due to the degeneration of the cholinergic neurons in the hippocampus and cerebellum; (b) Both beverages inhibit AChE activity, with rosemary being more effective and tissue-specific, while no effect was observed on learning/memory, after consumption of the two beverages. Only rosemary showed a positive effect that wasn’t, however, statically important; (c) The co-administration of each beverage with the lead solution caused important changes in AChE activity (especially in the G4 isoform), and R. officinalis was more effective than H. vesiculosum. Both beverages showed similar protective effects against Pb-induced cognitive dysfunctions in mice.

Πολλοί περιβαλλοντικοί παράγοντες μελετώνται εδώ και δεκαετίες για τις επιπτώσεις τους στο νευρικό σύστημα. Περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως ο μόλυβδος (Pb) έχει δειχθεί ότι εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία ασθενειών όπως η νόσος Alzheimer προκαλώντας νευροεκφύλιση σε ενήλικους αλλά και αναπτυσσόμενους οργανισμούς. Το περιβάλλον όμως είναι επιπλέον πλούσιο σε προστατευτικούς παράγοντες όπως τα εκχυλίσματα διαφόρων φυτών της ελληνικής επικράτειας τα οποία μάλιστα αποτελούν και σημαντική πηγή εσόδων σε περιπτώσεις όπως του κρόκου της Κοζάνης. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της πόσης μολύβδου (500ppm) για 14 και 28 ημέρες, η πόση αφεψήματος του φυτού Crocus sativous για 28 ημέρες και η χορήγησή τους σε σειρά για 14 και 14 μέρες αντίστοιχα, από ενήλικους αρσενικούς μύες. Συγκεκριμένα διερευνήθηκαν οι συμπεριφορικές καταστάσεις άγχος/φόβος και τάση για κατάθλιψη καθώς και οι βιοχημικοί δείκτες ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράση (AChE), συγκέντρωση της γλουταθειόνης (GSH) και υπεροξείδοση των λιπιδίων μέσω της συγκέντρωσης της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA). Αναλυτικά, οι συμπεριφορικές καταστάσεις άγχος φόβος μελετήθηκαν με τη χρήση των δοκιμασιών του υπερυψωμένου λαβυρίνθου και του θιγμοτακτισμού και η επαγωγή καταθλιπτικής τάσης με τη χρήση της δοκιμασίας της εξαναγκασμένης κολύμβησης. Η ενεργότητα του ενζύμου AChE μετρήθηκε με τη χρήση της χρωματομετρικής μεθόδου του Ellman σε διαλυτό σε άλας κλάσμα (SS) [περιέχει κυρίως την G1 ισομορφή του ενζύμου] και διαλυτό σε απορρυπαντικό κλάσμα (DS) [περιέχει κυρίως την G4 ισομορφή του ενζύμου] του ιστού. Η συγκέντρωση της γλουταθειόνης προσδιορίστικέ με τη φθορισμομετρική μέθοδο των Mokrasch LC. & Teschke EJ. (1984), η οποία βασίζεται στο σχηματισμό φθορίζοντος συμπλόκου μετά την αντίδραση της ο- φθαλαλδεΰδης με την γλουταθειόνη και ιστιδυλ- ενώσεις. Τέλος η υπεροξείδωση των λιπιδίων μελετήθηκε μέσω της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA), η οποία αποτελεί το κύριο προϊόν της υπεροξείδωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Ο προσδιορισμός της έγινε φθορισμομετρικά λόγω του συμπλόκου που δημιουργείται όταν η ίδια αντιδρά με το θειοβαρβιτουρικό οξύ. Οι παραπάνω μελέτες έγιναν στους ιστούς φλοιός, παρεγκεφαλίδα, μεσεγκέφαλος, ιππόκαμπος, ραβδωτό και ήπαρ ενήλικων αρσενικών μυών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το βάρος των πειραματοζώων δεν επηρεάζεται κατά τη διάρκεια του χειρισμού, η πόση του Pb για 28 και 14 ημέρες προκάλεσε αγχογενή συμπεριφορά και επαγωγή του φόβου στα πειραματόζωα καθώς και επαγωγή καταθλιπτικής τάσης. Η χορήγηση του κρόκου στους μύες μάρτυρες σχετίζεται με αγχολυτική δράση αλλά όχι με αντικαταθλιπτική δράση. Αντικαταθλιπτική του δράση παρατηρείται μόνο στην περίπτωση που ακολούθησε τη χορήγηση του μολύβδου για 14 ημέρες. Επίσης η χορήγηση Pb προκάλεσε αναστολή της ενερότητας και των δύο ισομορφών του ενζύμου με ιστοειδικό τρόπο, η πόση του αφεψήματος του φυτού οδήγησε σε θετική δράση σε σχέση με την ενεργότητά του τόσο όταν χορηγήθηκε μόνο του όσο και κατά τη χορήγηση του μετά από το Pb (με ιστοειδικό τρόπο δράσης). Αξίζει να σημειωθεί ότι η δράση του μολύβδου μπορεί να είναι άμεση προκαλώντας νευροεκφύλιση