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Caractérisation d'aptamères par électrophorèse capillaire couplée au séquençage haut-débit Illumina / Characterization of aptamers by capillary electrophoresis coupled to the hight throughput sequencing Illumina

Ric, Audrey Marie Amélie 29 September 2017 (has links)
Les aptamères sont des oligomères d'ADN ou d'ARN simple brin qui, en se repliant sous forme de structures tridimensionnelles peuvent avoir des interactions fortes et spécifiques envers un certain nombre de cibles. L'objectif de cette thèse a été de compléter les études existantes sur l'utilisation de l'électrophorèse capillaire (CE) et les aptamères afin de mettre au point une méthode de sélection d'aptamères par CE couplée à la fluorescence induite par laser et le séquençage haut-débit Illumina. Dans un premier temps, nous avons mis au point une méthode de détection et de séparation par électrophorèse capillaire couplée à la double détection UV-LEDIF d'une banque d'ADN en interaction avec une cible : la thrombine. C'est un modèle déjà étudié pour lequel deux aptamères ont fait l'objet de publications. Nous avons utilisé l'aptamère T29 dans le cadre de notre étude car c'est celui qui présente la meilleure affinité. L'électrophorèse capillaire est un puissant outil analytique qui facilite l'efficacité de sélection des aptamères et précise la détermination des paramètres d'interactions. Nous avons ainsi pu déterminer la constante d'affinité KD par CE-UV-LEDIF sur le modèle de base : la thrombine. Par ailleurs, nous montrons également comment l'utilisation du tampon Tris peut dégrader un ADN simple brin en électrophorèse capillaire et nous proposons comme alternative l'utilisation d'un tampon sodium phosphate dibasique qui évite ce phénomène de dégradation. Enfin, nous expliquons la difficulté d'amplification par qPCR et PCR d'un aptamère comme le T29 ayant une structure en G-quadruplex. Nous avons montré que le séquençage haut-débit Illumina nous a permis de trouver une corrélation entre le nombre de molécules séquencées et le nombre de séquences obtenues. L'analyse des séquences obtenues montre une quantité importante (20%) de séquences de T29 qui ne correspondent pas à la séquence de cet aptamère. Cela prouve que les étapes de PCR et de séquençage haut débit pour la détection de G-quadruplex peuvent induire un biais dans l'identification de ces molécules. / Aptamers are oligomers of small single-stranded DNA or RNA which can have strong and specific interactions with some targets when they fold into three-dimensional structures. The objective of this thesis was to complete existing studies on the use of capillary electrophoresis in order to develop a method for the selection of aptamers by CE coupled to laser induced fluorescence and Illumina high-throughput sequencing. In a first step, we developed a method of detection and separation by capillary electrophoresis coupled with the double detection UV-LEDIF of a DNA library interacting with a target: thrombin. It is a model already studied and for which two aptamers have been published. We used aptamer T29 as part of our study because it has the best affinity. Capillary Electrophoresis is a powerful analytical tool that facilitates the selection efficiency of aptamers and specifies the determination of the interaction parameters. We thus were able to determine the affinity constant KD by CE-UV-LEDIF on the basic model: thrombin. Moreover, we also show how the use of Tris buffer can degrade single-stranded DNA during capillary electrophoresis and we propose as an alternative the use of a dibasic sodium phosphate buffer which avoids the phenomenon of degradation. Finally, we explain the difficulty of amplification by qPCR and PCR of an aptamer such as T29 with a G-quadruplex structure. We showed that the Illumina high-throughput sequencing allowed us to find a correlation between the number of sequenced molecules and the number of sequences obtained. Analysis of the sequences obtained shows a significant amount (20%) of T29 sequences which do not correspond to the sequence of this aptamer. This shows that the PCR and high-throughput sequencing steps for the detection of G-quadruplex can induce bias in the identification of these molecules.
