Η αιμοποιητική φωλαιά (hematopoietic stem cell niche) περιέχει οστεοβλάστες, οι οποίοι ρυθμίζουν τη φυσιολογική αιμοποίηση. Ωστόσο, λίγα στοιχεία είναι γνωστά, έως τώρα, για το ρόλο των οστεοβλαστών στη διαδικασία της αιμοποίησης σε ασθενείς με Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ). Το ΜΔΣ, αποτελεί μια ετερογενή ομάδα κλωνικών αιματολογικών διαταραχών, με αυξημένο κίνδυνο εκτροπής προς Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία (ΟΜΛ). Μελέτες σε ex-vivo συστήματα καλλιεργειών (co-cultures) περιγράφουν την επίδραση των μεσεγχυματικών κυττάρων (“feeder cells”) στο δυναμικό πολλαπλασιασμού, στη μεταναστευτική ικανότητα, καθώς και στη διατήρηση (stemness) των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (HSCs) φυσιολογικών δοτών. Η μελέτη αυτή στοχεύει στη διερεύνηση των βιολογικών χαρακτηριστικών των οστεοβλαστών από ασθενείς με ΜΔΣ καθώς και τις αλληλεπιδράσεις φυσιολογικών HSCs και οστεοβλαστών ασθενών με ΜΔΣ. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκε ένα σύστημα δισδιάστατης καλλιέργειας (2-D culture system) χρησιμοποιώντας οστεοβλάστες που παρήχθησαν από μεσεγχυματικά κύτταρα μυελού των οστών (human marrow mesenchymal stem cells-MSCs). Τα MSCs απομονώθηκαν από το μυελό των οστών ασθενών με ΜΔΣ και υγιών δοτών και καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο. Ακολούθησε επαγωγή της διαφοροποίησης των MSCs, μετά από συνεχόμενες καλλιέργειες σε οστεοβλάστες. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 13 δείγματα μυελού των οστών από ασθενείς με ΜΔΣ (6 RA, 3 RAEBI, 2 RAEBII, 1 5q- και 1 υποπλαστικό MDS) και 8 δείγματα μυελού φυσιολογικών μαρτύρων όμοιας ηλικίας. Για τη μελέτη της επίδρασης των οστεοβλαστών από ασθενείς με ΜΔΣ στην αιμοποίηση χρησιμοποιήθηκαν φυσιολογικά HSCs από κινητοποιημένο περιφερικό αίμα υγιών δοτών (mPB, n=4), τα οποία τοποθετήθηκαν πάνω στους ήδη εγκατεστημένους οστεοβλάστες (osteoblast confluent monolayer cultures). Τα MSCs και οι οστεοβλάστες που αναπτύχθηκαν ελέγχθηκαν μορφολογικά και ανοσοφαινοτυπικά, με τη χρήση μικροσκοπίας και κυτταρομετρίας ροής αντίστοιχα. Μονοπύρηνα κύτταρα από δείγματα κινητοποιημένου περιφερικού αίματος υγιών δοτών τοποθετήθηκαν στο δισδιάστατο καλλιεργητικό σύστημα, σε καλλιεργητικό υλικό αιμοποιητικών κυττάρων, χωρίς την εξωγενή προσθήκη κυτταροκινών. Με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής ελέγχθηκε η έκφραση των μορίων που σχετίζονται με την προσκόλληση των αιμοποιητικών κυττάρων στην αιμοποιητική φωλαιά καθώς και την εγκατάσταση και διατήρησή τους σε αυτή. Ο έλεγχος έγινε στις 36 ώρες και τις 7 ημέρες συγκαλλιέργειας και αφορούσε τα μόρια CXCR4, το οποίο ρυθμίζει την άμεση πρόσδεση των HSCs στην φωλαιά κατά τη διαδικασία του “homing”, CD49d (Very Late Antigen-4- VLA4) και CD49e (Very Late Antigen-5- VLA5), τα οποία παρέχουν σήματα επιβίωσης ή προάγουν την ενεργοποίηση μιας φάσης ηρεμίας (quiescence) στα HSCs μετά την είσοδο τους στη φωλαιά (localization). Η έκφραση των μορίων αυτών μελετήθηκε στους υποπληθυσμούς των CD34+, CD34+/CD38+ και CD34+/CD38- κυττάρων. Παράλληλα εκτιμήθηκε το ποσοστό (συχνότητα) των CD34+ αιμοποιητικών κυττάρων καθώς επίσης και η προσκόλλησή τους στους οστεοβλάστες. Μετά τη συγκαλλιέργεια, οι οστεοβλάστες που προήλθαν από υγιείς δότες προκάλεσαν τον πολλαπλασιασμό των CD34+ κυττάρων των φυσιολογικών αιμοποιητικών κυττάρων που τοποθετήθηκαν πάνω στο εγκατεστημένο στρώμα των οστεοβλαστών (3-fold και 9-fold αύξηση στις 36ώρες και τις 7ημ., αντίστοιχα). Αύξηση επίσης, παρατηρήθηκε (2 fold αύξηση) στα CD34+ κύτταρα στις συγκαλλιέργειες των 36h, φυσιολογικών HSCs με οστεοβλάστες που παρήχθησαν από ασθενείς με ΜΔΣ, ενώ καμία διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των