είτε έμμεση επεμβαίνοντας σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια που επειρεάζουν την ενεργότητα του ενζύμου. Αναφορικά με τη συγκέντρωση της γλουταθειόνης ο μόλυβδος όταν χορηγήθηκε έδρασε ιστοειδικά, προκαλώντας μείωση της ενεργότητας του ενζύμου ενώ δεν παρατηρήθηκε δράση του φυτικού αφεψήματος επι του ενζύμου. Τέλος η υπεροξείδωση των λιπιδίων αυξήθηκε ιστοειδικά από την χορήγηση του Pb ενώ αντίθετα περιορίστηκε από την πόση του αφεψήματος με επίσης ιστοειδικό τρόπο. Συνοψίζοντας, στην παρούσα εργασία παρατηρήθηκε αρνητική δράση του μολύβδου σε συμπεριφορικό και βιοχημικό επίπεδο, θετική δράση του κρόκου στις παραπάνω διεργασίες καθώς επίσης θετική δράση κατά περίπτωση και της σε σειρά χορήγησης του αφεψήματος κρόκου μετά από χορήγηση μολύβδου. / Various environmental factors have been studied decades ago due to their effects on nervous system. It has been shown that lead (Pb) is implicated in the pathophysiology of diseases such as Alzheimer’s disease, resulting in neurodegeneration in adult and developing organisms. Also, the environment is rich in protective agents, such as various plant extracts of the Greek flora (e.g. Greek saffron which is cultivated at Kozani region in northern Greece) that present simultaneous financial interest. Aim of the present study was to investigate the effects of oral administration of lead (500ppm) for 14 and 28 days, Crocus sativous infusion for 28 days and lead (for 14 days) plus Crocus sativous infusion (for 14 days), in adult male mice. Briefly, behavioral parameters of anxiety/fear and depression-like and acetylcholinesterase (AChE) activity, glutathione (GSH) and lipid peroxidation (malondialdehyde, MDA) levels, were evaluated. In detail, anxiety/fear and depression-like behavior were assessed by using the elevated plus maze and thigmotaxis tests and forced swimming test, respectively. AChE activity was determined in salt soluble (SS) [contains mainly G1 isoform of the enzyme] and detergent soluble (DS) [contains mainly the G4 isoform of the enzyme] fractions of tissue homogenates, by Ellman’s colorimetric method. Glutathione content was measured fluorometrically according to the procedure of Mokrasch LC. & Teschke EJ. (1984), which is based on the formation of a fluorescent complex after reaction with o-phthalaldehyde and histidyl compounds. Also, lipid peroxidation levels were determined fluorometrically by measuring malondialdehyde (MDA) concentration after its reaction with thiobarbituric acid, as MDA is the main product of polyunsaturated fatty acid peroxidation. The biochemical assessments were performed in cortex, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum and liver of adult male mice. Our results showed that there were no effects on mouse body weight during the experimental period and Pb intake for 28 and 14 days induced anxiety/fear and depression-like behavior. Saffron administration to control mice is associated with anxiolytic but not antidepressant efficacy. Antidepressant effects of saffron were observed only in mice pre-treated with lead for 14 days. Also, Pb intake caused inhibition of both AChE isoforms’ activity and saffron infusion that was administered either alone or under Pb toxicity, beneficially affected enzyme activity, in a tissue-specific way. It should be noticed that lead may act directly, inducing neurodegeneration or indirectly, interfering with various metabolic pathways that influences AChE activity. Moreover, Pb intake reduced glutathione content in a tissue-specific way, while no effect was observed after saffron administration. Finally, lipid peroxidation levels were increased and decreased tissue specifically, after Pb and saffron administration, respectively. Conclusively, the current study presents adverse effects of lead on behavioral and biochemical parameters and beneficial effects of saffron infusion when it was administered either alone or under Pb toxicity.