Οι θειωμένες γλυκοζαμινογλυκάνες είναι σημαντικά μόρια του εξωκυττάριου χώρου που επιτελούν σημαντικές διεργασίες. Η βιοσύνθεσή τους επιτυγχάνεται με τη συμμετοχή πολλών ενζύμων που έχουν διάφορους ρόλους. Τα κυριότερα ένζυμα που βιοσυνθέτουν θειική χονδροϊτίνη/ δερματάνη είναι οι συνθάσες χονδροϊτίνης, οι γλυκοσυλοτρανσφεράσες, οι σουλφοτρανσφεράσες και η επιμεράση της θειικής δερματάνης. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης έχουν διττό ρόλο, γιατί έχουν δύο ενεργά κέντρα: Το ένα προσθέτει γλυκουρονικό οξύ και το άλλο Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη στο μη αναγωγικό άκρο μιας νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Παράλληλα, οι σουλφοτρανσφεράσες προσθέτουν θειικά σε συγκεκριμένες θέσεις ενώ η επιμεράση μετατρέπει κατάλοιπα γλυκουρονικού σε ιδουρονικό πριν συμβεί θείωση του δισακχαρίτη. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης είναι οι εξής: CHSY1, CHSY2 (CHPF) και CHSY3. Η γλυκουρονυλοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είναι η CSGlcA-T. Οι κυριότερες σουλφοτρανσφεράσες είναι οι C4ST1, D4ST1 και CHST3. Η μελέτη των ενζύμων αυτών στον καρκίνο είναι εξαιρετικού ενδιαφέροντος, γιατί έχει βρεθεί ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες συμμετέχουν στην ανάπτυξη του καρκίνου. Έχει παρατηρηθεί ότι οι γλυκοζάμινογλυκάνες υφίστανται ποιοτικές και ποσοτικές μεταβολές στους διάφορους καρκίνους. Οι μεταβολές αυτές φαίνεται να συμβάλλουν τόσο στην ανάπτυξη του καρκίνου όσο και στον φαινότυπό του. Η κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν στις μεταβολές των γλυκοζαμινογλυκανών είναι πολύ σημαντική. Η μελέτη επικεντρώθηκε στις μεταβολές που υφίστανται τα παραπάνω ένζυμα στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του λάρυγγα. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: RT-PCR ανάλυση έπειτα από απομόνωση ολικού RNA, Western blotting ύστερα από διαδοχική εκχύλιση με PBS, υδροχλωρική γουανιδίνη και υδροχλωρική γουανιδίνη Triton-X100 για τη διερεύνηση της έκφρασης των γονιδίων, μεθυλοειδική PCR (MSP) για τη διερεύνηση των επιγενετικών μηχανισμών μετά από απομόνωση DNA και μέτρηση της δραστικότητας C-4 σουλφοτρανσφεράσης με χρήση αποθειωμένης δερματάνης ως υπόστρωμα. Στα δείγματα του παχέος εντέρου, η έκφραση της συνθάσης χονδροϊτίνης Ι ήταν υψηλότερη στα πρώτα στάδια του καρκίνου. Επίσης, ήταν αρκετά υψηλή στα μακροσκοπικά φυσιολογικά δείγματα που είναι παρακείμενα στους καλοήθεις όγκους. Στους τελευταίους και στους υγιείς ιστούς δεν υπήρχε σημαντική έκφραση του ενζύμου. Όσον αφορά τον λάρυγγα η έκφραση ήταν υψηλή στα παθολογικά δείγματα και ελαφρώς χαμηλότερη στα υγιή. Τα φυσιολογικά δείγματα δεν παρουσίαζαν σημαντική έκφραση του ενζύμου. Ο παράγοντας πολυμερισμού της χονδροϊτίνης, είχε υψηλότερη έκφραση στα παθολογικά δείγματα σε σχέση με τα φυσιολογικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Επίσης, φαίνεται να αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα με το στάδιο του καρκίνου. Η έκφρασή του στους υγιείς ιστούς και στους παρακείμενους μακροσκοπικά φυσιολογικούς ιστούς των αδενωμάτων ήταν περιορισμένη. Αντίθετα, στα λαρυγγικά δείγματα η έκφρασή του ήταν αυξημένη στους υγιείς ιστούς. Η γλυκουρονυλoτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είχε περιορισμένη και σταθερή έκφραση στα πρώτα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου αλλά στα ανώτερα στάδια αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στη έκφραση των γονιδίων συνθάση χονδροϊτίνης ΙΙΙ και 6-σουλφοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου ή του λάρυγγα. Παρόλο αυτά, στον υγιή λάρυγγα τα δύο αυτά ένζυμα εκφράζονταν περισσότερο από τον καρκίνο. Το αντίθετο ισχύει για το υγιές παχύ έντερο που παρουσίαζε περιορισμένη έκφραση των δύο αυτών γονιδίων σε σχέση με τον καρκίνο. Τα επίπεδα mRNA της C-4 σουλφοτρανσφεράσης της θειικής δερματάνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου φαίνεται να μειώθηκαν με το στάδιο του καρκίνου αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ήταν σταθερά. Στην υγιή κατάσταση το ένζυμο υποεκφραζόταν αλλά το αντίθετο ίσχυε για τα λαρυγγικά δείγματα. Επίσης, η περιοχή του υποκινητή του γονιδίου που εξετάστηκε παρέμενε πλήρως αμεθυλίωτη τόσο στα λαρυγγικά όσο και στα δείγματα του παχέος εντέρου κάτι που σημαίνει ότι πιθανώς δεν υπάρχει ρύθμιση της έκφρασης με μηχανισμό μεθυλίωσης του υποκινητή. Τα επίπεδα mRNA της επιμεράσης της θειικής δερματάνης ήταν αυξημένα στα παθολογικά δείγματα στα ανώτερα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η έκφραση αυτή φαίνεται να επηρεάζεται από τη μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Στα λαρυγγικά δείγματα δεν έγινε ανίχνευσή της στα φυσιολογικά δείγματα παρά μόνο στα παθολογικά και σε μικρότρο βαθμό στα υγιή. Σε ορισμένα τουλάχιστον παθολογικά λαρυγγικά δείγματα φαίνεται να υπάρχει υπομεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Σε αυτό το σημείο φαίνεται να υπάρχει ομοιότητα στη ρύθμιση των διαφορετικών καρκίνων. Η εκχυλισιμότητα των ενζύμων στο PBS τόσο στα λαρυγγικά όσο και στα δείγματα του παχέος εντέρου κατέδειξε ότι ένα σημαντικό μέρος τους εκκρίνεται από τα κύτταρα. Σε προηγούμενες μελέτες η παρουσία τέτοιων ενζύμων (CHSY1, C4ST1 και D4ST1) στο θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών έχει ταυτοποιηθεί. Το ένζυμο που συγκρατείται περισσότερο και έχει τη μικρότερη παρουσία στον εξωκυττάριο χώρο είναι ο CHPF που εκχυλίζεται κυρίως στην GdnHCl. Επιπλέον, αξιοσημείωτη εκχυλισιμότητα τόσο στην GdnHCl όσο και την GdnHCl-Triton X100 παρουσίασε η CHSY1 η οποία ανιχνεύθηκε σε μεγάλη ποσότητα και στα εκχυλίσματα PBS. Όλα τα υπόλοιπα ένζυμα βρέθηκαν κυρίως σε εκχυλίσματα PBS (CHST3, D4ST1, C4ST1 και CHSY3). Τέλος, μελετήθηκαν και κάποια άλλα μόρια στον καρκίνο του παχέος εντέρου-υποστρώματα των ενζύμων- για να εξεταστεί η πιθανή συσχέτισή τους με την έκφραση των ενζύμων: Τα επίπεδα mRNA της διακοσμητίνης, ήταν υψηλότερα στους υγιείς ιστούς. Στον καρκίνο, σε όλα τα φυσιολογικά δείγματα η έκφρασή της ήταν αυξημένη σε σχέση με τα παθολογικά. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης με το στάδιο του καρκίνου τόσο στα φυσιολογικά όσο και τα παθολογικά δείγματα. Η ισομορφή V0 της βερσικάνης ήταν αυξημένη στον καρκίνο (στα ίδια επίπεδα ανάμεσα στους φυσιολογικούς και τους αντίστοιχους παθολογικούς ιστούς) σε σχέση με την υγιή κατάσταση. Με το στάδιο υπήρχε αύξηση. Αντίθετα η ισομορφή V1 της βερσικάνης είχε τα υψηλότερα επίπεδα mRNA στα υγιή δείγματα και ταυτόχρονα υπήρχε μείωση με το στάδιο τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα παθολογικά δείγματα. Οι ισομορφές V2 κια V3 ήταν στα ίδια επίπεδα στους υγιείς, φυσιολογικούς και παθολογικούς ιστούς και δεν παρατηρήθηκε καμία διαφοροποίηση στην έκφρασή τους με το στάδιο του καρκίνου. Από προηγούμενες μελέτες στον καρκίνο του λάρυγγα έχει παρατηρηθεί ότι με το στάδιο του καρκίνου υπάρχει συνεχής μείωση της θειικής χονδροϊτίνης και της θειικής δερματάνης σε σχέση με την υγιή κατάσταση. Πιο συγκεκριμένα υπάρχει δραματική μείωση με το στάδιο της C-6 θείωσης ενώ η μείωση της C-4 θείωσης γίνεται βαθμιαία. Η γενική μείωση της θειικής χονδροϊτίνης και θεικής δερματάνης μπορεί να εξηγηθεί από τη μεγάλη μείωση που παρατηρήθηκε στον CHPF και την CHSY3 στον καρκίνο σε σχέση με τον υγιή λάρυγγα. Η αμυδρή αύξηση της CHSY1 και της CSGlcA-T δεν μπορούν να οδηγήσουν σε αύξηση της CS/ DS. Επιπλέον, η μείωση της CHST3 στον καρκίνο πρέπει να οδηγεί και στην σχετική μείωση της C-6 θείωσης. Επίσης, είναι γνωστό ότι η CHSY1 ευνοεί περισσότερο τη C-4 θείωση τόσο στην χονδροϊτίνη όσο και στην δερματάνη. Η αυξημένη C-4 θείωση πρέπει να οφείλεται σε θειική χονδροϊτίνη, γιατί ενώ η D4ST1 μειωνόταν σε σχέση με την υγιή κατάσταση η C4ST1 αυξανόταν. Επιπλέον, ο CHPF που επίσης μειωνόταν στον καρκίνο ευνοεί περισσότερο τη C-6 θείωση. Σε αυτό το σημείο πρέπει να αναφερθεί ότι τα καλύτερα υποστρώματα για όλες τις συνθάσες χονδροϊτίνης είναι η αθείωτη πολυμερής χονδροϊτίνη και η CSC. Σε προηγούμενες μελέτες που αφορούν τον καρκίνο του παχέος εντέρου έχει παρατηρηθεί αύξηση της C-6 θείωσης και σχετική μείωση της C-4 θείωσης. Η C-6 θείωση φαίνεται να αυξάνεται και με το στάδιο του καρκίνου ενώ η C-4 θείωση τείνει να μειώνεται. Τα αποτελέσματα αυτά μπορούν να εξηγηθούν από τη μείωση της CHSY1 και της C4ST1 στα ανώτερα στάδια καθώς και στην ταυτόχρονη αύξηση του CHPF. Είναι αξιοσημείωτο το ότι δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στα επίπεδα πρωτεΐνης με το στάδιο του καρκίνου στην CHST3 ή την D4ST1. Παρόλο αυτά, στην υγιή κατάσταση (όπου η παρουσία χονδροϊτίνης-δερματάνης είναι περιορισμένη) τα ένζυμα εκφράζονταν ελάχιστα. Επιπλέον, τα επίπεδα του miR124 ήταν σταθερά. Συμπερασματικά, τα γονίδια βιοσύνθεσης των θειωμένων γλυκοζαμινογλυκανών υφίστανται μεταβολές στην έκφρασή τους στον καρκίνο του παχέος εντέρου συμμετέχοντας στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου. Έτσι, πρωτεογλυκάνες που περιέχουν γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες με συγκεκριμένες ιδιότητες επηρεάζουν την κυτταρική σηματοδότηση. Η διαλεύκανση των μηχανισμών που επηρεάζουν την έκφραση των βιοσυνθετικών ενζύμων των γλυκοζαμινογλυκανών είναι μεγάλης σημασίας. / Sulfated glycosaminoglycans are important molecules of the extracellular matrix. Their biosynthesis is accomplished by the contribution of many different enzymes which have distinct roles. The most important enzymes in the chondroitin/ dematan sulfate biosynthesis are chondroitin synthases, glycosyltransferases, sulfotransferases and dermatan sulfate epimerase (DSE). Chondroitin synthases possess dual role containing two different active sites: One adding glucuronic acid and one adding N-acetylgalacosamine in the