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Caractérisation physicochimique par électrophorèse capillaire de nanoparticules magnétiques, anioniques et cationiques : distribution de taille, densité de charge et coefficient de diffusion collectif

D'Orlyé, Fanny 27 November 2008 (has links) (PDF)
Au cours de ce travail nous nous sommes intéressés à la caractérisation de nanoparticules magnétiques anioniques et cationiques en électrophorèse capillaire (CE). Dans le cadre de l'analyse de particules cationiques, différentes stratégies de modification du capillaire ont été envisagées de sorte à supprimer les phénomènes d'adsorption et ainsi permettre une mesure précise de la mobilité électrophorétique de ces particules. Il a été montré l'influence de différents paramètres inhérents au choix de l'électrolyte de séparation, dont la force ionique, la nature et la concentration des co-ions et contre-ions ainsi que le pH, sur la mobilité et la dispersion électrophorétique des particules. Une séparation en taille a été obtenue pour des populations de particules de maghémite dont les diamètres moyens (< 10 nm) diffèrent de seulement 2 nm et expliquée à la lumière des théories d'Overbeek-Booth qui tiennent compte de l'effet de relaxation. Une caractérisation précise de la charge de surface de particules cœur/coquille bifonctionnalisées amino-PEG a également été réalisée sur des populations de particules de taille uniforme (~ 40 nm), et corrélée à un taux de greffage effectif. Enfin un protocole de mesure du coefficient de diffusion collectif des particules a été développé, basé sur la théorie de la dispersion de Taylor, permettant de (i) distinguer des populations de particules dont les diamètres moyens (< 10 nm) diffèrent de seulement 2 nm, (ii) mettre en évidence l'existence d'interactions répulsives de nature électrostatique entre particules de même signe de charge, (iii) quantifier ces interactions en fonction de la force ionique du milieu de dispersion. Ces nouvelles méthodes de caractérisation à la fois simples et rapides devraient s'avérer cruciales pour l'optimisation de la conception de nanoparticules fonctionnalisées destinées à des applications biomédicales.
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Contribution au développement d'un microsystème pour la séparation bidimensionnelle de protéines par électrophorèse

Poitevin, Martine 17 September 2008 (has links) (PDF)
Dans le cadre de la détection de nouveaux allergènes alimentaires, un microsystème pour la séparation bidimensionnelle de protéines par électrophorèse a été développé, ces deux dimensions étant la focalisation isoélectrique (IEF) et l'électrophorèse de zone (EZ). Ces deux modes de séparation ont été étudiées au format capillaire avant d'utiliser les résultats obtenus en microsystèmes. La séparation de protéines par IEF a d'abord été réalisée. Nous avons montré que l'utilisation d'électrolytes constitués d'ampholytes d'intervalles étroits de pH (NC) permettait d'augmenter la résolution puis réalisé la séparation de protéines du lait en microsystèmes. Des microsystèmes en verre et en PDMS et plusieurs traitements de surface ont été comparés en utilisant une méthode de mesure de flux électroosmotique développée pour cela. Nous avons ensuite étudié la séparation de protéines par EZ en microsystèmes. Des NC ont de nouveau été utilisés, pour leur faible conductivité. Nous avons montré qu'ils permettaient de diminuer fortement l'adsorption des protéines puis nous avons réalisé la séparation de ces dernières en quelques secondes après avoir optimisé leur dérivation avec un marqueur fluorescent. Enfin, différents schémas de microsystèmes ont été envisagés pour coupler les deux dimensions de séparation.
