Suite à une ischémie, de nombreux acteurs moléculaires et cellulaires concourent pour promouvoir la revascularisation post-ischémique afin de limiter les lésions tissulaires. Des cellules progénitrices et inflammatoires originaires de la moelle osseuse sont notamment recrutées au niveau du tissu ischémique où elles activent et participent à la régénération vasculaire et tissulaire. Leurs capacités pro-angiogéniques et pro-vasculogéniques suscitent d’ailleurs un grand intérêt pour l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif de ce travail de thèse aura été d’améliorer notre compréhension des mécanismes qui régissent la mobilisation et le recrutement des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse et de mettre en évidence l’efficacité d’un traitement basée sur l’utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique. Dans un premier travail nous avons mis en évidence que les catécholamines (dopamine -DA- et norépinephrine –NE-) du système nerveux sympathique régulent la mobilisation des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse via une signalisation dépendante de la eNOS. Nous avons montré que la DA et la NE augmentent le nombre de cellules médullaires recrutées dans le tissu ischémique et stimulent leur différenciation en cellules à phénotype endothéliale ou inflammatoire favorisant ainsi la revascularisation post-ischémique. Le recrutement des cellules médullaires dépend également des chimiokines, et plus particulièrement de CXCL12 qui est connue pour attirer les cellules exprimant son récepteur CXCR4. Le deuxième travail de cette thèse a montré que le pouvoir chimioattractant de CXCL12 est également régulé par sa capacité à se lier aux héparan-sulfates (HS), et donc à adhérer à la matrice extracellulaire. En effet, de fortes interactions CXCL12/HS induisent une augmentation de la régénération vasculaire post-ischémique corrélée à un meilleur recrutement des cellules d’origine médullaires dans le tissu lésé.Une fois recrutées dans le tissu ischémique, les cellules souches, de part leurs capacités remarquables d’auto-renouvellement, de prolifération, de différenciation et leur activité paracrine sont d’excellents activateurs de la revascularisation post-ischémique. La troisième étude de cette thèse met en évidence l’efficacité des cellules souches embryonnaires humaines multipotentes pour traiter l’ischémie critique du membre inférieur. Nous avons également révélé que ce potentiel thérapeutique dépend du miR-21.Ces travaux ont permis de démontrer que la régulation de la mobilisation et du recrutement des cellules souches contrôle la revascularisation post-ischémique et de souligner l’efficacité d’un traitement basé sur l’utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique. / Following ischemia, many molecular and cellular mechanisms compete to promote post-ischemic revascularization to minimize tissue damage. Bone marrow-derived progenitor and inflammatory cells are especially recruited into the ischemic tissue where they activate and participate in vascular and tissue regeneration. Their pro-angiogenic and pro-vasculogenic capacity also generate great interest in the development of new therapeutic strategies. The objective of this thesis has been to improve our understanding of the mechanisms governing the mobilization and recruitment of bone marrow-derived progenitor cells and to highlight the effectiveness of a treatment based on the use of stem cells to promote post-ischemic reperfusion. In a first work we have demonstrated that catecholamines (dopamine -DA- and norepinephrine -NE-) of the sympathetic nervous system regulate the mobilization of bone marrow-derived progenitor cells via eNOS-dependent signaling. We have shown that DA and NE increase the number of bone marrow-derived cells recruited into the ischemic tissue and stimulate their differentiation into endothelial or inflammatory phenotype cells, which promots post-ischemic revascularization.The recruitment of bone marrow cells also depends on chemokines, and particularly CXCL12 which is known to attract cells expressing CXCR4. The second work of this thesis has shown that the chemoattractant capacity of CXCL12 is also regulated by its ability to bind to heparan sulfate (HS), and thus, to adhere to the extracellular matrix. Indeed, strong interactions between CXCL12 and HS induce an increase in post-ischemic vascular regeneration correlated with better recruitment of bone marrow-derived cells in the injured tissue.Once recruited into the ischemic tissue, stem cells, because of their remarkable capacity of self-renewal, proliferation, differentiation and paracrine activity are excellent activators of post-ischemic revascularization. The third study of this thesis highlights the effectiveness of pluripotent human embryonic stem cells to treat critical limb ischaemia. We also found that their therapeutic potential depends on the miR-21.These studies have demonstrated that the regulation of the mobilization and recruitment of stem cells control the post-ischemic revascularization and highlight the effectiveness of a treatment based on the use of stem cells to promote post-ischemic revascularization.