non-reducing end of a synthesizing chain. In parallel, sulfotransferases modify the newly-synthesized chains by adding sulfate in certain positions. The chondroitin synthases are CHSY1, CHSY2 (CHPF) and CHSY3. The glycosyltransferase acting in chondroitin is CSGlcA-T. Prior to sulfation, dermatan sulfate epimerase converts glucuronic acid to iduronic. The main sulfotransferases are C4ST1, D4ST1 and CHST3. CHST3 and C4ST1 acting mainly in chondroitin whereas D4ST1 acts mainly in dermatan. It was observed that the various glycosaminoglycans undergo many alterations in quantitative and qualitative terms. These alterations seem to contribute in cancer development and progression as well as in cancer phenotype. The deep understanding of the mechanisms which lead in glycosaminoglycan changes is of great importance. The study focuses in the variation of the levels of the chondroitin / dermatan polymerizing and modifying enzymes in healthy and cancerous tissues (both macroscopically normal and pathological specimens) in colorectal and laryngeal cancer.RT-PCR analysis was carried out to determine the expression of these enzymes after RNA isolation. For Western blotting tissue samples were subjected to sequential extraction with PBS, 4 M guanidine hydrochloride and 4 M guanidine hydrochloride – 1% Triton X-100. For epigenetic studies, methylation-specific PCR was carried out after DNA isolation. Furthermore, we have examined the levels of other molecules (decorin, versican isoforms and miR124) to find out if their presence can be correlated with the obtained enzymes’ profile. In colorectal samples, chondroitin synthase I expression was higher in the adjacent normal tissue of the benign tumors. In healthy tissues and benign tumors the enzyme was expressed in trivial amounts. In cancer, its expression was high at early stages. In laryngeal samples, chondroitin synthase I was expressed mainly in the pathologic samples and to a lower extent in the healthy specimens. Trivial amounts of the enzyme were detected in the pathologic samples. Chondroitin polymerizing factor was found to be elevated in colorectal cancer in the pathologic specimens compared to macroscopically normal. Furthermore, its mRNA levels had the tendency to elevate progressively with cancer stage in the pathologic specimens. In healthy samples and the adjacent normal specimens of the benign tumors its expression was trivial. In contrast in laryngeal samples the enzyme was elevated in the healthy tissues. In colorectal tissues CSGlcA-T expression was increased in adenomas (in the pathological parts) and in advanced stages of the disease. In the middle stages its expression is relatively suppressed and the tumors possess the same amount of the enzyme with the adjacent macroscopically normal tissue. No significant differences between macroscopically normal and pathologic specimens were observed at the levels of chondroitin-6-sulfotransferase and chondroitin synthase III in both laryngeal and colorectal cancer. Besides, in healthy larynx the specified enzymes were expressed intensively compared to cancer but the opposite profile was obtained in colon. In colorectal cancer, dermatan-4-sulfotransferase mRNA levels were in decreasing amounts in both macroscopically normal and cancerous tissues but its protein levels were constant in cancer. In laryngeal samples D4ST1 was expressed mainly in the healthy tissues but the oppοsite profile was obtained for colorectal samples. The CpG island near the promoter region of the D4ST1 gene in both colorectal and laryngeal cancer was fully unmethylated therefore it did not affect the enzyme expression another regulatory mechanism(s) should be considered. C4ST1 levels were trivial in healthy tissues and pre-cancerous situations in colon samples. In advanced stages C4ST1 was expressed about at the same levels in both normal and cancerous specimens. Its promoter was heavily methylated in the pathologic specimens but the unmethylated allele was not intense possibly due to semimethylation. In laryngeal tissues, C4ST1 gene expression was very low in healthy specimens and increased in patients' specimens. Its expression seemed to be controlled via methylation of a CpG island, since hypomethylation of the gene was observed in the pathologic samples compared to the macroscopically normal samples RT-PCR analysis indicated that in colorectal cancer dermatan sulfate epimerase mRNA levels were elevated in the pathologic specimens in the advanced stages. All the macroscopically normal specimens as well as the pathologic specimens of early stage of cancer possessed trivial amounts. MSP revealed that the mRNA levels observed correlate with the promoters’ methylation status. In laryngeal tissues, dermatan sulfate epimerase mRNA was detected in healthy and mainly in the pathologic specimens