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Développements analytiques pour le criblage d'interactions lanthanides/ligands

Varenne, Fanny 03 July 2012 (has links) (PDF)
Ce travail étudie le potentiel de l'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse à ionisation par plasma (ICP/MS) pour le criblage d'une bibliothèque de ligands en fonction de leur affinité pour l'europium en milieu hydro-organique. Cette méthode permet, d'une part, d'évaluer l'affinité des ligands phosphorés en moins de deux heures et en utilisant moins de 15 ng de ligand, et d'autre part, de déterminer les constantes de complexation. Les résultats sont en accord avec ceux obtenus par titrage spectrophotométrique.Parallèlement, une bibliothèque de copolymères pour l'extraction solide/liquide de l'europium a été étudiée. Le protocole d'extraction mis au point permet de les classer selon leur affinité pour celui-ci en milieu hydro-organique et en utilisant 60 mg de copolymère. Pour les plus prometteurs, les propriétés de reconnaissance et la sélectivité La3+/Eu3+/Lu3+ ont été évaluées.
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Apport de l'électrophorèse capillaire pour l'étude des anomalies de glycosylation de protéines liées à des pathologies : vers l'identification de nouveaux biomarqueurs / Contribution of capillary electrophoresis for the study of disease-associated modifications in protein glycosylation : towards the identification of new biomarkers

Ruel, Coralie 13 December 2018 (has links)
La glycosylation est l’une des principales modifications post-traductionnelles des protéines. La glycosylation des protéines est fortement modifiée lors de diverses pathologies comme le cancer, la polyarthrite rhumatoïde ou les troubles congénitaux de la glycosylation («Congenital disorders of glycosylation», CDGs). Ainsi, la nature et les proportions relatives des oligosaccharides liés aux protéines peuvent être utilisées pour dépister, pronostiquer voire suivre l’évolution de pathologies. Les travaux de cette thèse se sont focalisés sur l’étude de la glycosylation pour permettre le dépistage de certaines pathologies : les CDGs, la maladie d’Alzheimer (MA) et la dégénérescence rétinienne. Plusieurs stratégies fondées sur l’électrophorèse capillaire (EC) ont été envisagées pour répondre à cet objectif. Tout d’abord, le développement d’une méthode par EC de zone (ECZ) l’apolipoprotéine C-III (ApoC-III) intacte, une O-glycoprotéine impliquée dans le dépistage des troubles de la O-glycosylation, a permis de séparer les différentes glycoformes selon leur degré de sialylation. L’analyse d’échantillons d’ApoC-III standard provenant de différents fournisseurs par spectrométrie de masse (MS) MALDI -TOF a mis en évidence une hétérogénéité liée à la présence (inattendue) de formes carbamylées. Un traitement du plasma basé sur une immunocapture de l’ApoC-III suivie d’une dérivation sur billes magnétiques de la protéine par un fluorophore a permis de séparer ses différentes glycoformes en ECZ. Ensuite, une analyse N-glycomique de fluides biologiques employant une nouvelle technique de préparation d’échantillon que nous avons adaptée au plasma et au liquide céphalorachidien, a été réalisée par EC en gel couplée à une détection par fluorescence induite par laser (ECG-LIF) sur des patients sains et atteints de la MA. Cette étude a permis de mettre en évidence quelques modifications des N-glycanes chez ces patients. Enfin la combinaison des deux stratégies d’analyse de la glycosylation (glycoprotéine intacte et glycanes libérés), a permis de détecter la transferrine intacte présente dans le liquide vitré à des concentrations faibles ainsi que ses N-glycanes libérés, dans le cadre du dépistage d’une maladie oculaire. L’EC-QTOF-MS a également été explorée pour l’analyse de N-glycanes dérivés avec un nouveau fluorophore permettant d’améliorer la sensibilité en MS. / Glycosylation is one of the most main types of post-translational modifications of proteins. Disease-associated modifications in protein glycosylation have been observed for various pathologies such as cancer, rheumatoid arthritis, or «Congenital disorders of glycosylation» (CDGs). They are often exploited for diagnosis, prognosis and monitoring of these diseases. This thesis work focused on the glycosylation study with the aim to allow the screening of different pathologies: CDGs, Alzheimer’s disease and retinal degeneration diseases. Different strategies based on capillary electrophoresis (CE) were considered to fulfil this goal. First, the developement of a CZE analysis of intact apolipoprotein C-III (ApoC-III), an O-glycoprotein implied in the screening of O-glycosylation disorders, allowed the separation of its glycoforms according to their sialylation degree. The MALDI-TOF mass spectrometry (MS) analysis of standard ApoC-III batches from different standard ApoC-III batches from different suppliers highlighted an additonnal heterogeneity due to (unexpected) carbamylated species. A plasma pretreatment based on an immunocapture of apoC-III followed by protein derivatization on magnetic beads using a fluorophore allowed to separate its glycoforms by CZE. Second, a glycomic analysis of biologicial fluids using a new sample treatment method that we adjusted to plasma and cerebrospinal fluid samples was performed by CGE-LIF on controls and Alzheimer’s patients. It allowed to highlight some modifications of N-glycans for this disease. Finally, the combination of both strategies of glycosylation analysis (intact glycoprotein and released N-glycans) allowed the detection of intact transferrin present in vitrous humor but also of its released N-glycans for the screening of retinal degeneration disease. CE-QTOF-MS was also investigated for the analysis of released N-glycans derivatized by a new fluorophore which increases MS sensitivity.
