No description available.

Η αιμοποιητική φωλαιά (hematopoietic stem cell niche) περιέχει οστεοβλάστες, οι οποίοι ρυθμίζουν τη φυσιολογική αιμοποίηση. Ωστόσο, λίγα στοιχεία είναι γνωστά, έως τώρα, για το ρόλο των οστεοβλαστών στη διαδικασία της αιμοποίησης σε ασθενείς με Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ). Το ΜΔΣ, αποτελεί μια ετερογενή ομάδα κλωνικών αιματολογικών διαταραχών, με αυξημένο κίνδυνο εκτροπής προς Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία (ΟΜΛ). Μελέτες σε ex-vivo συστήματα καλλιεργειών (co-cultures) περιγράφουν την επίδραση των μεσεγχυματικών κυττάρων (“feeder cells”) στο δυναμικό πολλαπλασιασμού, στη μεταναστευτική ικανότητα, καθώς και στη διατήρηση (stemness) των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (HSCs) φυσιολογικών δοτών. Η μελέτη αυτή στοχεύει στη διερεύνηση των βιολογικών χαρακτηριστικών των οστεοβλαστών από ασθενείς με ΜΔΣ καθώς και τις αλληλεπιδράσεις φυσιολογικών HSCs και οστεοβλαστών ασθενών με ΜΔΣ. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκε ένα σύστημα δισδιάστατης καλλιέργειας (2-D culture system) χρησιμοποιώντας οστεοβλάστες που παρήχθησαν από μεσεγχυματικά κύτταρα μυελού των οστών (human marrow mesenchymal stem cells-MSCs). Τα MSCs απομονώθηκαν από το μυελό των οστών ασθενών με ΜΔΣ και υγιών δοτών και καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο. Ακολούθησε επαγωγή της διαφοροποίησης των MSCs, μετά από συνεχόμενες καλλιέργειες σε οστεοβλάστες. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 13 δείγματα μυελού των οστών από ασθενείς με ΜΔΣ (6 RA, 3 RAEBI, 2 RAEBII, 1 5q- και 1 υποπλαστικό MDS) και 8 δείγματα μυελού φυσιολογικών μαρτύρων όμοιας ηλικίας. Για τη μελέτη της επίδρασης των οστεοβλαστών από ασθενείς με ΜΔΣ στην αιμοποίηση χρησιμοποιήθηκαν φυσιολογικά HSCs από κινητοποιημένο περιφερικό αίμα υγιών δοτών (mPB, n=4), τα οποία τοποθετήθηκαν πάνω στους ήδη εγκατεστημένους οστεοβλάστες (osteoblast confluent monolayer cultures). Τα MSCs και οι οστεοβλάστες που αναπτύχθηκαν ελέγχθηκαν μορφολογικά και ανοσοφαινοτυπικά, με τη χρήση μικροσκοπίας και κυτταρομετρίας ροής αντίστοιχα. Μονοπύρηνα κύτταρα από δείγματα κινητοποιημένου περιφερικού αίματος υγιών δοτών τοποθετήθηκαν στο δισδιάστατο καλλιεργητικό σύστημα, σε καλλιεργητικό υλικό αιμοποιητικών κυττάρων, χωρίς την εξωγενή προσθήκη κυτταροκινών. Με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής ελέγχθηκε η έκφραση των μορίων που σχετίζονται με την προσκόλληση των αιμοποιητικών κυττάρων στην αιμοποιητική φωλαιά καθώς και την εγκατάσταση και διατήρησή τους σε αυτή. Ο έλεγχος έγινε στις 36 ώρες και τις 7 ημέρες συγκαλλιέργειας και αφορούσε τα μόρια CXCR4, το οποίο ρυθμίζει την άμεση πρόσδεση των HSCs στην φωλαιά κατά τη διαδικασία του “homing”, CD49d (Very Late Antigen-4- VLA4) και CD49e (Very Late Antigen-5- VLA5), τα οποία παρέχουν σήματα επιβίωσης ή προάγουν την ενεργοποίηση μιας φάσης ηρεμίας (quiescence) στα HSCs μετά την είσοδο τους στη φωλαιά (localization). Η έκφραση των μορίων αυτών μελετήθηκε στους υποπληθυσμούς των CD34+, CD34+/CD38+ και CD34+/CD38- κυττάρων. Παράλληλα εκτιμήθηκε το ποσοστό (συχνότητα) των CD34+ αιμοποιητικών κυττάρων καθώς επίσης και η προσκόλλησή τους στους οστεοβλάστες. Μετά τη συγκαλλιέργεια, οι οστεοβλάστες που προήλθαν από υγιείς δότες προκάλεσαν τον πολλαπλασιασμό των CD34+ κυττάρων των φυσιολογικών αιμοποιητικών κυττάρων που τοποθετήθηκαν πάνω στο εγκατεστημένο στρώμα των οστεοβλαστών (3-fold και 9-fold αύξηση στις 36ώρες και τις 7ημ., αντίστοιχα). Αύξηση