but not in the corresponding normal tissues. Relative hypomethylation of its promoter was observed in some pathologic specimens. The extractability of the studied enzymes in PBS in both laryngeal and colorectal samples indicated that a major part of them is secreted from the cells. In previous studies, the presence of such enzymes (CHSY1, D4ST1 and C4ST1) in the conditioned medium in cultured cells was also identified. The most “restrained” enzyme is CHPF which was extracted mainly in GdnHCl. CHSY1 showed a remarkable extractability in both GdnHCl and GdnHCl-Triton X100 but it was also detected in great amounts in the PBS extracts. All the other enzymes were found mainly in the PBS extracts (CHST3, D4ST1, C4ST1 and CHSY3). We have also studied some other molecules to find out if they have acorrelation with the enzymes’ profile in colorectal cancer: Decorin mRNA levels were the highest in the healthy tissues. In cancer, in all the normal specimens its expression was found to be elevated compared to pathological specimens. Furthermore, a stage-related decrease was observed in both normal and cancerous specimens. Versican-V0 isoform was increased in cancer (in normal and pathological specimens) compared to the healthy specimens with no significant differences between them. By stage, the mRNA levels increased. On the other hand, versican-V1 mRNA levels were the highest in the healthy specimens. Both normal and cancerous specimens contained similar levels of its mRNA which was in decreasing amounts by stage. Versican-V2 and V3 isoforms were similar in healthy, normal and cancerous specimens without any change in the various cancer stages. The present study took place in order to explain the chondroitin/ dermatan sulfate profiles obtained in colorectal and laryngeal cancer in previous studies. In laryngeal cancer, it was indicated that in the cartilaginous parts the chondroitin/dermatan profile is intensively altered in the advanced stages of cancer compared to the healthy cartilage: It was observed that the healthy laryngeal cartilage possesses great amounts of chondroitin/dermatan sulfate which in cancer are decreased. We have found that CHSY3 and CHSY2 were significantly decreased, whereas CHSY1 and CSGlcA-T were slightly increased. Since the decrease of CHSY2 and CHSY3 were very high compared to the increase of the latter, the general decrease of CS/DS is explained. The obtained sulfation profile by previous stydies indicated a dramatic decrease of C-6 sulfation and a more stagy loss of C-4 sulfation. This profile is explainable because CSA and mainly CSB (the C-4 sulfated chondroitin and dermatan sulfate, respectively) are synthesized preferentially by CHSY1. Furthermore, CHST3 gene expression was decreased in cancer compared to healthy tissues profoundly leading to C-6 sulfation decrease. D4ST1 gene expression was decreased, whereas C4ST1 gene was expressed more in the cancerous parts than in the macroscopically normal. Consequently, C-4 sulfation in CS-disaccharides could be relatively augmented in cancer but C-4 sulfation in DS-disaccharides decreased, yielding to an overall gradual C-4 sulfation decrease. Therefore, the C-4 sulfation is favored in cancer. CHPF preferentially synthesizes C-6 chondroitin sulfate. It is noteworthy that all chondroitin synthases prefer nonsulfated and CSC substrates. However, it has been shown that chondroitin polymerization is achieved by formation of complexes between the various chondroitin synthases and CSGlcA-T In colorectal cancer, an increase in absolute amounts of Δdi-6S together with a decrease of Δdi-4S was noted, both having a stage-related order. The amounts of Δdi-6S observed in the pathologic parts followed a stage-related increase. A quite different profile was obtained in the case of Δdi-4S, where its amounts were found to be increased in stage I, compared to healthy. Thereafter Δdi-4S amounts showed a tendency to become lower as the stage of cancer increased. These results can be explained by the decreased expression of CHSY1 and C4ST1 in the advancced stages and the inctrased expression of CHPF. It is noteworthy that significant changes in CHST3 and D4ST1 between the various cancer stages were not observed. In healthy samples which contain the smallest quantity of CS/ DS the latter enzymes were slightly expressed. In addition, we have studied the levels of miR124 which were found constant. In conclusion, the various glycosaminoglycan synthesizing enzymes showed different expression pattern in cancer implying specific roles in cancer development and progression. As a result, the formation of proteoglycans with characteristic features affects the cell signaling. The elucidation of the mechanisms which are involved in the expression of the glycosaminoglycan synthesizing enzymes is of great interest.