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Établissement des diagrammes de spéciation à plusieurs températures du plutonium (V) pour prédire son comportement dans les eaux de surface / Establishment of speciation diagrams of plutonium (V) at several temperatures in order to predict its behavior in surface waters.

Alexandre, Jean-Charles 21 November 2018 (has links)
Dans le cadre de la surveillance environnementale, le devenir du plutonium au sein des différents milieux et en particulier au sein des eaux de surface est important notamment en raison de sa radiotoxicité. Dans ces milieux, la forme pentavalente du plutonium est prédominante et est fortement complexée par les carbonates. Le couplage EC-ICP-MS, technique ayant déjà été éprouvée pour la spéciation des actinides, a été retenu pour déterminer les constantes thermodynamiques associées à la formation de ces complexes.L’étude menée sur le plutonium (VI) a permis d’obtenir des constantes de stabilité à 25°C. A partir de ces valeurs, les coefficients d’interaction spécifique ont été ré-évalués par rapport à celles reportées par l’AEN. Le diagramme de spéciation en solution du Pu(VI) en présence d’ions carbonate a été établi. Il suggère la complexation de la forme plutonyle par les ions carbonate dès pH=3.Les travaux réalisés sur les actinides (V) (Np et Pu) ont permis de déterminer à la fois les constantes de stabilité des complexes carbonates puis les enthalpies et entropies molaires de réaction à partir de l’étude menée en température. Expérimentalement, l’analogie entre le neptunium et le plutonium a été confirmée. Afin de mieux comprendre le comportement du plutonium au sein d’eaux de surface, la détermination des enthalpies et entropies a été nécessaire. Les diagrammes de spéciation établis à partir de ces données montrent une quasi similarité dans la répartition chimique des espèces du plutonium pentavalent sans considération de la localisation de l’eau de surface analysée. / In the field of environmental control, the behavior of plutonium in various media and particularly in surface waters is relevant taking into account its radiotoxicity. Carbonate ions widely present in these media mainly complex pentavalent plutonium. In this field, CE-ICP-MS coupling, which was already used for actinides speciation, has been considered for the determination of thermodynamic constants associated to plutonium carbonate complexes.The study developed on plutonium (VI) allowed determining the stability constants at 25°C. From these values, the specific interaction coefficients based on the values recommended by the NEA have been reevaluated. The speciation diagram of Pu(VI) in aqueous carbonate solution has been established and shows the complexation of the plutonyl form by carbonates complex beyond pH=3.The works realized on the complexation of actinides (V) (Np and Pu) by carbonate ions at different temperatures allowed determining both the stability constants and the molar enthalpies and entropies of reaction. Experimentally, the analogy between neptunium and plutonium has been observed and allowed the determination of values which are more precise and consistent with those of the literature. For a better understanding of the plutonium behavior in surface waters, the determination of enthalpies and entropies has been necessary. The speciation diagrams established from these values show a near similarity in the chemical distribution of plutonium species without any further consideration of the analyzed surface water location.
