Ο ρόλος της εξωκυττάριας ουσίας στην καρδιακή ανεπάρκεια. / The functional role of extracellular matrix in heart failure.

Τα αστροκυττώματα αποτελούν τη συχνότερη ομάδα νεοπλασμάτων του κεντρικού νευρικού συστήματος. Συνιστούν μία ετερογενή ομάδα σε ότι αφορά τη βιολογική τους συμπεριφορά και την πρόγνωσή τους και παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί στην κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών τους, συνεχίζουν να αποτελούν μια από τις επιθετικότερες μορφές καρκίνου. Ένα από τα βασικότερα χαρακτηριστικά των αστροκυττωμάτων είναι η διηθητική τους ικανότητα δηλαδή η κυτταρική μετακίνηση (cell locomotion) και η αποδόμηση στοιχείων της εξωκυττάριας ουσίας (extracellular matrix degradation) που είναι απαραίτητη για να επιτευχθεί η διήθηση. Η ιδιότητα της κυτταρικής διήθησης καθιστά τα νεοπλάσματα αυτά ιδιαιτέρως καταστροφικά για το νευρικό ιστό και επιπλέον δυσχεραίνει τη θεραπεία τους. Τόσο η χειρουργική αντιμετώπιση όσο και η ακτινοθεραπεία καθίστανται μη επαρκείς για την ριζική αντιμετώπιση των όγκων αυτών. Η παρούσα μελέτη έχει ως σκοπό την μοριακή μελέτη του φαινομένου της κυτταρικής διήθησης και εντοπίζεται κυρίως στους μηχανισμούς διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας. Είναι γεγονός ότι τα τελευταία χρόνια μεγάλη ερευνητική προσπάθεια συντελείται προς την κατεύθυνση αυτή και πολλοί από τους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στη διαδικασία αποδόμησης της εξωκυττάριας ουσίας αρχίζουν να αποσαφηνίζονται. Όμως καθώς η έρευνα προχωρά όλο και περισσότερα δεδομένα αναδεικνύονται γεγονός που υποδηλώνει την πολυπλοκότητα του φαινομένου. Ένα σχετικά πρόσφατα ταυτοποιημένο μόριο η ογκοκατασταλτική πρωτείνη ING-4 (Inhibition of growth) πιστεύεται ότι είναι πιθανόν να εμπλέκεται στον έλεγχο της αποδόμησης στοιχείων της εξωκυττάριας ουσίας. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν τον ρυθμιστικό ρόλο του ING-4 στο μεταγραφικό παράγοντα NF-κB ο οποίος είναι γνωστό ότι αποτελεί κύριο ρυθμιστή της έκφρασης των ενζύμων διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας MMP-2, MMP-9 (matrix metalloproteases 2,9) και του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης u-PA (urokinase-type plasminogen activator). Στη μελέτη αυτή γίνεται εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτείνης ING-4 της p65 υπομονάδας του NF-κB και των ενζύμων MMP-2, MMP-9 και του u-PA με τη χρήση της ανοσοιστοχημικής τεχνικής σε τομές παραφίνης ληφθείσες από 101 περιστατικά αστροκυττωμάτων του ανθρώπου όλων των βαθμίδων διαφοποίησης. Η γνώση του επιπέδου έκφρασης των μορίων αυτών στα αστροκυττώματα καθώς και η μεταξύ τους συσχέτιση αφενώς μεν θα συμβάλει στην κατανόηση των μηχανισμών που ελέγχουν την κυτταρική διήθηση, αφετέρου πιθανόν να αποτελέσει χρήσιμη γνώση για μελλοντικό σχεδιασμό θεραπειών περιορισμού του φαινομένου αυτού. / Inhibitor of growth 4 (ING-4) is a tumor suppressor gene that interacts with nuclear factorkappaB (NF-kB) and represses its transcriptional activity. Several lines of evidence suggest that the tumor suppressor gene ING-4, the transcription factor NF-kB and its target genes matrix metalloproteases MMP-2, MMP-9 and urokinase plasminogen activator (u-PA) are critically involved in tumor invasion. The aim of the present study was to investigate immunohistochemically the expression pattern of ING-4, NF-kB and the NF-kB downstream targets MMP-2, MMP-9 and u-PA in human astrocytomas from 101 patients. We found that ING-4 expression was significantly decreased in astrocytomas, and ING-4 loss was associated with tumor grade progression. Expression of p65, a NF-kB subunit, was significantly higher in grade IV than in grade III and grade I/II tumors, and a statistical significant negative correlation between expression of ING-4 and expression of nuclear p65 was noticed. MMP-9, MMP-2 and u-PA were overexpressed in human astrocytomas. Of note, astrocytomas of advanced histologic grades (grade III, IV) displayed significantly higher expression levels of these proteins compared to tumors of lower grades (grade I, II). Collectively, our data suggest an essential role for ING-4 in human astrocytoma development and progression possibly through regulation of the NF-kB-dependent expression of genes involved in tumor invasion.