επίσης, παρατηρήθηκε (2 fold αύξηση) στα CD34+ κύτταρα στις συγκαλλιέργειες των 36h, φυσιολογικών HSCs με οστεοβλάστες που παρήχθησαν από ασθενείς με ΜΔΣ, ενώ καμία διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των διαφορετικών υποτύπων ΜΔΣ. Στις 7 ημέρες συγκαλλιέργειας από την άλλη, δεν 12 παρατηρήθηκε καμία διαφορά στη συχνότητα εμφάνισης ενός πιο άωρου φαινοτύπου των φυσιολογικών HSCs που αναπτύχθηκαν σε οστεοβλάστες από ασθενείς με χαμηλού κινδύνου ΜΔΣ (low risk MDS). Αντιθέτως, τα CD34+ κύτταρα αυξήθηκαν κατά πολύ (16- fold αύξηση), όταν φυσιολογικά HSCs, τοποθετήθηκαν σε οστεοβλάστες ασθενών με υψηλού κινδύνου ΜΔΣ (high risk MDS). Επιπλέον, παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης των μορίων CXCR4, CD49d και CD49e στα CD34+ κύτταρα μετά από συγκαλλιέργεια φυσιολογικών HSCs και οστεοβλαστών από υγιείς δότες, συγκριτικά με τα επίπεδα έκφρασης των μορίων αυτών πριν την τοποθέτηση τους στο σύστημα συγκαλλιέργειας. Η αύξηση της έκφρασης του μορίου CXCR4 ήταν λιγότερο εμφανής στην περίπτωση συγκαλλιέργειας των φυσιολογικών HSCs με οστεοβλάστες από ασθενείς με ΜΔΣ, όπου η μεγαλύτερη διαφορά παρατηρήθηκε στο σύστημα που περιείχε τους οστεοβλάστες από ασθενείς χαμηλού κινδύνου ΜΔΣ (3- και 1,7- fold αύξηση στις 7ημέρες καλλιέργειας με οστεοβλάστες από υγιείς δότες και χαμηλού κινδύνου ΜΔΣ ασθενείς, αντίστοιχα). Το πρότυπο έκφρασης των μορίων CD49d και CD49e ήταν όμοιο στα κύτταρα που τοποθετήθηκαν τόσο σε οστεοβλάστες προερχόμενους από υγιείς δότες, όσο και οστεοβλάστες από ΜΔΣ ασθενείς. Ο φαινότυπος, τόσο όσον αφορά τα μορφολογικά όσο και τα ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά, των MSCs ήταν ίδιος και στις δυο ομάδες μελέτης, ενώ η διαφοροποίηση των MSCs προς οστεοβλάστες ήταν όμοια τόσο στα MSCs που προήλθαν από φυσιολογικούς δότες όσο και σε αυτά που προήλθαν από ασθενείς με ΜΔΣ, δείχνοντας παρόμοια έκφραση των ειδικών οστεοβλαστικών πρωτεϊνών αλλά και της διαδικασίας της ενασβεστοποίησης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που λάβαμε, οι οστεοβλάστες από υγιείς δότες προώθησαν την αύξηση του ποσοστού των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων και οδήγησαν στην επαγωγή της έκφρασης του μορίου CXCR4, ενός πολύ σημαντικού μορίου για τη μετανάστευση, την εγκατάσταση αλλά και την ανάπτυξη. Ωστόσο, η διαφορετική δραστηριότητα, τόσο όσον αφορά το ποσοστό των CD34+ όσο και την έκφραση του μορίου CXCR4, όταν τα φυσιολογικά αιμοποιητικά κύτταρα συγκαλλιεργήθαν με οστεοβλάστες που προήλθαν από ασθενείς με ΜΔΣ, οδηγεί στην υπόθεση ότι υπάρχει μεταβολή στη λειτουργία των οστεοβλαστών, οπότε προβλέπεται και μια επακόλουθη αλλαγή στη ρύθμιση της εγκατάστασης των HSC στην αιμοποιητική φωλαιά, στους ασθενείς με ΜΔΣ. / The hematopoietic stem cell niche contains osteoblasts that regulate normal hematopoiesis. However, little is known about the role of osteoblasts in MDS hematopoiesis so far. Myelodysplastic syndrome comprises a heterogeneous group of clonal stem cell disorders with dismal prognosis and difficulty in their therapeutic approach, which is characterized by ineffective hematopoiesis. It appears with dysplastic hematopoietic cells, peripheral blood cytopenias and high risk of evolution to acute myeloid leukemia (AML). Data derived from ex vivo co-culture systems using mesenchymal stromal cells as a feeder cell layer suggest that cell-cell contact has a significant impact on the expansion, migratory potential and “stemness” of hematopoietic stem cells. In this