-- / --

Οι πρωτεογλυκάνες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και με άλλα μορφορυθμιστικά μόρια όπως γλυκοπρωτεΐνες και ιντεγκρίνες, καθώς επίσης και με αυξητικούς παράγοντες. Μεγάλο μέρος των ποικίλων λειτουργιών των πρωτεογλυκανών συνδέεται με τις γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες (GAGs) τους. Για να μελετήσουμε τη λειτουργία των πρωτεογλυκανών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου όρνιθας χρησιμοποιήσαμε το β-D-xyloside, έναν εξειδικευμένο αναστολέα της βιοσύνθεσης των πρωτεογλυκανών και ειδικότερα της πρόσδεσης των αλυσίδων γλυκοζαμινογλυκανών στον πρωτεϊνικό κορμό των πρωτεογλυκανών. Χαμηλές συγκεντρώσεις β-xyloside που είναι γνωστό ότι αναστέλλουν την προσθήκη θειϊκής χονδροϊτίνης αλλά όχι της θειϊκής ηπαράνης στον πρωτεϊνικό κορμό, αποτελούν ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου των πρωτεογλυκανών. Τα πρότυπα των πρωτεϊνών στα έμβρυα που μεταχειρίστηκαν με β-xyloside έδειξαν μετατόπιση των ραδιενεργών κορυφών σε μικρότερη μοριακή μάζα που φαίνεται να οφείλεται στη μείωση του μεγέθους πρωτεογλυκανών. Ήταν αξιοσημείωτο στα αποτελέσματά μας ότι το β-xyloside μετέβαλλε τη μορφή της πρωτεογλυκάνης θειϊκής χονδροϊτίνης decorin προς χαμηλότερα μοριακά βάρη ενώ δε φάνηκε να επηρεάζει το μέγεθος της πρωτεογλυκάνης θειϊκής ηπαράνης perlecan. Στα έμβρυα που μεταχειρίστηκαν με β-xyloside περισσότερη πρωτεϊνη συντέθηκε στα έμβρυα του σταδίου ΧΙΙ (μορίδιο), σε σχέση με αυτά του σταδίου ΗΗ2 (αρχή πρωτογενούς αύλακας/πρώιμο γαστρίδιο), συγκρινόμενα με τα αντίστοιχα έμβρυα μάρτυρες. Αυτό θα μπορούσε να αντανακλά μια επιταχυνόμενη κινητοποίηση και/ή μια μετάφραση των ωογενετικών μεταγράφων στα έμβρυα του σταδίου ΧΙΙ, όταν διαταράχτηκε ο μεταβολισμός των πρωτεογλυκανών. Η απορρύθμιση πρωτεογλυκανών, τροποποιώντας τη λειτουργικότητα και επηρεάζοντας το επίπεδο έκφρασής τους, είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία του πρώιμου εμβρύου να δομήσει την εξωκυττάρια ύλη φυσιολογικά. Το αποτέλεσμα ήταν η κατάρρευση της τυπικής αρχιτεκτονικής του πρώιμου εμβρύου στα πειράματά μας. Πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης φαίνεται να χρειάζονται για την οργάνωση του σταδίου του βλαστιδίου της όρνιθας. Για την επαγωγή του νευρικού συστήματος φάνηκε να χρειάζονται πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης/δερματάνης που έχουν συγκεντρωθεί από το στάδιο πριν την έναρξη των μορφογενετικών κινήσεων της γαστριδίωσης και η συνεχής βιοσύνθεση των πρωτεογλυκανών είναι απαραίτητη για τη μορφογένεση του νευρικού σωλήνα. Μελετήσαμε επίσης το πρότυπο κατανομής της συνδετικής πρωτεϊνης πρωτεογλυκανών με ανοσοφθορισμό και ανοσοκατακρήμνιση και το ρόλο αυτής της γλυκοπρωτεϊνης με τη χρήση αντισωμάτων έναντι αυτής. Η συνδετική πρωτεΐνη μεσολαβεί στην πρόσδεση στο υαλουρονικό οξύ πρωτεογλυκανών όπως οι aggrecan, neurocan, versican και brevican δημιουργώντας σταθερά σύμπλοκα στην εξωκυττάρια ύλη. Η αναγνώριση των μορφών της συνδετικής πρωτεΐνης 1 (LP1, 48kDa) και συνδετικής πρωτεΐνης 2 (LP2, 44kDa) στο πρώιμο έμβρυο ήταν επίσης ένα ενδιαφέρον εύρημα των πειραμάτων μας. Είναι γνωστό ότι συνδυασμοί των LP1 και LP2 δημιουργούν πιο σταθερά σύμπλοκα απ’ ότι μόνο του το καθένα από τα δύο μόρια αυτά. Αυτό φαίνεται και από τα πειράματά μας που δείχνουν ότι η aggrecan (180kDa) φαίνεται να συν-κατακρημνίζεται με τις συνδετικές πρωτεΐνες LP1 και LP2. Τα πειράματα ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η συνδετική πρωτεΐνη αρχίζει να εκφράζεται στο στάδιο του βλαστιδίου και επιδεικνύει μια διαφορική έκφραση χωρο-χρονικά κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου υποδεικνύοντας ότι είναι σημαντική στην κυτταρική μετανάστευση και διαφοροποίηση κυττάρων και στη μορφογένεση ιστών και οργάνων. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από τη μελέτη του ρόλου της, στην επόμενη σειρά πειραμάτων μας με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος έναντι αυτής. Η αναστολή της λειτουργίας της συνδετικής πρωτεϊνης με τη χρήση αντισωμάτων έναντι αυτής έδειξε ότι αυτή η πρωτεϊνη φαίνεται να είναι σημαντική στην οργάνωση της νευρικής πλάκας και τη μορφογένεση του νευρικού σωλήνα, στη μορφογένεση του καρδιακού σωλήνα, του εντέρου, στο σχηματισμό της ραχιαίας αορτής και στην επιθηλιοποίηση των σωμιτών. / Proteoglycans participate in cellular interactions via modulating the effects of growth factors or with other mechanisms in early embryo. The majority of the functions of