διαφορετικών υποτύπων ΜΔΣ. Στις 7 ημέρες συγκαλλιέργειας από την άλλη, δεν 12 παρατηρήθηκε καμία διαφορά στη συχνότητα εμφάνισης ενός πιο άωρου φαινοτύπου των φυσιολογικών HSCs που αναπτύχθηκαν σε οστεοβλάστες από ασθενείς με χαμηλού κινδύνου ΜΔΣ (low risk MDS). Αντιθέτως, τα CD34+ κύτταρα αυξήθηκαν κατά πολύ (16- fold αύξηση), όταν φυσιολογικά HSCs, τοποθετήθηκαν σε οστεοβλάστες ασθενών με υψηλού κινδύνου ΜΔΣ (high risk MDS). Επιπλέον, παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης των μορίων CXCR4, CD49d και CD49e στα CD34+ κύτταρα μετά από συγκαλλιέργεια φυσιολογικών HSCs και οστεοβλαστών από υγιείς δότες, συγκριτικά με τα επίπεδα έκφρασης των μορίων αυτών πριν την τοποθέτηση τους στο σύστημα συγκαλλιέργειας. Η αύξηση της έκφρασης του μορίου CXCR4 ήταν λιγότερο εμφανής στην περίπτωση συγκαλλιέργειας των φυσιολογικών HSCs με οστεοβλάστες από ασθενείς με ΜΔΣ, όπου η μεγαλύτερη διαφορά παρατηρήθηκε στο σύστημα που περιείχε τους οστεοβλάστες από ασθενείς χαμηλού κινδύνου ΜΔΣ (3- και 1,7- fold αύξηση στις 7ημέρες καλλιέργειας με οστεοβλάστες από υγιείς δότες και χαμηλού κινδύνου ΜΔΣ ασθενείς, αντίστοιχα). Το πρότυπο έκφρασης των μορίων CD49d και CD49e ήταν όμοιο στα κύτταρα που τοποθετήθηκαν τόσο σε οστεοβλάστες προερχόμενους από υγιείς δότες, όσο και οστεοβλάστες από ΜΔΣ ασθενείς. Ο φαινότυπος, τόσο όσον αφορά τα μορφολογικά όσο και τα ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά, των MSCs ήταν ίδιος και στις δυο ομάδες μελέτης, ενώ η διαφοροποίηση των MSCs προς οστεοβλάστες ήταν όμοια τόσο στα MSCs που προήλθαν από φυσιολογικούς δότες όσο και σε αυτά που προήλθαν από ασθενείς με ΜΔΣ, δείχνοντας παρόμοια έκφραση των ειδικών οστεοβλαστικών πρωτεϊνών αλλά και της διαδικασίας της ενασβεστοποίησης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που λάβαμε, οι οστεοβλάστες από υγιείς δότες προώθησαν την αύξηση του ποσοστού των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων και οδήγησαν στην επαγωγή της έκφρασης του μορίου CXCR4, ενός πολύ σημαντικού μορίου για τη μετανάστευση, την εγκατάσταση αλλά και την ανάπτυξη. Ωστόσο, η διαφορετική δραστηριότητα, τόσο όσον αφορά το ποσοστό των CD34+ όσο και την έκφραση του μορίου CXCR4, όταν τα φυσιολογικά αιμοποιητικά κύτταρα συγκαλλιεργήθαν με οστεοβλάστες που προήλθαν από ασθενείς με ΜΔΣ, οδηγεί στην υπόθεση ότι υπάρχει μεταβολή στη λειτουργία των οστεοβλαστών, οπότε προβλέπεται και μια επακόλουθη αλλαγή στη ρύθμιση της εγκατάστασης των HSC στην αιμοποιητική φωλαιά, στους ασθενείς με ΜΔΣ. / The hematopoietic stem cell niche contains osteoblasts that regulate normal hematopoiesis. However, little is known about the role of osteoblasts in MDS hematopoiesis so far. Myelodysplastic syndrome comprises a heterogeneous group of clonal stem cell disorders with dismal prognosis and difficulty in their therapeutic approach, which is characterized by ineffective hematopoiesis. It appears with dysplastic hematopoietic cells, peripheral blood cytopenias and high risk of evolution to acute myeloid leukemia (AML). Data derived from ex vivo co-culture systems using mesenchymal stromal cells as a feeder cell layer suggest that cell-cell contact has a significant impact on the expansion, migratory potential and “stemness” of hematopoietic stem cells. In this study, we investigated the biological characteristics of osteoblasts from MDS patients and the interactions between these cells and normal hematopoietic stem cells (HSCs). Osteoblasts were differentiated from marrow MSCs from 13 MDS patients (6 RA, 3 RAEBI, 2 RAEBII, 1 5q- and 1 hypoplastic MDS) and 8 age-matched healthy individuals. To study the effect of MDS osteoblasts on hematopoiesis, normal HSCs from mobilized