Ce mémoire de thèse est consacré au fractionnement des protéines du lait par filtration dynamique. Un procédé en cascade a été proposé pour séparer les protéines du lait en trois fractions principales : les caséines, l'α-Lactalbumine et la β-Lactoglobuline. La première étape du procédé consiste en une microfiltration du lait afin de séparer les caséines des protéines du lactosérum. Une comparaison entre les performances des deux modules de filtration dynamique : le module Multi Shaft Disk (MSD) et le module à disque rotatif, a été effectuée. Nous avons obtenu les meilleurs résultats avec le prototype MSD, fournissant des flux de perméat élevés, ainsi que une très bonne transmission de protéines solubles et une rétention élevée des micelles de caséines. La deuxième étape du procédé est la séparation d'α-Lactalbumine de la β-Lactoglobuline, par ultrafiltration. Le prototype à disque rotatif muni d'un disque à ailettes tournant à 2000 tr.min-1 a été utilisé. Nous avons obtenu des transmissions de protéines et des sélectivités constantes lors de la concentration du lactosérum. Ceci constitue un avantage des systèmes dynamiques, car en filtration tangentielle les transmissions de protéines et les sélectivités diminuent avec la concentration. Les sélectivités obtenues en filtration dynamique, sans modification de pH ni de la force ionique, sont de l'ordre de grandeur de celles obtenues en filtration tangentielle après optimisation du pH et de la force ionique.

Le développement de biomatériaux utilisant les propriétés d'auto-assemblage des protéines est au cœur de nombreuses recherches car les objets supramoléculaires résultants présentent un large potentiel applicatif pour les industries agroalimentaire, pharmaceutique et biotechnologique. La compréhension des forces gouvernant l'assemblage des protéines est essentielle pour contrôler la stabilité, la morphologie et les fonctionnalités des objets formés. Cette étude s'intéresse au système binaire composé de protéines de charges opposées : le lysozyme (LYS) et l'α-lactalbumine (LAC). Le lysozyme interagit avec les formes calcifiée (holo) et décalcifiée (apo) de l'α-lactalbumine pour former des hétérodimères. Seuls les hétérodimères apoLAC-LYS s'assemblent en objets supramoléculaires dont la morphologie dépend de la température. Lorsque l'apoLAC est dans sa conformation native (T< 26°C), des agrégats amorphes sont obtenus, alors que des objets sphériques ordonnés, appelés microsphères, sont obtenus lorsqu'elle adopte un état conformationnel particulièrement flexible, appelé " molten globule " (45°C). Pour comprendre comment l'information contenue à l'échelle moléculaire se propage à l'échelle microscopique, les objectifs de ma thèse étaient de caractériser les interactions impliquées à l'échelle moléculaire et d'établir le mécanisme d'assemblage. L'identification des acides aminés impliqués dans l'interface des hétérodimères a mis en évidence une orientation particulière des protéines gouvernée par des attractions électrostatiques et la formation de tétramères par associations des dimères apoLAC-LYS. La croissance de particules sub-micrométriques, à partir des nucléi formés par agrégation des tétramères, est indépendante de la température et est gouvernée par collision et fusion de particules plus petites. C'est au stade final du mécanisme, que l'état conformationnel de l'apoLAC joue un rôle important. En effet, la coalescence des particules et la réorganisation des protéines en microsphères sont favorisées par la flexibilité du " molten globule " et impliquent probablement des associations hydrophobes. Enfin, la formation de microsphères n'implique pas de changements importants de structure secondaire des protéines assemblées, ce qui explique la réversibilité des objets formés et le dynamisme des protéines assemblées. L'approche mise en œuvre pour réaliser ce travail peut être utilisée pour étudier l'assemblage d'autres systèmes protéiques binaires et les éléments fondamentaux apportés permettent d'envisager des applications potentielles des microsphères.

RESUME: S'il est établi que les acides aminés interagissent à différents niveaux avec les mécanismes de la régulation glycémique, le rôle quantitatif et qualitatif de l'apport protéique dans l'homéostasie du glucose reste controversé. Le stress oxydant joue un rôle important dans la pathogenèse de l'insulino-résistance, mais peu d'études ont exploré les effets de modulations de l'apport en cystéine, substrat limitant de la synthèse de glutathion. Après une étude des données bibliographiques portant sur les relations entre l'apport protéique et la régulation glycémique, avec un intérêt particulier porté à l'apport en acides aminés soufrés, nous présentons les résultats de nos études expérimentales réalisées chez le rat. Nous avons exploré les effets de la consommation de régimes hyperprotéiques sur la composition corporelle, la tolérance au glucose et la sensibilité à l'insuline et nous avons évalué les contributions respectives de la diminution spontanée de l'apport énergétique et de l'augmentation de l'apport protéique dans les effets observés. Par la suite, nous avons étudié les effets d'une augmentation spécifique en aigu et à moyen terme de l'apport en cystéine, apportée par l'intermédiaire d'une source protéique naturellement riche en cystéine (protéines de lactosérum enrichies en αlactalbumine) ou d'un donneur de cystéine (N-acétylcystéine), sur le statut en glutathion et la régulation glycémique chez le rat nourri avec un régime hypersaccharosé, un modèle d'induction nutritionnelle de stress oxydant associé à l'apparition d'une insulino-résistance. Différents paramètres de la régulation glycémique, évaluée à jeun et en dynamique (période postprandiale et provocations glycémiques ou insuliniques), ont été confrontés à des marqueurs du statut redox, du métabolisme du glutathion, de la production et de la biodisponibilité du monoxyde d'azote. L'augmentation de la fraction protéique de l'alimentation réduit le dépôt adipeux et améliore la régulation glycémique chez le rat sain. Chez le rat nourri avec un régime hypersaccharosé, une augmentation spécifique de l'apport en cystéine améliore le statut en glutathion et prévient le stress oxydant, les dysrégulations glycémiques et la réduction de la biodisponibilité du monoxyde d'azote. Ces résultats suggèrent que des conditions alimentaires conduisant à l'apparition d'un stress oxydant modéré pourraient être associées à une augmentation des besoins en acides aminés soufrés et que la non couverture de ces besoins favorise l'apparition de dysfonctions métaboliques.