proteoglycans are associated with the glycosaminoglycan (GAG) chains. We used β-D-xyloside, an inhibitor of proteoglycan synthesis and specifically of GAG attachment to proteoglycan core proteins, to study proteoglycan functions in early chick embryo development. Low concentrations of β-xyloside which are known to affect differentially chondroitin but not heparan sulfate proteoglycan biosynthesis have provided a convenient tool for altering proteoglycan production. The protein patterns of xyloside-treated embryos showed a shift of radioactive peaks to lower molecular mass which could be attributed to the reduction of proteoglycan size as was demonstrated by chondroitinase ABC/AC II treatments. It was notable in our data that β-xyloside altered the chondroitin sulfate proteoglycan decorin to lower molecular mass while it did not seem to affect the size of the heparin sulfate proteoglycan perlecan. More protein was synthesized from xyloside-treated embryos at stage XII (morula) than from embryos at stage HH2 (initial primitive streak/early gastrula) when compared to the controls. This could have reflected an accelerated translation and/or mobilization of oogenetic transcripts in embryos at stage XII when proteoglycan metabolism was disrupted. Misregulation of proteoglycans by modulating the functionality of the protein and by influencing their expression level resulted in an inability of the early embryo to assemble a stable extracellular matrix that would have been normally produced. These changes were associated with the collapse of the typical blastula architecture and inhibition of the induction of mesoderm in the chick embryo. Induction of neuroectoderm required proteoglycans assembled before the initiation of gastrulation movements. However, sustained proteoglycan biosynthesis was required for the morphogenetic movements to form the neural tube and the rest of the embryonic axis. We also studied the spatiotemporal distribution pattern of link protein by immunofluorescence and immunoprecipitation and the role of this glycoprotein by blocking antibodies in the early chick embryo. The recognition of the link protein 1 (LP1, 48 kDa) and link protein 2 (LP2, 44 kDa) types was an important finding of our study. Link protein links several proteoglycans, such as aggrecan to hyaluronan, creating stable aggregates in the extracellular matrix and has a general function in the organization of the extracellular matrix. It is known that combinations of LP1 and LP2 create more stable complexes than the individual link protein molecule. This was also shown in our experiments, in that aggrecan (180kDa) co-precipitated with LP1 and LP2. Our immunofluorescent experiments showed that link protein expression was first detectable at the blastula stage (st. XIII) and its presence may be fundamental as the first extracellular matrix starts to assemble before the initiation of the first major cellular migrations during the gastrula stage. Link protein influorescence was strong in the cells ingressing through the primitive streak and in the migrating cells in embryos at stage HH3 (intermediate streak/mid-gastrula). At stage HH4 (definitive streak/late gastrula), link protein fluorescence was strong at the apical surface of the neural plate. At stage HH4-5 (head process), link protein fluorescence was strong at the apical surface of the neural folds, notochord and endoderm. At stage HH13 (19 somites), link protein fluorescence was intense in the encephalic vesicles, in the extracellular matrix, in the lumen of encephalic vesicles, intense in migrating neural crest cells, neural tube and in notochord, strong in gut lower wall, hard tube and dorsal aorta wall, intense in dermomyotome and strong in sclerotome in somites. By stage HH17 (29 somites), link protein fluorescence was strong in neuroepithelium and extracellular matrix in the lumen of the diencephalon, strong in neural crest cells, in the intraretinal space in the eye, in myocardium and endocardium, in dorsal aorta, in dermomyotome, the outer surface of pharyngeal arches wall of aortic arches and intense in thyroid rudiment. Inhibition of function of link protein by blocking antibodies showed that link protein was important in neuroepithelial tissue organization and neural tube closure, in normal differentiation of the neural tube to form the brain, in the morphogenesis of the heart tube, the dorsal aorta and gut and in somite epithelialization.