peripheral blood from healthy individuals (n=4) were seeded onto osteoblast confluent monolayer cultures using a culture medium appropriate for the culture of HSCs, without the exogenous addition of cytokines. We studied the morphology and immunophenotype of MSCs and osteoblasts by microscopy and flow cytometric analysis, respectively. Cytometric analyses of homing associated molecules were performed 36h and 7d later. These molecules are CXCR4, which regulates the direct adhesion of HSCs to the bone marrow niche during “homing”, CD49d (Very Late Antigen-4- VLA4) and CD49e (Very Late Antigen-5- VLA5), which produce survival signals or promote the maintenance of a quiescent state for HSCs after entering the stem cell niche (localization). We investigated the expression of these molecules in CD34+, CD34+/CD38+ and CD34+/CD38- cell populations. Furthermore we studied the frequency of CD34+ hematopoietic cells and also their ability to adhere osteoblasts.Osteoblasts from healthy individuals increased the frequency of CD34+ cells by 3- and 9-fold increase in normal hematopoietic cells after 36h and 7d co-cultures respectively. A 2-fold increase was also seen in CD34+ cells when normal HSCs grown on MDS-osteoblasts for 36h and no difference was seen between the MDS subtypes. When the culture period was extended to 7d, there was no change in the frequency of immature phenotype of normal HSCs in osteoblast cultures from low-risk MDS patients. In contrast, CD34+ cells increased several fold (16-fold increase) when normal HSCs were cultured on high-risk MDS 14 osteoblasts, twice the values obtained in osteoblast co-cultures from healthy individuals and low risk patients. The expression of adhesion molecules CXCR4, CD49d and CD49e on CD34+ cells from normal HSCs was increased in co-cultures with osteoblasts from healthy individuals compared to the values obtained before culture (3-fold increase at 7d). The increase in CXCR4 expression was less pronounced in the presence of osteoblasts from MDS patients with the largest difference being found in low-risk MDS patients (1,7-fold increase at 7d). The expression pattern of CD49d and CD49e was identical between cells grown on MDS- and normal- osteoblast co-cultures.The morphological and immunophenotypical analysis of MSCs show the same results for the two study groups, while the differentiation of MSCs to osteoblasts was similar for both healthy individuals and MDS patients, after having similar expression of bone specific proteins and mineralization activity. According to our data, osteoblasts from healthy individuals promoted the expansion of immature hematopoietic progenitors and induced the cell surface expression of CXCR4, an important molecule in HSCs homing, retention and development. However, the different expression of CXCR4 and the change in frequency of CD34+ cells that were detected when normal HSCs co-operated with MDS-osteoblasts, suggests alteration in osteoblast function and the subsequent regulation of the HSC residency in the niche in MDS patients compared with healthy individuals.

Σκοπός: Πρόσφατα δεδομένα, υποδεικνύουν ότι διαταραχή της ισορροπίας του λιπιδικού μεταβολισμού επηρεάζει τη λειτουργία των κυττάρων του οστού, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη εκφυλιστικών και μεταβολικών νόσων, όπως η οστεοπόρωση. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε τον ρόλου της απολιποπρωτεΐνης Ε (apoE), βασικού συστατικού του συστήματος μεταβολισμού των χυλομικρών και της VLDL (Very Low-Density Lipoprotein), στη ρύθμιση της οστικής ανακατασκευής και στην παθογένεια της οστεοπόρωσης, σε πειραματικά μοντέλα ποντικιών που έλαβαν δίαιτα πλούσια σε λιπαρά. Υλικά και μέθοδοι: Για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικών με έλλειψη του γονιδίου της apoE (apoE-/-) και αγρίου τύπου (C57BL/6) (ομάδα ελέγχου) που τους χορηγήθηκε για 24 εβδομάδες δίαιτα δυτικού τύπου (WTD) πλούσια σε λιπαρά (10 ζώα/ομάδα). Επιλέχθηκε η δίαιτα δυτικού τύπου διότι προσομοιάζει τις διατροφικές συνήθειες του σύγχρονου δυτικού κόσμου. Κάθε 6 εβδομάδες γινόταν μέτρηση σωματικού βάρους. Δύο και επτά ημέρες προ της ευθανασίας πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση καλσεΐνης. Την 24η εβδομάδα τα ζώα θυσιάστηκαν, απομονώθηκαν χειρουργικά το μηριαίο οστό και οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι και έγιναν ιστολογικές και ιστομορφομετρικές αναλύσεις. Με τη χρήση microCT scanner (στατική ιστομορφομετρία) εκτιμήθηκε η ποιότητα και η ποσότητα του σπογγώδους και του φλοιώδους οστού. Με τη χρώση TRAP και την εναπόθεση καλσεΐνης (δυναμική ιστομορφομετρία) ελέγχθηκε η οστική αποδόμηση και ο ρυθμός σύνθεσης νεοσχηματιζόμενου οστού, αντίστοιχα. Με τη χρήση φασματοσκοπίας Raman, αξιολογήθηκε η κατάσταση του δικτύου κολλαγόνου των μηριαίων οστών. Επιπλέον, μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών (BMMSC) απομονώθηκαν από το μηριαίο οστό των πειραματόζωων και καλλιεργήθηκαν με σκοπό την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, μορίων που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική λειτουργία [(Runx2, Osterix (Osx), Κολλαγόνο I τύπου 1a (Col1a1)], στην οστεοκλαστική λειτουργία [osteprotegerin (OPG), RANK-Ligand (RANKL), λόγος OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ] καθώς και στην λιπογένεση [Peroxisome-Proliferator-Activated receptor γ (PPARγ)]. Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε τις μοριακές τεχνικές Western Blot και κυτταρομετρία ροής ενώ για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA χρησιμοποιήσαμε τη RT-PCR. Αποτελέσματα: 1) Τα apoE-/- πειραματόζωα που έλαβαν WTD δεν ανέπτυξαν παχυσαρκία σε αντίθεση με τα C57BL/6 WTD. 2) Στον μυελό των οστών των apoE-/- WTD ποντικιών παρατηρήθηκε πλήρης απουσία λιποκυττάρων, σε αντίθεση με τα C57BL/6 WTD ζώα των οποίων ο μυελός των οστών ήταν πλούσιος σε λιποκύτταρα. 3) Ο αριθμός των οστεοκλαστών ήταν σημαντικά αυξημένος, ενώ των οστεοβλαστών σημαντικά ελαττωμένος στα apoE-/- WTD πειραματόζωα σε σύγκριση με τα C57BL/6 WTD. 4) Η στατική και η δυναμική ιστομορφομετρία έδειξαν ότι τα apoE-/- ποντίκια, σε δίαιτα δυτικού τύπου, εμφάνισαν σημαντική ελάττωση της οστικής τους μάζας. 5) Το δίκτυο του κολλαγόνου στα apoE-/- WTD ποντίκια εμφανίστηκε σημαντικά πιο σκληρό, πιο άκαμπτο και κατά συνέπεια λιγότερο ελαστικό συγκρινόμενο με αυτό των C57BL/6 WTD. 6) Τα apoE-/- WTD ποντίκια, εμφάνισαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης του ρυθμιστή της οστεοβλαστογένεσης Runx2, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, συγκρινόμενα με τα C57BL/6 WTD ζώα. 7) Τα επίπεδα έκφρασης των ρυθμιστών της οστικής ανακατασκευής RANK και RANKL, ήταν σημαντικά αυξημένα στα apoE-/- WTD ποντίκια σε σχέση με τα C57BL/6 WTD ποντίκια. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της OPG καθώς και η αναλογία OPG/RANKL, ήταν σημαντικά μειωμένα στα apoE-/- WTD ποντίκια. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των οστεοκλαστικών ρυθμιστών cathepsin K και TRAP μεταξύ των δύο υπό εξέταση ομάδων ζώων. 8) Ο ρυθμιστής της λιπογένεσης PPARγ, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, ήταν σημαντικά μειωμένος στα apoE-/- WTD ποντίκια σε σχέση με τα C57BL/6 WTD. Συμπεράσματα: 1) Η έλλειψη της apoE εμπλέκεται στην ελάττωση της οστικής μάζας σε ποντίκια υπό δίαιτα δυτικού τύπου 2) Η apoE φαίνεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της λειτουργίας των οστεοβλαστών, ενώ δεν είναι σαφής ο ρόλος της στη λειτουργία των οστεοκλαστών 3) Η έλλειψη της apoE, προστατεύει από την παχυσαρκία αλλά και την εναπόθεση λιποκυττάρων στον μυελό των οστών, κατόπιν λήψεως δίαιτας πλούσιας σε λιπαρά. 