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Identification of biomarkers using-omics approach for the early detection of chronic kidney disease and its complications / Identification de biomarqueurs urinaires par des approches -omiques pour la détection précoce d'une maladie rénale chronique et ses complications

Brunchault, Valérie 19 September 2018 (has links)
Diagnostiquer précocement les maladies est un défi à relever pour améliorer la prise en charge des patients concernés et leur offrir une meilleure qualité de vie. Les analyses 'omiques', qui quantifient globalement, simultanément et sans a priori l'abondance de milliers de molécules dans les liquides biologiques, s'avèrent très prometteuses pour l'identification de biomarqueurs précoces des maladies complexes. Dans ce contexte, mon travail de thèse avait pour objectif de développer des outils de diagnostics, à partir d'analyses du peptidome et métabolome urinaire, pour détecter précocement la présence d'une maladie rénale chronique (MRC) et la survenue de ses complications cardiovasculaires. La première étude, insérée dans le projet européen 4C (Cardiovascular Complications in Children with Chronic kidney disease), s'est centrée sur les complications cardiovasculaires associées à la MRC en pédiatrie. Ces complications constituent la principale cause de mortalité des enfants en insuffisance rénale, et leur diagnostic précoce est impossible à ce jour. En analysant par électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse (CE-MS) le peptidome urinaire de 86 enfants souffrant, ou non, de complications cardiovasculaires secondaires à la MRC, nous avons identifié des peptides qui permettent de prédire à l'avance les patients à haut risque cardiovasculaire : 190 peptides étaient associés à l'épaississement de la paroi carotidienne (AUC 0.87, sensibilité 80%, spécificité 100%) et 22 peptides prédisaient l'augmentation de la rigidité artérielle (AUC 0.83, sensibilité 83%, spécificité 70%). Le second projet relevait de la médecine vétérinaire. Dans cette étude menée sur 50 chiens avec et sans MRC, nous avons caractérisé pour la première fois le peptidome urinaire canin via la technologie CE-MS et nous avons découvert 133 peptides urinaires associés à la MRC. Ces derniers ont permis de diagnostiquer la présence d'une MRC dans 80% des chiens. Les métabolites sont mieux corrélés au phénotype que les autres strates moléculaires. Cependant l'apport de la métabolomique en clinique est encore limité, dû au manque de technologies analytiques performantes. Le troisième objectif de ma thèse était donc de mettre au point une procédure de dosage par CE-MS des métabolites urinaires. Grâce à une méthode unique de normalisation interne, basée sur l'utilisation de métabolites endogènes stables, il est maintenant possible d'analyser le contenu en métabolites d'un même échantillon urinaire avec une très haute reproductibilité sur le long terme (4 ans). Comme preuve de concept, nous avons mis en évidence, via cette procédure, la présence d'une combinaison de 32 métabolites dans l'urine qui permet de repérer avec une sensibilité de 76% et une spécificité de 86% les nouveau-nés porteurs d'une malformation rénale obstructive. Enfin, la quatrième problématique s'inscrivait dans une démarche translationnelle. Son but était de développer des aptasenseurs capables de détecter avec de hautes affinités et spécificités les biomarqueurs d'origine omique, pour un diagnostic simple, rapide et à moindre coût. La cible choisie était un fragment urinaire de l'alpha-1-antitrypsine, qui est ~1000 fois plus abondant chez les adultes atteints de MRC que les chez les sains. La sélection de l'aptasenseur s'est faite par le Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX). Nous présentons ici les travaux préliminaires de la mise au point du SELEX sur cette cible. En conclusion, cette thèse démontre le potentiel de l'analyse du contenu urinaire en peptides et métabolites pour le diagnostic précoce des pathologies complexes telles que la MRC et les complications cardiovasculaires associées. De plus l'obtention d'aptasenseurs dirigés contre ces biomarqueurs précoces et utilisables au chevet du patient devrait révolutionner dans le futur les méthodes diagnostiques. / Early diagnosis of diseases is a big challenge to improve patients' health and quality of life. 