Δύο από τα σημαντικότερα δομικά και λειτουργικά βιομόρια του εξωκυττάριου χώρου είναι το κολλαγόνο και οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs), ανιοντικοί πολυσακχαρίτες που αποτελούν το βασικό δομικό συστατικό των πρωτεογλυκανών. Οι κύριοι τύποι γλυκοζαμινογλυκανών είναι η θειική χονδροϊτίνη, η θειική δερματάνη, η ηπαρίνη, η θειική ηπαράνη, η θειική κερατάνη και το υαλουρονικό οξύ. Το κολλαγόνο τύπου Ι είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη στους ιστούς των θηλαστικών. Το κολλαγόνο τύπου ΙΙ αποτελεί το κύριο συστατικό του εξωκυττάριου χώρου του αρθρικού χόνδρου και άλλων ιστών. Τα παραπάνω μακρομόρια είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση διαφόρων διεργασιών των κυττάρων τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως παθήσεις των αρθρώσεων και νεοπλασματικές ασθένειες. Αντικείμενο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και των δύο τύπων κολλαγόνου, η οποία θα συνεισφέρει στη βαθύτερη κατανόηση της βιολογικής τους λειτουργίας. Μερικές από τις τεχνικές που έχουν χρησιμοποιηθεί για το συγκεκριμένο σκοπό είναι η χρωματογραφία συγγένειας, η ηλεκτροφόρηση και η φασματοσκοπία φθορισμού. Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), η περίθλαση ακτίνων-Χ και ο κυκλικός διχρωισμός (Circular Dichroism, CD) προσφέρουν δομικές πληροφορίες για τις αλλαγές στη διαμόρφωση και τα σημεία πρόσδεσης μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και πρωτεϊνών. Θερμοδυναμικές πληροφορίες για τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-γλυκοζαμινογλυκανών αντλούνται από τη θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης (Isothermal Titration Calorimetry, ITC), ενώ με την τεχνική της διέγερσης επιφανειακών πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance, SPR) μελετώνται η σταθερά σύνδεσης και η σταθερά διάστασης της αλληλεπίδρασης σε πραγματικό χρόνο. Το κυριότερο μειονέκτημα των παραπάνω τεχνικών είναι το ότι δεν προσφέρουν πληροφορίες για χημικούς δεσμούς, ενώ ο χρόνος ανάλυσης είναι μεγάλος και απαιτούνται μεγάλες ποσότητες δειγμάτων. Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε ήταν εκείνη της φασματοσκοπίας micro-Raman, μια μη καταστρεπτική τεχνική, η οποία προσφέρει πληροφορίες για τη χημική δομή του εξεταζόμενου δείγματος, ενώ παράλληλα είναι γρήγορη και ακριβής. Παρασκευάστηκαν δύο είδη μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών με κολλαγόνο. Στην πρώτη περίπτωση, κολλαγόνο τύπου Ι ή τύπου ΙΙ εμβαπτίστηκε σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης, ηπαρίνης ή μίγμα τους που παρασκευάστηκε με αναλογία όγκων 1:1. Στη δεύτερη περίπτωση, μίγματα των δύο ουσιών προέκυψαν με ανάμιξη ίσων ποσοτήτων των δύο ουσιών. Τα παραπάνω μίγματα μελετήθηκαν με φασματοσκοπία Raman και με την τεχνική της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC) και συγκρίθηκαν με τα φάσματα των προτύπων ουσιών. Κάθε ουσία έχει ένα χαρακτηριστικό φάσμα Raman, η ερμηνεία του οποίου οδήγησε στην ταυτοποίηση χαρακτηριστικών ομάδων των μορίων, όπως οι δεσμοί C-OH, οι θειικές ομάδες (O-SO3-, N-SO3-), η Ν-ακετυλομάδα, οι δεσμοί C=O και οι δεσμοί C-Ν. Οι φασματικές περιοχές που παρουσιάζουν τα πιο έντονα χαρακτηριστικά στα φάσματα Raman των μιγμάτων GAG-κολλαγόνου είναι οι εξής: 800-920 cm-1, 900-1000 cm-1 και 980-1170 cm-1. Όσον αφορά στην τελευταία φασματική περιοχή, παρατηρήθηκε σημαντική μετατόπιση της χαρακτηριστικής κορυφής της δόνησης έκτασης των θειομάδων προς χαμηλότερους κυματάριθμους (από τους 1070 cm-1 περίπου στους 1062-1064 cm-1) και η εμφάνιση μιας κορυφής στους 1072 cm-1, σε σχέση με τα αντίστοιχα φάσματα των προτύπων ουσιών, στα φάσματα όλων των μιγμάτων που μελετήθηκαν. Η μετατόπιση της συγκεκριμένης κορυφής αποτελεί ένδειξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο ουσιών και καταδεικνύει το σημαντικό ρόλο των θειομάδων των γλυκοζαμινογλυκανών στις αλληλεπιδράσεις τους με τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Τα αποτελέσματα της φασματοσκοπίας Raman βρίσκονται σε συμφωνία με εκείνα που προκύπτουν από την τεχνική της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSC), καθώς τα θερμογραφήματα DSC των μιγμάτων θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι είναι διαφορετικά από εκείνο του μίγματος που προέκυψε από την ανάμιξη των δύο συστατικών, υποδεικνύοντας την ύπαρξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο ουσιών. Με την τεχνική της φασματοσκοπίας Raman διαπιστώθηκε ότι το κολλαγόνο τύπου Ι έδειξε μεγαλύτερη «χημική προτίμηση» προς την ηπαρίνη σε σχέση με τη θειική χονδροϊτίνη, ενώ το κολλαγόνο τύπου ΙΙ προτίμησε να αλληλεπιδράσει με τη θειική χονδροϊτίνη. / Collagen and glycosaminoglycans (GAGs) co-exist as major constituents of the extracellular matrix (ECM) in a variety of tissues. Collagen type I is the most abundant protein in the human body, whereas another important type of collagen is type II, which forms the extracellular matrix of cartilage and other tissues. Glycosaminoglycans are negatively charged polysaccharides that occur as a structural component of proteoglycans and can be divided in four major groups: i) chondroitin sulfate and dermatan sulfate, ii) heparin and heparin sulfate, iii) keratan sulfate, and iv) hyaluronic acid. Both GAGs and collagen not only regulate a variety of cellular functions