Suite à une ischémie, de nombreux acteurs moléculaires et cellulaires concourent pour promouvoir la revascularisation post-ischémique afin de limiter les lésions tissulaires. Des cellules progénitrices et inflammatoires originaires de la moelle osseuse sont notamment recrutées au niveau du tissu ischémique où elles activent et participent à la régénération vasculaire et tissulaire. Leurs capacités pro-angiogéniques et pro-vasculogéniques suscitent d'ailleurs un grand intérêt pour l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'objectif de ce travail de thèse aura été d'améliorer notre compréhension des mécanismes qui régissent la mobilisation et le recrutement des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse et de mettre en évidence l'efficacité d'un traitement basée sur l'utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique. Dans un premier travail nous avons mis en évidence que les catécholamines (dopamine -DA- et norépinephrine -NE-) du système nerveux sympathique régulent la mobilisation des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse via une signalisation dépendante de la eNOS. Nous avons montré que la DA et la NE augmentent le nombre de cellules médullaires recrutées dans le tissu ischémique et stimulent leur différenciation en cellules à phénotype endothéliale ou inflammatoire favorisant ainsi la revascularisation post-ischémique. Le recrutement des cellules médullaires dépend également des chimiokines, et plus particulièrement de CXCL12 qui est connue pour attirer les cellules exprimant son récepteur CXCR4. Le deuxième travail de cette thèse a montré que le pouvoir chimioattractant de CXCL12 est également régulé par sa capacité à se lier aux héparan-sulfates (HS), et donc à adhérer à la matrice extracellulaire. En effet, de fortes interactions CXCL12/HS induisent une augmentation de la régénération vasculaire post-ischémique corrélée à un meilleur recrutement des cellules d'origine médullaires dans le tissu lésé.Une fois recrutées dans le tissu ischémique, les cellules souches, de part leurs capacités remarquables d'auto-renouvellement, de prolifération, de différenciation et leur activité paracrine sont d'excellents activateurs de la revascularisation post-ischémique. La troisième étude de cette thèse met en évidence l'efficacité des cellules souches embryonnaires humaines multipotentes pour traiter l'ischémie critique du membre inférieur. Nous avons également révélé que ce potentiel thérapeutique dépend du miR-21.Ces travaux ont permis de démontrer que la régulation de la mobilisation et du recrutement des cellules souches contrôle la revascularisation post-ischémique et de souligner l'efficacité d'un traitement basé sur l'utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique.

Dans la dysfonction endothéliale, le compartiment endothélial circulant joue simultanément le rôle d’acteur impliqué dans la régénération du tissu lésé et celui d’indicateur de l’état d’altération ou de régénération de l’endothélium. Dans l’artérite oblitérante des membres inférieurs (AOMI), l’un des axes de recherche porte sur le développement d’un produit de thérapie cellulaire capable d’induire la formation de néo-Vaisseaux. Face à la difficulté d’obtenir et d`amplifier des cellules progénitrices endothéliales (CPE) chez l’adulte sain, et a fortiori chez le patient, l’une des hypothèses laisse envisager le recours à d’autres types cellulaires ayant des propriétés vasculogéniques. Chez patients atteints de maladies cardiovasculaires, et d’AOMI en particulier, les cellules mononuclées de moelle osseuse et les CPE montrent des propriétés angiogéniques diminuées. Nous avons mis en évidence la capacité des cellules souches mésenchymateuses (CSM) isolées de patients atteints d’AOMI à induire une reperfusion, par recrutement de cellules endothéliales in situ, avec la même efficacité que celles de donneurs sains. Les CSM ne se différencient pas en cellules endothéliales mais agissent par paracrinie. La seconde hypothèse d’obtention d’un produit de thérapie cellulaire autologue angiogène est de trier des cellules plus immatures que les CPE afin de les différencier secondairement vers la lignée endothéliale à l’image du modèle pathologique de la cellule souche d’hémangiome CD133+ qui laisse envisager les Very Small Embryonic Like stem cells (VSEL), cellules souches multipotentes CD133+, comme un candidat de cellules post-Natales à potentiel vasculaire. Nous avons dérivés, en culture en conditions angiogéniques, des VSEL qui acquièrent un phénotype mésenchymateux mais présentent un profil sécrétoire proche de celui des CPE. Les VSEL favorisent la revascularisation post-Ischémique et acquièrent un phénotype endothélial in vitro et in vivo suggérant que les VSEL peuvent être à l’origine de la lignée endothéliale. Les VSEL se présentent également comme un biomarqueur