Ces travaux de recherche s'intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d'une transplantation hépatique ou bien encore à l'évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l'essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l'agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d'une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s'est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d'absorbance dans l'ultra-violet et l'autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L'autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l'analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d'investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d'un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d'analyse miniaturisé et simple d'utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d'analyse sur puce microfluidique permettant l'analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d'une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR.

Des composés de type 3-arylpyrroles appelés pyakols ont montré une activité antimitotique sur des cellules tumorales murines, avec en particulier un effet sur les microtubules. Ce type d’activité biologique présentant un intérêt important en cancérologie, le travail présenté dans ce manuscrit est consacré à l’étude de ces hétérocycles. La première partie a pour objectif de développer une stratégie de synthèse permettant d’accéder efficacement au composé chef de file (pyakol I), basée sur la cyclisation d’intermédiaires α-amino-ynols catalysée par des complexes d’or. L’évaluation de l’activité biologique du pyakol I sur le cycle cellulaire et le cytosquelette de diverses lignées tumorales humaines a été réalisée. Les premiers résultats ont révélé une action originale du pyakol I sur le cytosquelette, provoquant une désorganisation du réseau de microtubules et un défaut de positionnement du fuseau mitotique. La séquence réactionnelle a ensuite été validée en l’appliquant pour la réalisation de modulations autour du motif 3-arylpyrrole ainsi que pour l’obtention de molécules marquées. La deuxième partie concerne un travail de méthodologie basée sur la réaction de cyclisation à l’or pour la synthèse de nouveaux pyrroles trifluorométhylés polysubstitués. La stratégie utilisant le trifluoroacétaldéhyde comme substrat de départ permet d’accéder à divers 3-trifluorométhylpyrroles avec de bons rendements, dans des conditions douces. / A family of 3-arylpyrroles named pyakols have shown antimitotic properties on murine cell lines, displaying in particular an effect on microtubules. Given the interest of these properties in cancerology, this work is focused on these heterocycles. The objective of the first part was to develop a synthetic strategy based on the gold-catalysed cyclisation of α-amino-ynols intermediates in order to access the lead (Pyakol I). Then, the evaluation of the biological activity of this molecule on the cell cycle and on the cytoskeleton of various human tumoral cell lines was carried out. The first results revealed an original effect on the organization of the microtubules network and the positioning of the mitotic spindle. The developed strategy was then validated by modulating the 3-arylpyrrole moiety on diverse positions, and used for the synthesis of labelled derivatives. The second part of this manuscript focused on the development of a methodology to synthesize new polysubstituted 3-trifluoromethylpyrroles, based on the gold-catalyzed cyclisation reaction. Using trifluoroacetaldehyde as building-block, various trifluoromethylated pyrroles were obtained in mild conditions with good yields.

Le développement de nanomédicaments pour l'imagerie et le traitement du cancer a suscité un intérêt croissant à cause de leur grand potentiel. En particulier les vecteurs à base de polymères et de micelles polymères sont très intéressants, car ils peuvent être conçus avec des fonctionnalités adaptées aux besoins.Nous avons utilisé des copolymères amphiphiles triséquencés pour développer de nouveaux nanovecteurs moléculaires (unimères) et supramoléculaires (micelles stabilisées par photo- réticulation). Nous les avons fonctionnalisés avec un marqueur fluorescent ou radioactif pour permettre leur imagerie in vitro et in vivo. Les interactions in vitro et in vivo ont été étudiées pour comprendre l'influence des propriétés des copolymères sur les interactions biologiques.Cette thèse présente le développement complet de nanovecteurs depuis les premières étapes de la caractérisation physico-chimique fondamentale jusqu'à l'évaluation de leur intérêt pour différentes applications cliniques. / The interest in developing new nanocarriers for imaging and therapy of cancer has been growing due to their high potential. Particularly nanocarriers based on polymers and polymeric micelles are very interesting because they can be tailor-made with certain functionalities to meet our needs.We have used amphiphilic triblock copolymers to develop new molecular (unimers) and supramolecular (micelles stabilized by photo cross-linking) nanocarriers. The carriers were then functionalized with fluorescent or radioactive markers to enable their in vitro and in vivo imaging. The in vitro and in vivo interactions were then studied to understand the influence of the copolymers properties on the biological interactions.This thesis presents the complete development of the nanocarriers from the early stages of fundamental physicochemical characterization up to the evaluation of their interest for different clinical applications