study, we investigated the biological characteristics of osteoblasts from MDS patients and the interactions between these cells and normal hematopoietic stem cells (HSCs). Osteoblasts were differentiated from marrow MSCs from 13 MDS patients (6 RA, 3 RAEBI, 2 RAEBII, 1 5q- and 1 hypoplastic MDS) and 8 age-matched healthy individuals. To study the effect of MDS osteoblasts on hematopoiesis, normal HSCs from mobilized peripheral blood from healthy individuals (n=4) were seeded onto osteoblast confluent monolayer cultures using a culture medium appropriate for the culture of HSCs, without the exogenous addition of cytokines. We studied the morphology and immunophenotype of MSCs and osteoblasts by microscopy and flow cytometric analysis, respectively. Cytometric analyses of homing associated molecules were performed 36h and 7d later. These molecules are CXCR4, which regulates the direct adhesion of HSCs to the bone marrow niche during “homing”, CD49d (Very Late Antigen-4- VLA4) and CD49e (Very Late Antigen-5- VLA5), which produce survival signals or promote the maintenance of a quiescent state for HSCs after entering the stem cell niche (localization). We investigated the expression of these molecules in CD34+, CD34+/CD38+ and CD34+/CD38- cell populations. Furthermore we studied the frequency of CD34+ hematopoietic cells and also their ability to adhere osteoblasts.Osteoblasts from healthy individuals increased the frequency of CD34+ cells by 3- and 9-fold increase in normal hematopoietic cells after 36h and 7d co-cultures respectively. A 2-fold increase was also seen in CD34+ cells when normal HSCs grown on MDS-osteoblasts for 36h and no difference was seen between the MDS subtypes. When the culture period was extended to 7d, there was no change in the frequency of immature phenotype of normal HSCs in osteoblast cultures from low-risk MDS patients. In contrast, CD34+ cells increased several fold (16-fold increase) when normal HSCs were cultured on high-risk MDS 14 osteoblasts, twice the values obtained in osteoblast co-cultures from healthy individuals and low risk patients. The expression of adhesion molecules CXCR4, CD49d and CD49e on CD34+ cells from normal HSCs was increased in co-cultures with osteoblasts from healthy individuals compared to the values obtained before culture (3-fold increase at 7d). The increase in CXCR4 expression was less pronounced in the presence of osteoblasts from MDS patients with the largest difference being found in low-risk MDS patients (1,7-fold increase at 7d). The expression pattern of CD49d and CD49e was identical between cells grown on MDS- and normal- osteoblast co-cultures.The morphological and immunophenotypical analysis of MSCs show the same results for the two study groups, while the differentiation of MSCs to osteoblasts was similar for both healthy individuals and MDS patients, after having similar expression of bone specific proteins and mineralization activity. According to our data, osteoblasts from healthy individuals promoted the expansion of immature hematopoietic progenitors and induced the cell surface expression of CXCR4, an important molecule in HSCs homing, retention and development. However, the different expression of CXCR4 and the change in frequency of CD34+ cells that were detected when normal HSCs co-operated with MDS-osteoblasts, suggests alteration in osteoblast function and the subsequent regulation of the HSC residency in the niche in MDS patients compared with healthy individuals.