Certaines protéines, appelées protéines amphitropiques, sont solubles en milieux aqueux et capables de se lier aux membranes pour leurs activités biologiques. Ces protéines apparaissent comme d'excellents modèles pour la compréhension des principes généraux de stabilité et de repliement des protéines membranaires intrinsèques. L'α-lactalbumine et l'apo-myoglobine ont été choisies comme modèles de protéines amphitropiques. Nous proposons une étude exhaustive des facteurs qui influencent la liaison aux membranes de ces deux protéines telles que le pH, la présence de cofacteurs, la force ionique, la charge et la courbure des membranes. Une description macroscopique des mécanismes de liaison a été entreprise par des expériences de centrifugation et de fluorescence. Enfin, la structure et la stabilité des états liés aux membranes ont été sondées par des expériences d'échanges hydrogène/deutérium (H/D).<br />L'état conformationnel de l'α-lactalbumine liée aux membranes s'est révélé très dépendant de la courbure membranaire. Nous avons identifié deux hélices amphiphiles qui sont directement impliquées dans les interactions α-lactalbumine-lipides. D'autre part, nos expériences d'échanges H/D permettent une description thermodynamique de la liaison à la membrane. Dans le cas de l'apo-myoglobine, nos résultats suggèrent un mécanisme commun d'insertion membranaire pour les protéines qui possèdent une topologie de type globine. Par ailleurs, la liaison de l'apo-myoglobine aux membranes ne semble pas nécessaire pour la fonction biologique de cette protéine. Une description des structures membranaires de l'apo-myoglobine a été entreprise par des expériences d'échanges H/D suivies par spectrométrie de masse.

La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991. / Peptide mapping is a routine method for identifying post-translational modifications of proteins. It involves three steps: 1) enzymatic proteolysis, 2) separation of the peptide fragments by capillary electrophoresis (CE) or high performance liquid chromatography (HPLC), 3) identification of the peptide fragments by photometric methods or mass spectrometry (MS). During the past decade, immobilized enzymes for proteolysis have been gaining in popularity because they can be reused and they provide fast protein digestion due to the high ratio of enzyme-to-substrate. In order to study new immobilization techniques developed in the Waldron laboratory, peptide mapping by CE is frequently used, where the total number of peptides detected and their abundance are related to enzymatic activity. CE allows very high resolution separations and, when coupled to laser-induced fluorescence (LIF), provides excellent detection limits that are 1000 times lower than with UV-Vis absorbance. In the typical method, the peptides produced in step 1) above are derivatized with a fluorophore before separation by CE-LIF. Although the detection sensitivity of LIF can approach 10 12 M for a highly efficient fluorophore, a major disadvantage is that the derivatization reaction requires analyte concentrations to be approx. 10 7 M or higher. Therefore, it is not feasible to study enzymes using CE-LIF of the peptides derivatized after proteolysis if the initial protein substrate concentration is <10-7 M because additional dilution occurs during proteolysis. Instead, to take advantage of CE-LIF to evaluate the efficiency of immobilized enzyme digestion of low concentrations of substrate, we propose using fluorescently derivatized protein substrates that can be purified then diluted. Three methods for conjugating fluorophore to protein were investigated in this work as a means to study both soluble and immobilized enzymes. The fluorophores studied for derivatization of protein standards included naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA), fluoresceine-5-isothiocyanate (FITC) and 6-carboxyfluorescein N-succinimide ester (FAMSE). The FAMSE was found to be an excellent reagent that conjugates quickly with primary amines and the derivatized substrate was stable over time. The studied substrates were -lactalbumin (LACT), carbonic anhydrase (CA) and insulin chain-B (INB). The CE-LIF peptide maps were generated from digestion of the fluorescently derivatized substrates by trypsin (T), chymotrypsin (CT) or pepsin (PEP), either in soluble or insoluble forms. The soluble form of an enzyme is more active than the immobilized form and this allowed us to verify that the conjugated proteins were still recognized as substrates by each enzyme. The digestion of the derivatized substrates with different types of chymotrypsin (CT) was compared: free (i.e., soluble) chymotrypsin, chymotrypsin cross-linked with glutaraldehyde (GACT) and chymotrypsin immobilized on agarose gel particles (GELCT), which was available commercially. The study showed that, according to the chymotrypsin used, the peptide map would vary in the number of peaks and their intensities. It also showed that the digestion by immobilized enzymes was quite reproducible. Several quantitative parameters were studied to evaluate the efficacy of the methods. The detection limit of the overall method (CE-LIF peptide mapping of FAM-derivatized protein digested by chymotrypsin) was 3.010-10 M (S/N = 2.7) carbonic anhydrase using insoluble GACT and 2.010-10 M (S/N = 4.3) CA using free chymotrypsin. Our studies also showed that the standard curve was linear in the working region (1.0×10-9-1.0×10-6 M) with a correlation coefficient (R2) of 0.9991.

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