'Omics' analyses, which allow the global and simultaneous quantification of the relative abundance of thousands of molecules in biological fluids are promising for the identification of early biomarkers of complex diseases. In this context, the objective of my thesis was to develop diagnostic tools, based on urinary peptidome and metabolome analyses, for the early detection of chronic kidney disease (CKD) and associated cardiovascular complications. The first study, as part of the 4C European project (Cardiovascular Complications in Children with Chronic kidney disease), focused on analyzing the cardiovascular complications associated to CKD in children. These complications are the main cause of mortality in children with CKD and their early diagnosis is impossible for now. Analysis of the urinary peptidome of 86 children with or without cardiovascular complications associated to CKD by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry (CE-MS), led to the identification of two sets of peptides for the early prediction of high cardiovascular risk in pediatric patients: 190 peptides were associated to an increase of the carotid intima-media thickness (AUC 0.87, sensitivity 80%, specificity 100%) and 22 peptides were associated to an increase in arterial stiffness (AUC 0.83, sensitivity 83%, specificity 70%). The second study falls in the field of veterinary medicine. In this study, carried out on 50 dogs with or without CKD, we analyzed for the first time the canine urinary peptidome using the CE-MS technology. We identified 133 urinary peptides associated to CKD allowing an accurate diagnosis of CKD in 80% of the dogs. Metabolites correlate best to phenotype compared to other molecular traits. However, the use of metabolomics for identification of clinically relevant biomarkers is very limited due to the lack of high-performance analytical technologies. The third part of my thesis was to develop a procedure for the quantification of urinary metabolites by CE-MS. Using a unique method of internal normalization based on endogenous and stable metabolites, we can now analyze the metabolite content of the same urine sample with a high reproducibility over the long-term (4 years). As a proof-of-concept, we demonstrated that this developed procedure led to the identification of a set of 32 urinary metabolites that allow the early identification of newborns with an obstructive kidney anomaly with a sensitivity of 76% and a specificity of 86%. Finally, the fourth study was dedicated to improving translational research. The aim was to develop aptasensors able to detect 'omics'-identified biomarkers with a high affinity and specificity to obtain a simple, rapid and low-cost diagnostic test. The biomarker chosen as target is a urinary fragment of alpha-1-antitrypsin, which is ~1000 more abundant in adults with CKD compared to healthy subjects. Aptasensors were selected by the Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX). Here we present preliminary work on the development of the SELEX for our target. In conclusion, this thesis shows the strength of the urinary content, in terms of peptides and metabolites, for the early diagnosis of complex pathologies like CKD and the associated cardiovascular complications. Moreover, the selection of aptasensors targeting these early biomarkers and that can be used at bedside, will revolutionize future diagnostic methods.