Suite à une ischémie, de nombreux acteurs moléculaires et cellulaires concourent pour promouvoir la revascularisation post-ischémique afin de limiter les lésions tissulaires. Des cellules progénitrices et inflammatoires originaires de la moelle osseuse sont notamment recrutées au niveau du tissu ischémique où elles activent et participent à la régénération vasculaire et tissulaire. Leurs capacités pro-angiogéniques et pro-vasculogéniques suscitent d’ailleurs un grand intérêt pour l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif de ce travail de thèse aura été d’améliorer notre compréhension des mécanismes qui régissent la mobilisation et le recrutement des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse et de mettre en évidence l’efficacité d’un traitement basée sur l’utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique. Dans un premier travail nous avons mis en évidence que les catécholamines (dopamine -DA- et norépinephrine –NE-) du système nerveux sympathique régulent la mobilisation des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse via une signalisation dépendante de la eNOS. Nous avons montré que la DA et la NE augmentent le nombre de cellules médullaires recrutées dans le tissu ischémique et stimulent leur différenciation en cellules à phénotype endothéliale ou inflammatoire favorisant ainsi la revascularisation post-ischémique. Le recrutement des cellules médullaires dépend également des chimiokines, et plus particulièrement de CXCL12 qui est connue pour attirer les cellules exprimant son récepteur CXCR4. Le deuxième travail de cette thèse a montré que le pouvoir chimioattractant de CXCL12 est également régulé par sa capacité à se lier aux héparan-sulfates (HS), et donc à adhérer à la matrice extracellulaire. En effet, de fortes interactions CXCL12/HS induisent une augmentation de la régénération vasculaire post-ischémique corrélée à un meilleur recrutement des cellules d’origine médullaires dans le tissu lésé.Une fois recrutées dans le tissu ischémique, les cellules souches, de part leurs capacités remarquables d’auto-renouvellement, de prolifération, de différenciation et leur activité paracrine sont d’excellents activateurs de la revascularisation post-ischémique. La troisième étude de cette thèse met en évidence l’efficacité des cellules souches embryonnaires humaines multipotentes pour traiter l’ischémie critique du membre inférieur. Nous avons également révélé que ce potentiel thérapeutique dépend du miR-21.Ces travaux ont permis de démontrer que la régulation de la mobilisation et du recrutement des cellules souches contrôle la revascularisation post-ischémique et de souligner l’efficacité d’un traitement basé sur l’utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique. / Following ischemia, many molecular and cellular mechanisms compete to promote post-ischemic revascularization to minimize tissue damage. Bone marrow-derived progenitor and inflammatory cells are especially recruited into the ischemic tissue where they activate and participate in vascular and tissue regeneration. Their pro-angiogenic and pro-vasculogenic capacity also generate great interest in the development of new therapeutic strategies. The objective of this thesis has been to improve our understanding of the mechanisms governing the mobilization and recruitment of bone marrow-derived progenitor cells and to highlight the effectiveness of a treatment based on the use of stem cells to promote post-ischemic reperfusion. In a first work we have demonstrated that catecholamines (dopamine -DA- and norepinephrine -NE-) of the sympathetic nervous system regulate the mobilization of bone marrow-derived progenitor cells via eNOS-dependent signaling. We have shown that DA and NE increase the number of bone marrow-derived cells recruited into the ischemic tissue and stimulate their differentiation into endothelial or inflammatory phenotype cells, which promots post-ischemic revascularization.The recruitment of bone marrow cells also depends on chemokines, and particularly CXCL12 which is known to attract cells expressing CXCR4. The second work of this thesis has shown that the chemoattractant capacity of CXCL12 is also regulated by its ability to bind to heparan sulfate (HS), and thus, to adhere to the extracellular matrix. Indeed, strong interactions between CXCL12 and HS induce an increase in post-ischemic vascular regeneration correlated with better recruitment of bone marrow-derived cells in the injured tissue.Once recruited into the ischemic tissue, stem cells, because of their remarkable capacity of self-renewal, proliferation, differentiation and paracrine activity are excellent activators of post-ischemic revascularization. The third study of this thesis highlights the effectiveness of pluripotent human embryonic stem cells to treat critical limb ischaemia. We also found that their therapeutic potential depends on the miR-21.These studies have demonstrated that the regulation of the mobilization and recruitment of stem cells control the post-ischemic revascularization and highlight the effectiveness of a treatment based on the use of stem cells to promote post-ischemic revascularization.