4) Η apoE ρυθμίζει τη διαφοροποίηση των MSC’s σε ερχόμενο στάδιο, καθώς η έλλειψή της επηρεάζει τόσο την οστεοβλαστική όσο και τη λιποβλαστική διαφοροποίηση, μετά από κατανάλωση δίαιτας δυτικού τύπου, πλούσιας σε λιπαρά. / Introduction: Recent data suggest that lipid metabolism imbalances affect bone cell function and therefore may result in the development of metabolic diseases such as osteoporosis. In the present study, we investigated the role of apoE, a plasma protein playing cardinal role in lipoprotein metabolism, in the regulation of osteoblasts, osteoclasts and lipoblasts and in the pathogenesis of osteoporosis. Material and Methods: We used apoE deficient (apoE-/-) and wild type (C57BL/6) mice (10 animals/ group). Mice were fed with standard western-type diet (WTD) for 24 weeks. Body weight measurements were obtained every 6 weeks. Two and seven days before euthanasia calcein was injected intraperitonealy for the determination of new bone formation rate. Following sacrifice, lumbar vertebrae and femora were removed and quantitative/qualitative study of the cortical and cancellous bone was performed using microCT scanner. In the tissue sections we perfomed histological (H&E) and histochemical (TRAP) analyses. Static and dynamic histomorphometry were employed for the determination of bone quality and bone cell function. Using Raman spectroscopy, the quality and biochemical composition of the collagen fibers of the examined femora were evaluated. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) were isolated from mice femora and then assessed for the expression of the osteoblastic (Runx2, OSX, Col1a1), osteoclastic (OPG, RANKL, OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin K) and lipoblastic (PPARγ) regulators using Western Blotting, Flow Cytometry and RT-PCR. Results: 1) apoE-/- mice under WTD did not develop obesity and their BM was devoid of adipocytes, in contrast to the control mice. 2) Osteoclast number was significantly increased, while bone synthesis was significantly reduced in apoE-/- compared to the C57BL/6 mice that consumed WTD. 3) Static and dynamic histomorphometry showed that apoE-/- mice had sugnificantly reduced bone mass and impared bone architecture. 4) The collagen network in apoE-/- WTD mice was significantly stiffer and more rigid compared to the C57BL/6 WTD mice. 5) BMMSCs from apoE-/- WTD mice displayed significantly reduced Runx2 expression at both protein and mRNA levels compared to the control group. 6) The expression levels of RANK and RANKL, were significantly elevated in apoE-/- WTD mice compared to C57BL/6 WTD mice. In contrast, the gene expression levels of OPG and the ratio OPG / RANKL, were statistically significantly reduced in apoE-/- WTD mice. No significant differences were observed in the expression of cathepsin K and TRAP genes between the two test groups of animals. 7) The expression of the major lipoblastic regulator PPARγ was significantly reduced in apoE-/- WTD compared to their WT counterparts. Conclusions: 1) Low levels of apoE result in reduced bone mass following WTD. 2) apoE is implicated in the regulation of osteoblast function; nevertheless, its role in osteoclast function warrants further investigation. 3) The absence of apoE prevents obesity and BM adipocity after the consumption of WT (high-fat) diet. 4) apoE deficiency, regulates MSC differentiation at early stages, since its absence affects both the osteoblastic and lipoblastic differentiation, after the consumption of high fat diet.