Ces travaux de recherche s’intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d’une transplantation hépatique ou bien encore à l’évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l’essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l’agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d’une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s’est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d’absorbance dans l’ultra-violet et l’autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L’autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l’analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d’investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d’un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d’analyse miniaturisé et simple d’utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d’analyse sur puce microfluidique permettant l’analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d’une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR. / The purpose of our work was the development of new analytical methodologies to measure the benefit of liver transplantation and also the evaluation of new therapeutic approaches under testing on patients with Transtyretin (TTR) familial amyloid polyneuropathy. This rare disease is characterized by a structural destabilization of TTR tetramer leading to it’s aggregation into amyloïd fibrils that accumulate in the tissues of the autonomous nervous system, peripheral nerves and around certain organs, including the heart. As part of a collaboration between university, hospital, analytical chemists, electrochemist, physical chemists and technologists, we are committed to develop separations in capillary electrophoresis coupled with optical detection of native and mutated peptides that are directly associated with a variant of this rare disease. The first challenge of this research is the choice of these biomarkers that ultimately proved relevant with the realization of peptide maps from the serum. Then two approaches have been explored: electrokinetic separation with absorbance spectrometric detection in the ultraviolet and the other requiring the prior labeling peptides with fluorescent molecules and then to a separation on electrophoresis coupled with LIF (Laser induced fluorescence). In both cases the main criterion of separation, resolution, allows quantification and especially analytical validations show actual strength associated methodologies developed. Another encouraging sign for the transposition of these methods to the analysis of samples from patients regarding the quantification limit is lower than commonly measured in serum. Mass spectrometry, using physico-chemical investigation powerful allowed to follow and understand a more fundamental viewpoint the product of organic chemistry reactions bypass peptides by three fluorescent dyes: TAMRA-SE, the NDA and FQ. The ability to provide a miniaturized analysis and easy to use tool for the hospital environment was also studied. A post analysis on microfluidic chip for quantitative and qualitative analysis was installed to allow the realization of the first experimental tests of electrokinetic separations on microfluidic chip. These studies lay the foundation for a new analytical way to separate and quantify the different characteristics biomarkers family TTR amyloid polyneuropathy.

La première partie de ces travaux de thèse concerne la synthèse d’acides aminés phosphole par formation d’une liaison P-C. Les propriétés de fluorescence (absorption, émission et rendement quantique) sont modulées à la fois par les différents substituants présents sur le phosphore (BH3, O, S…) ainsi que par le squelette aromatique du phosphole. Des couplages peptidiques modèles réalisés en solution et sur support solide démontrent la possibilité d’intégrer ces acides aminés dans des peptides d’intérêts. La deuxième partie concerne la synthèse de nouveaux phospholes fonctionnalisés ainsi que d’une nouvelle méthode d’accrochage pour les introduire sur différents groupes pendants (SH, NH2, OH) d’acide aminés et peptides via la formation de liaisons P-S, P-N ou P-O. La troisième partie de ce travail a consisté en la synthèse d’une nouvelle classe d’acides aminés tétraphénylsilole fluorescents qui présentent des propriétés d’AIE (aggregation-induced emission) et pourront être utilisés pour le marquage de peptides d’intérêts. / The first part of this work is focused on phospholyl amino acids synthesis by formation of a P-C bond. The fluorescent properties (absorption, emission and quantum yield) are modulated either by the substituent on the phosphorus atom (BH3, O, S, …) or by the aromatic skeleton of the phosphole. Peptide coupling in solution or on solid support were performed and showed the possibility to introduce such amino acids into peptide of interest. The second part of this work is dedicated to the synthesis of new functionalized phospholes for a chemoselective grafting on amino acid and peptides pendant groups (SH, NH2, OH) via PS, P-N or P-O bonds. The third part consists into the synthesis of a new class of tetraphenylsilole amino acids which exhibit AIE (aggregation-induced emission) fluorescent properties. Those compounds were successfully incorporated into di- an tri- peptides in solution and on solid support.