Οι πρωτεογλυκάνες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και με άλλα μορφορυθμιστικά μόρια όπως γλυκοπρωτεΐνες και ιντεγκρίνες, καθώς επίσης και με αυξητικούς παράγοντες. Μεγάλο μέρος των ποικίλων λειτουργιών των πρωτεογλυκανών συνδέεται με τις γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες (GAGs) τους. Για να μελετήσουμε τη λειτουργία των πρωτεογλυκανών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου όρνιθας χρησιμοποιήσαμε το β-D-xyloside, έναν εξειδικευμένο αναστολέα της βιοσύνθεσης των πρωτεογλυκανών και ειδικότερα της πρόσδεσης των αλυσίδων γλυκοζαμινογλυκανών στον πρωτεϊνικό κορμό των πρωτεογλυκανών. Χαμηλές συγκεντρώσεις β-xyloside που είναι γνωστό ότι αναστέλλουν την προσθήκη θειϊκής χονδροϊτίνης αλλά όχι της θειϊκής ηπαράνης στον πρωτεϊνικό κορμό, αποτελούν ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου των πρωτεογλυκανών. Τα πρότυπα των πρωτεϊνών στα έμβρυα που μεταχειρίστηκαν με β-xyloside έδειξαν μετατόπιση των ραδιενεργών κορυφών σε μικρότερη μοριακή μάζα που φαίνεται να οφείλεται στη μείωση του μεγέθους πρωτεογλυκανών. Ήταν αξιοσημείωτο στα αποτελέσματά μας ότι το β-xyloside μετέβαλλε τη μορφή της πρωτεογλυκάνης θειϊκής χονδροϊτίνης decorin προς χαμηλότερα μοριακά βάρη ενώ δε φάνηκε να επηρεάζει το μέγεθος της πρωτεογλυκάνης θειϊκής ηπαράνης perlecan. Στα έμβρυα που μεταχειρίστηκαν με β-xyloside περισσότερη πρωτεϊνη συντέθηκε στα έμβρυα του σταδίου ΧΙΙ (μορίδιο), σε σχέση με αυτά του σταδίου ΗΗ2 (αρχή πρωτογενούς αύλακας/πρώιμο γαστρίδιο), συγκρινόμενα με τα αντίστοιχα έμβρυα μάρτυρες. Αυτό θα μπορούσε να αντανακλά μια επιταχυνόμενη κινητοποίηση και/ή μια μετάφραση των ωογενετικών μεταγράφων στα έμβρυα του σταδίου ΧΙΙ, όταν διαταράχτηκε ο μεταβολισμός των πρωτεογλυκανών. Η απορρύθμιση πρωτεογλυκανών, τροποποιώντας τη λειτουργικότητα και επηρεάζοντας το επίπεδο έκφρασής τους, είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία του πρώιμου εμβρύου να δομήσει την εξωκυττάρια ύλη φυσιολογικά. Το αποτέλεσμα ήταν η κατάρρευση της τυπικής αρχιτεκτονικής του πρώιμου εμβρύου στα πειράματά μας. Πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης φαίνεται να χρειάζονται για την οργάνωση του σταδίου του βλαστιδίου της όρνιθας. Για την επαγωγή του νευρικού συστήματος φάνηκε να χρειάζονται πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης/δερματάνης που έχουν συγκεντρωθεί από το στάδιο πριν την έναρξη των μορφογενετικών κινήσεων της γαστριδίωσης και η συνεχής βιοσύνθεση των πρωτεογλυκανών είναι απαραίτητη για τη μορφογένεση του νευρικού σωλήνα. Μελετήσαμε επίσης το πρότυπο κατανομής της συνδετικής πρωτεϊνης πρωτεογλυκανών με ανοσοφθορισμό και ανοσοκατακρήμνιση και το ρόλο αυτής της γλυκοπρωτεϊνης με τη χρήση αντισωμάτων έναντι αυτής. Η συνδετική πρωτεΐνη μεσολαβεί στην πρόσδεση στο υαλουρονικό οξύ πρωτεογλυκανών όπως οι aggrecan, neurocan, versican και brevican δημιουργώντας σταθερά σύμπλοκα στην εξωκυττάρια ύλη. Η αναγνώριση των μορφών της συνδετικής πρωτεΐνης 1 (LP1, 48kDa) και συνδετικής πρωτεΐνης 2 (LP2, 44kDa) στο πρώιμο έμβρυο ήταν επίσης ένα ενδιαφέρον εύρημα των πειραμάτων μας. Είναι γνωστό ότι συνδυασμοί των LP1 και LP2 δημιουργούν πιο σταθερά σύμπλοκα απ’ ότι μόνο του το καθένα από τα δύο μόρια αυτά. Αυτό φαίνεται και από τα πειράματά μας που δείχνουν ότι η aggrecan (180kDa) φαίνεται να συν-κατακρημνίζεται με τις συνδετικές πρωτεΐνες LP1 και LP2. Τα πειράματα ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η συνδετική πρωτεΐνη αρχίζει να εκφράζεται στο στάδιο του βλαστιδίου και επιδεικνύει μια διαφορική έκφραση χωρο-χρονικά κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου υποδεικνύοντας ότι είναι σημαντική στην κυτταρική μετανάστευση και διαφοροποίηση κυττάρων και στη μορφογένεση ιστών και οργάνων. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από τη μελέτη του ρόλου της, στην επόμενη σειρά πειραμάτων μας με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος έναντι αυτής. Η αναστολή της λειτουργίας της συνδετικής πρωτεϊνης με τη χρήση αντισωμάτων έναντι αυτής έδειξε ότι αυτή η πρωτεϊνη φαίνεται να είναι σημαντική στην οργάνωση της νευρικής πλάκας και τη μορφογένεση του νευρικού σωλήνα, στη μορφογένεση του καρδιακού σωλήνα, του εντέρου, στο σχηματισμό της ραχιαίας αορτής και στην επιθηλιοποίηση των σωμιτών. / Proteoglycans participate in cellular interactions via modulating the effects of growth factors or with other mechanisms in early embryo. The majority of the functions of