de la dysfonction endothéliale mobilisé de la moelle osseuse (MO) vers le sang périphérique (PB) chez les patients souffrant d’AOMI. Les biomarqueurs cellulaires circulants représentent non seulement des marqueurs non invasifs de l’endothélium mais peuvent également apporter des informations utiles pour le diagnostic, le pronostic et le suivi thérapeutique des patients souffrant de pathologies associées à une dysfonction endothéliale. Une modification du nombre de CPE et de cellules endothéliales circulantes (CEC) dans la circulation a été rapportée dans différentes situations pathologiques respectivement associées à une régénération et une altération endothéliale telle l’augmentation du taux de CEC chez des patients présentant une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). La technique de référence pour le dénombrement des CEC dans le sang périphérique est l’immunoséparation magnétique (IMS). Cette méthode non automatisée et chronophage, repose sur l’énumération par microscopie à fluorescence des cellules CD146+ préalablement isolées. Bien que reproductible, cette numération est soumise à de nombreux biais de quantification, difficile à mettre en oeuvre et sujette à interprétation. La mise au point d’une méthode de détection automatisée des CEC par cytométrie à focalisation acoustique (AFC) s’est montrée fiable et robuste, dans une cohorte de patients atteints d’HTAP traitée ou non, constituant une alternative pertinente à l’analyse par microscopie. L’ensemble de ces travaux ouvre donc de nouvelles perspectives dans la détection des biomarqueurs cellulaires circulants impliqués dans la dysfonction endothéliale, proposant les VSEL comme nouvel acteur vasculogénique. / In endothelial dysfunction, circulating endothelial compartment simultaneously plays the role of actor involved in the regeneration of injured tissue and reflects endothelium state. In peripheral arterial disease (PAD), one of the research areas is the development of a cellular therapy product capable of inducing the formation of neo-Vessels. Faced with the difficulty to obtain and amplify endothelial progenitor cells (EPC) in adults, one of the assumptions lets consider the use of other cell types with vasculogenic properties. In patients with cardiovascular disease, and PAD in particular, bone marrow mononuclear cells and EPC show reduced angiogenic properties. We have demonstrated the ability of isolated mesenchymal stem cells (MSCs) from PAD patients to induce reperfusion by recruitment of endothelial cells in situ, with the same efficiency as that of healthy donors MSCs. MSCs do not differentiate into endothelial cells but act by paracrine. The second hypothesis of obtaining an autologous angiogenic cell therapy product is to sort cells more immature than the CPE and to differentiate them secondarily into endothelial lineage as the pathological cell model of hemangioma stem cells CD133 + which lets consider the Very Small Embryonic like stem cells (VSEL), CD133 + multipotent stem cells as a potential candidate of postnatal vascular cell. We have derived and cultured in angiogenic conditions VSEL that acquired a mesenchymal phenotype but exhibited a secretory profile similar to that of EPC. VSEL promote post-Ischemic revascularization and acquire an endothelial phenotype in vitro and in vivo suggesting that VSEL may be responsible for the endothelial lineage. VSEL also appear as a biomarker of endothelial dysfunction mobilized from bone marrow (BM) to peripheral blood (PB) in patients with PAD. Cellular circulating biomarkers are not only non-Invasive markers of endothelium but can also provide useful information for the diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring of patients with endothelial dysfunction associated pathologies. Changing the number of EPC and circulating endothelial cells (CEC) in the circulation has been reported in different pathological situations respectively associated with endothelial regeneration and alteration such as the increase of CEC in patients with pulmonary arterial hypertension (PAH). The reference technique for the enumeration of CEC in peripheral blood is magnetic immunoseparation (IMS). This non-Automated and time-Consuming method, based on the enumeration by fluorescence microscopy of CD146 + cells isolated. Although reproducible, this count is subject to many through quantification, difficult to implement and subject to interpretation. The development of an acoustic focusing cytometry (AFC) method for automated detection of CEC has proved reliable and robust results, in a cohort of patients with PAH treated or not, constituting a relevant alternative analysis to microscopy. All of this work opens new perspectives in the detection of cellular circulating biomarkers involved in endothelial dysfunction, suggesting VSEL as new vasculogenic actor.