La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991. / Peptide mapping is a routine method for identifying post-translational modifications of proteins. It involves three steps: 1) enzymatic proteolysis, 2) separation of the peptide fragments by capillary electrophoresis (CE) or high performance liquid chromatography (HPLC), 3) identification of the peptide fragments by photometric methods or mass spectrometry (MS). During the past decade, immobilized enzymes for proteolysis have been gaining in popularity because they can be reused and they provide fast protein digestion due to the high ratio of enzyme-to-substrate. In order to study new immobilization techniques developed in the Waldron laboratory, peptide mapping by CE is frequently used, where the total number of peptides detected and their abundance are related to enzymatic activity. CE allows very high resolution separations and, when coupled to laser-induced fluorescence (LIF), provides excellent detection limits that are 1000 times lower than with UV-Vis absorbance. In the typical method, the peptides produced in step 1) above are derivatized with a fluorophore before separation by CE-LIF. Although the detection sensitivity of LIF can approach 10 12 M for a highly efficient fluorophore, a major disadvantage is that the derivatization reaction requires analyte concentrations to be approx. 10 7 M or higher. Therefore, it is not feasible to study enzymes using CE-LIF of the peptides derivatized after proteolysis if the initial protein substrate concentration is <10-7 M because additional dilution occurs during proteolysis. Instead, to take advantage of CE-LIF to evaluate the efficiency of immobilized enzyme digestion of low concentrations of substrate, we propose using fluorescently derivatized protein substrates that can be purified then diluted. Three methods for conjugating fluorophore to protein were investigated in this work as a means to study both soluble and immobilized enzymes. The fluorophores studied for derivatization of protein standards included naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA), fluoresceine-5-isothiocyanate (FITC) and 6-carboxyfluorescein N-succinimide ester (FAMSE). The FAMSE was found to be an excellent reagent that conjugates quickly with primary amines and the derivatized substrate was stable over time. The studied substrates were -lactalbumin (LACT), carbonic anhydrase (CA) and insulin chain-B (INB). The CE-LIF peptide maps were generated from digestion of the fluorescently derivatized substrates by trypsin (T), chymotrypsin (CT) or pepsin (PEP), either in soluble or insoluble forms. The soluble form of an enzyme is more active than the immobilized form and this allowed us to verify that the conjugated proteins were still recognized as substrates by each enzyme. The digestion of the derivatized substrates with different types of chymotrypsin (CT) was compared: free (i.e., soluble) chymotrypsin, chymotrypsin cross-linked with glutaraldehyde (GACT) and chymotrypsin immobilized on agarose gel particles (GELCT), which was available commercially. The study showed that, according to the chymotrypsin used, the peptide map would vary in the number of peaks and their intensities. It also showed that the digestion by immobilized enzymes was quite reproducible. Several quantitative parameters were studied to evaluate the efficacy of the methods. The detection limit of the overall method (CE-LIF peptide mapping of FAM-derivatized protein digested by chymotrypsin) was 3.010-10 M (S/N = 2.7) carbonic anhydrase using insoluble GACT and 2.010-10 M (S/N = 4.3) CA using free chymotrypsin. Our studies also showed that the standard curve was linear in the working region (1.0×10-9-1.0×10-6 M) with a correlation coefficient (R2) of 0.9991.

No description available.