Με την ηλικία, νόσοι που σχετίζονται με δομικά ελαττώματα των οστών που οφείλονται σε κατάγματα ή εκφυλισμούς, αναμένονται να αυξηθούν σε συχνότητα. Επιπλέον, η αύξηση του προσδόκιμου ζωής επιβάλλει τη χρήση βελτιωμένων συνθετικών υλικών για την αντικατάσταση νοσούντων οστών, για παράδειγμα κατά τη χρήση μεταλλικών ράβδων σε περιπτώσεις βλαβών μη-ένωσης και στις χειρουργικές επεμβάσεις αντικατάστασης ισχίου. Τα υπάρχοντα υλικά σχετίζονται με υπο-βέλτιστη οστεοενσωμάτωση και προβληματική μακροπρόθεσμη επιβίωση του σύνθετου εμφυτεύματος. Για το λόγο αυτό, η βελτίωση των υλικών επικάλυψης και των μηχανικών ιδιοτήτων των νέων, κυτταρικά συμβατών, συστατικών είναι επιτακτική. Για να αντιμετωπιστεί αυτό το πρόβλημα, υλικά νέας γενιάς είναι διαθέσιμα, ενδεχομένως με καλύτερες ιδιότητες ως υπόστρωμα προσκόλλησης για τα κύτταρα των οστών. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να εκτιμηθεί η ικανότητα ενός νέου, ειδικά κατασκευασμένου υλικού απο νανοσωλήνες άνθρακα ως προς τη διατήρηση της σωστής έκφρασης των χαρακτηριστικών γονιδίων των οστεοβλαστών, με έμφαση στην έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στις αλληλεπιδράσεις οστεοβλαστών-υποστρώματος και έτσι προωθούν την σταθερή προσκόλληση των κυττάρων στο υπόστρωμα. Παράλληλα, ερευνήσαμε και την επίδραση της μηχανικής καταπόνησης στην έκφραση των γονιδίων αυτών σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε νανοσωλήνες άνθρακα. Χρησιμοποιήσαμε δύο ανεξάρτητες απομονώσεις οστεοβλαστών διαφοροποιημένων από ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών, δηλαδή προχωρήσαμε σε δύο ανεξάρτητα πειράματα. Και στα δύο, για να γίνει ο πειραματισμός όσο εγγύτερα στις πραγματικές συνθήκες, καλλιεργήσαμε τους οστεοβλάστες υπο στατικές συνθήκες όσο και υπό συνθήκες μηχανικής καταπόνησης, για την προσομοίωση "in vivo" συνθηκών, και συγκρίθηκε η γονιδιακή έκφραση οστεοβλαστών που καλλιεργήθηκαν σε πλαστικό έναντι επιφανειών επικαλυμμένων με νανοσωλήνες άνθρακα. Απομονώσαμε το RNA από τους οστεοβλάστες μετά από την καλλιέργειά τους για 3 και 24 ώρες και προσδιορίσαμε, χρησιμοποιώντας την τεχνική real time RΤ-PCR, την έκφραση των ακόλουθων γονιδίων σε επίπεδο mRNA: κολλαγόνο-α1, αλκαλική φωσφατάση, οστεοποντίνη, βινκουλίνη και ιντεγκρίνες α4, αV, β1 και β3. Συνολικά, τα αποτελέσματα της ανάλυσης του κυτταρικού mRNA έδειξαν ότι η γονιδιακή έκφραση μετά από 3 ώρες καλλιέργειας είναι πολύ μεταβλητή, και οριστικά συμπεράσματα δεν θα μπορούσαν να εξαχθούν. Ωστόσο, αφού δίνεται η ευκαιρία στα κύτταρα να προσκολληθούν σταθερά, στις 24 ώρες, κατέστη σαφές ότι: α) η κυτταρική ταυτότητα των διαφοροποιημένων οστεοβλαστών διατηρείται, με βάση το γεγονός ότι η έκφραση αυτών των χαρακτηριστικών γονιδίων, που σχετίζονται με την προσκόλληση, συντηρείται σωστά, αν και σε διάφορα επίπεδα, β) σε στατικές συνθήκες, το επίπεδο της έκφρασης των εξετασθέντων γονιδίων είναι κατά τι χαμηλότερο σε οστεοβλάστες που καλλιεργηθήκαν σε επικαλυμμένη επιφάνεια με νανοσωλήνες άνθρακα σε σύγκριση με τα κύτταρα που καλλιεργηθήκαν σε πλαστικό, και γ) σε σύγκριση με τις στατικές συνθήκες, το μηχανικό ερέθισμα ενισχύει την έκφραση αυτών των γονιδίων οστεοβλαστών όταν καλλιεργούνται σε νανοσωλήνες άνθρακα, για την επίτευξη υψηλών επιπέδων mRNA έκφρασης των γονιδίων κυτταρικής προσκόλλησης. Τα αποτελέσματα της τελευταίας ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης είναι επίσης συμβατά με τις συνολικές ποσότητες RNA που λαμβάνονται, υποστηρίζοντας έμμεσα τη σταθερή προσκόλληση και επιβίωση των οστεοβλαστών σε νανοσωλήνες άνθρακα υπο συνθήκες μηχανικής καταπόνησης. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι το νέο υπόστρωμα από νανοσωλήνες άνθρακα που αναλύθηκε σε μηχανικές συνθήκες διέγερσης που προσομοιάζουν, κατά το δυνατόν, συνθήκες καταπόνησης in vivo, συνιστά ένα κατάλληλο κυτταρικό υπόστρωμα, συμβατό με την επιβίωση των οστεοβλαστών, τη διαφοροποίηση, την ανάπτυξη και την σταθερή προσκόλλησή τους στο υπόστρωμα νανοσωλήνων. Η εργασία αυτή υποστηρίζει την πιθανότητα της χρήσης αυτών των νέων υλικών στο μέλλον για την επικάλυψη σκελετικών προσθέσεων, με σκοπό την απόκτηση βέλτιστης οστεοενσωμάτωσης. / As population ages, diseases related to bone structural defects due to fracture or degeneration are expected to increase in frequency. In addition, the increase in life expectancy necessitates better composite materials for replacement of diseased/fractured bones, for example during the use of metal rods for non-union defects and in hip replacement surgery. The existing materials are associated with sub-optimal osseointegration and problematic long-term survival of the composite graft. For this reason, improvement of coating materials and engineering of novel cell-compatible components is imperative. To address this problem, new-generation materials are available, with possibly better bone cell adherence properties. The Aim of this work was to evaluate the ability of a novel, specially-constructed carbon nanotube material to sustain proper expression of characteristic osteoblast genes, with emphasis on the expression of genes that are functionally involved in osteoblast-matrix interactions and promote firm cell adherence to substrate. We used two independent isolates of osteoblasts differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells, ie we proceeded to two independent experimental runs. In both, to make the experimentation more context-relevant, we grew the osteoblasts in static as well as under mechanical strain, to simulate in vivo conditions, and also compared gene expression in osteoblasts grown on plastic versus carbon nanotube-coated surface. We isolated RNA from the osteoblasts at 3 hours and 24 hours after seeding them on the culture vessels and determined, using real-time RT-PCR techniques, the level of expression of the following genes at the mRNA level: α1-collagen, alkaline phosphatase, osteopontin, vinculin, and integrins α4, αV, β1 and β3. All in all, the results on cell mRNA analysis indicated that gene expression at 3h post-plating is too variable and no firm conclusions could be drawn. However, once the cells are given a chance to firmly adhere, at 24h, it became clear that: a) osteoblast cell identity is maintained, based on the fact that the expression of these characteristic matrix- and adhesion-related genes is properly maintained, albeit in various levels, b) in static conditions, the level of expression of the examined genes is lower in cells grown on nanotube-coated surface compared to cells grown on plastic, and c) in comparison to static conditions, mechanical stimulation enhances expression of these genes in osteoblasts grown on nanotubes, to attain robust levels of cell adherence gene mRNA expression. The results of the latter gene expression analysis are also compatible with total RNA quantities obtained, indirectly arguing firm osteoblast adhesion/survival on nanotubes under mechanical strain conditions. We therefore conclude that the novel carbon nanotubes assayed herein in lifelike mechanical stimulation conditions, constitute an appropriate cell-bearing surface, compatible with osteoblast survival, differentiation, growth and firm adherence to substrate. This work raises the possibility of using this novel material in the future to coat skeletal prostheses, in order to obtain improved osseointegration.