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Complexation des actinides (III, IV et V) par des acides organiques

Leguay, Sébastien 05 November 2012 (has links) (PDF)
L'acquisition de données structurales et thermodynamiques relatives à des systèmes actinides (An(III), Pu(IV) Pa(V))-acides organiques polyfonctionnels (citrique, NTA, DTPA), en solution aqueuse, vise à une meilleure compréhension des interactions actinides-ligands essentielle à l'optimisation de procédés de séparation, de décorporation, et également à l'évaluation de la sûreté des sites de stockage de déchets radioactifs. Le comportement du protactinium pentavalent à l'échelle des traces en présence des anions citrates et NTA a fait l'objet d'études systématiques par extraction liquide-liquide dans le système TTA/Toluène/HClO₄/NaClO₄/Pa(V)/ligands. Après avoir déterminé l'ordre limite des complexes (3 pour Pa(V)-Cit et 2 pour Pa(V)-NTA), les constantes de formation associées à chaque espèce ont pu être calculées. L'étude multi-technique (électrophorèse capillaire et spectrofluométrie laser) sur la complexation des An(III) par le DTPA, réalisée à plusieurs pH, a permis de mettre en évidence la coexistence des complexes mono-protoné (AnHDTPA-) et déprotoné. (AnDTPA²-) pour des solutions acides et faiblement acides. Une réinterprétation des données de la littérature, en considérant les deux complexes, a permis de faire converger les valeurs des constantes de complexation des espèces qui étaient jusqu'à maintenant dispersées. L'étude thermodynamique a ensuite été complétée par une étude théorique (calculs DFT). La structure des complexes protoné et non protoné et le mode de coordination du Curium ont ainsi été établis. L'étude exploratoire sur la complexation du Pu(IV) par le DTPA dans des conditions de pH proches du milieu biologique a nécessité le développement d'un protocole expérimental en trois étapes : protection de Pu(IV) contre l'hydrolyse avec NTA (pH faible), augmentation du pH vers des conditions neutres, compétition entre la complexation de Pu(IV) par le NTA et le DTPA. Les expériences préliminaires réalisées entre pH 1,5 et 3,5 par électrophorèse capillaire (EC-ICP-MS), semblent indiquer l'existence d'effet cinétique ou/et l'existence d'un complexe mixte. Les interprétations faites lors de cette étude exploratoire sont à confirmer.
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Développement d'une méthode de séparation électrocinétique de biomarqueurs de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine : vers une miniaturisation de l'analyse

Baccouche, Sonia 19 May 2014 (has links) (PDF)
Ces travaux de recherche s'intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d'une transplantation hépatique ou bien encore à l'évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l'essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l'agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d'une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s'est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d'absorbance dans l'ultra-violet et l'autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L'autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l'analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d'investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d'un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d'analyse miniaturisé et simple d'utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d'analyse sur puce microfluidique permettant l'analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d'une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR.
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Développements analytiques pour le criblage d'interactions lanthanides/ligands / Analytical developments for screening of lanthanides/ligands interactions

Varenne, Fanny 03 July 2012 (has links)
Ce travail étudie le potentiel de l'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse à ionisation par plasma (ICP/MS) pour le criblage d'une bibliothèque de ligands en fonction de leur affinité pour l'europium en milieu hydro-organique. Cette méthode permet, d'une part, d'évaluer l'affinité des ligands phosphorés en moins de deux heures et en utilisant moins de 15 ng de ligand, et d'autre part, de déterminer les constantes de complexation. Les résultats sont en accord avec ceux obtenus par titrage spectrophotométrique.Parallèlement, une bibliothèque de copolymères pour l'extraction solide/liquide de l'europium a été étudiée. Le protocole d'extraction mis au point permet de les classer selon leur affinité pour celui-ci en milieu hydro-organique et en utilisant 60 mg de copolymère. Pour les plus prometteurs, les propriétés de reconnaissance et la sélectivité La3+/Eu3+/Lu3+ ont été évaluées. / This work investigates the potential of hyphenated capillary electrophoresis and inductively coupled mass spectrometry to classify different ligands according to their europium binding affinity in a hydro-organic medium. On the one hand, this method enables to evaluate the affinity of phosphorus-containing ligands in less than two hours and using less than 15 ng of ligand. On the other hand, complexation constants could be determined. The results are in excellent agreement with the values obtained by spectrophotometric titrations.Moreover, a library of copolymers for solid/liquid extraction of europium is investigated. The extraction protocol enables to classify copolymers according to their europium affinity in a hydro-organic medium. This screening requires 60 mg of copolymers. For the most promising recognition properties and selectivity La3+/Eu3+/Lu3+ are evaluated.

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