proteoglycans are associated with the glycosaminoglycan (GAG) chains. We used β-D-xyloside, an inhibitor of proteoglycan synthesis and specifically of GAG attachment to proteoglycan core proteins, to study proteoglycan functions in early chick embryo development. Low concentrations of β-xyloside which are known to affect differentially chondroitin but not heparan sulfate proteoglycan biosynthesis have provided a convenient tool for altering proteoglycan production. The protein patterns of xyloside-treated embryos showed a shift of radioactive peaks to lower molecular mass which could be attributed to the reduction of proteoglycan size as was demonstrated by chondroitinase ABC/AC II treatments. It was notable in our data that β-xyloside altered the chondroitin sulfate proteoglycan decorin to lower molecular mass while it did not seem to affect the size of the heparin sulfate proteoglycan perlecan. More protein was synthesized from xyloside-treated embryos at stage XII (morula) than from embryos at stage HH2 (initial primitive streak/early gastrula) when compared to the controls. This could have reflected an accelerated translation and/or mobilization of oogenetic transcripts in embryos at stage XII when proteoglycan metabolism was disrupted. Misregulation of proteoglycans by modulating the functionality of the protein and by influencing their expression level resulted in an inability of the early embryo to assemble a stable extracellular matrix that would have been normally produced. These changes were associated with the collapse of the typical blastula architecture and inhibition of the induction of mesoderm in the chick embryo. Induction of neuroectoderm required proteoglycans assembled before the initiation of gastrulation movements. However, sustained proteoglycan biosynthesis was required for the morphogenetic movements to form the neural tube and the rest of the embryonic axis. We also studied the spatiotemporal distribution pattern of link protein by immunofluorescence and immunoprecipitation and the role of this glycoprotein by blocking antibodies in the early chick embryo. The recognition of the link protein 1 (LP1, 48 kDa) and link protein 2 (LP2, 44 kDa) types was an important finding of our study. Link protein links several proteoglycans, such as aggrecan to hyaluronan, creating stable aggregates in the extracellular matrix and has a general function in the organization of the extracellular matrix. It is known that combinations of LP1 and LP2 create more stable complexes than the individual link protein molecule. This was also shown in our experiments, in that aggrecan (180kDa) co-precipitated with LP1 and LP2. Our immunofluorescent experiments showed that link protein expression was first detectable at the blastula stage (st. XIII) and its presence may be fundamental as the first extracellular matrix starts to assemble before the initiation of the first major cellular migrations during the gastrula stage. Link protein influorescence was strong in the cells ingressing through the primitive streak and in the migrating cells in embryos at stage HH3 (intermediate streak/mid-gastrula). At stage HH4 (definitive streak/late gastrula), link protein fluorescence was strong at the apical surface of the neural plate. At stage HH4-5 (head process), link protein fluorescence was strong at the apical surface of the neural folds, notochord and endoderm. At stage HH13 (19 somites), link protein fluorescence was intense in the encephalic vesicles, in the extracellular matrix, in the lumen of encephalic vesicles, intense in migrating neural crest cells, neural tube and in notochord, strong in gut lower wall, hard tube and dorsal aorta wall, intense in dermomyotome and strong in sclerotome in somites. By stage HH17 (29 somites), link protein fluorescence was strong in neuroepithelium and extracellular matrix in the lumen of the diencephalon, strong in neural crest cells, in the intraretinal space in the eye, in myocardium and endocardium, in dorsal aorta, in dermomyotome, the outer surface of pharyngeal arches wall of aortic arches and intense in thyroid rudiment. Inhibition of function of link protein by blocking antibodies showed that link protein was important in neuroepithelial tissue organization and neural tube closure, in normal differentiation of the neural tube to form the brain, in the morphogenesis of the heart tube, the dorsal aorta and gut and in somite epithelialization.