but they also seem to be involved in many pathological conditions, including cancer and joint diseases. Therefore, a more detailed investigation of the interactions between them will result in a deeper understanding of their biological function. Most common methods for identifying GAG-collagen interactions include affinity chromatography, affinity electrophoresis and fluorescence spectroscopy. Nuclear Magnetic Resonance (NMR), X-ray diffraction and Circular Dichroism (CD) provide structural data characterizing conformational changes and contact points between the interacting species. Using Isothermal Titration Calorimetry (ITC), information on the thermodynamics of glycosaminoglycan-protein interactions can be obtained. Surface Plasmon Resonance (SPR) allows the measurement of association and dissociation constants of glycosaminoglycan-protein interactions in real time. The major disadvantage of the techniques described above is the inability to identify specific chemical bonds. Other disadvantages are the long analysis time and that large amounts of the interacting substances are required. In the present work, Raman spectroscopy, a non-destructive, vibrational technique which yields information on the chemical composition of the specimen, was employed for the exploration of the interactions between collagen type I and type II and two glycosaminoglycans, chondroitin sulfate and heparin. Two sets of mixtures composed of glycosaminoglycans and each type of collagen were prepared: i) collagen type I or type II was immersed in aqueous solutions of chondroitin sulfate, heparin and a 1:1 mixture of both GAGs, and ii) GAG-collagen mixtures were obtained by blending suitable amounts of the two substances. Differential Scanning Calorimetry (DSC) was also applied on the latter mixtures. From the Raman spectra identification of vibrational frequencies of the functional groups of the above molecules, such as C-OH linkages, sulfate groups (O-SO3-, N-SO3-), N-acetyl group, carboxyl group and C-Ν linkages is possible. The prominent features arising from the Raman spectra of GAG-collagen interactions are found in the regions 800-920 cm-1, 900-1000 cm-1 and 980-1170 cm-1. Processing of the spectra of all GAG-collagen mixtures has revealed that a shift of the most characteristic vibration of chondroitin sulfate’s and heparin’s spectrum from 1070 cm-1 to 1062-1064 cm-1, while a vibration at approximately 1072 cm-1 emerges. The sulfate band shift is indicative of an interaction between collagen and glycosaminoglycans and depicts the important role of the sulfate group of glycosaminoglycans in the interactions with the protein. This observation was in accordance with the results from Differential Scanning Calorimetry (DSC), which demonstrated an interaction between collagen and chondroitin sulfate. A stronger preference of collagen type I to interact with heparin rather than chondroitin sulfate and of collagen type II to interact with chondroitin sulfate was also observed.

Στην ιστοτεχνολογία (tissue engineering – TE), η ικανότητα των ικριωμάτων (scaffolds) να διατηρούν συμβατή μηχανική και βιολογική συμπεριφορά με τους περιβάλλοντες ιστούς και όργανα, αλλά και να διευκολύνουν την προσκόλληση κυττάρων του ξενιστή στην επιφάνεια και την τρισδιάστατη δομή τους κρίνεται ως υψίστης σημασίας για την επιθυμητή εκδήλωση αναγεννητικής αντίδρασης των κυττάρων in vivo. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η δημιουργία και ο χαρακτηρισμός ακυτταροποιημένης εξωκυττάριας μήτρας από μαλακούς ιστούς ζωικής προέλευσης, με στόχο τη δημιουργία ικριώματος με επιθυμητές μηχανικές και βιολογικές ιδιότητες για εφαρμογές στην ιστοτεχνολογία. Στην εργασία αυτή επιλέχθηκε ως υλικό της μελέτης ο βόειος περικαρδιακός ιστός, λόγω της ευρείας πολύχρονης χρήσης του ως βιοϋλικό σε μοσχεύματα. Εφαρμόστηκαν δύο διαφορετικά πρωτόκολλα για την ακυτταροποίηση του ιστού, χρησιμοποιώντας στο πρώτο Triton Χ-100, SDS και deoxycholic acid (12 ώρες, 4°C - Triton) και στο δεύτερο Trypsin/EDTA με RNAse/DNAse (48 ώρες, 37°C – Trypsin). Η ιστολογική εξέταση επιβεβαίωσε την ολική αφαίρεση των κυττάρων. Τα αποτελέσματα των εμβιομηχανικών δοκιμών δεν έδειξαν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των μηχανικών ιδιοτήτων των μη κατεργασμένων ιστών και των ακυτταροποιημένων περικαρδιακών ιστών με Triton στην οριζόντια και κάθετη διεύθυνση προς τον οβελιαίο άξονα της καρδιάς σε αντίθεση με τη μείωση του χαμηλού μέτρου ελαστικότητας (φάση ελαστίνης) και του υψηλού μέτρου ελαστικότητας (φάση κολλαγόνου) μετά την κατεργασία των υλικών με Trypsin, και στις δύο κατευθύνσεις. Η βιοχημική ανάλυση επαλήθευσε την άμεση σχέση μεταξύ των μηχανικών βισκοελαστικών ιδιοτήτων των μαλακών ιστών με τα συστατικά (GAGs και κολλαγόνο) του ιστού και την εσωτερική διαμόρφωση τους. Τα αποτελέσματα των μη επεξεργασμένων και των επεξεργασμένων ιστών με τα παραπάνω διαλύματα, έδειξαν ότι το διάλυμα του Triton προκαλεί ήπια κατεργασία, με ελαχιστοποίηση των δομικών μεταβολών της εξωκυττάριας μήτρας, όπως η σταθερή σύσταση των γλυκοζαμινογλυκανών (GAGs) και η περιεκτικότητα των ιστών σε κολλαγόνο. Αυτό δεν επιτεύχθηκε με την χρήση διαλύματος Trypsin, όπου παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των GAGs, τόσο στη συγκέντρωση της θειϊκής χονδροϊτίνης / δερματάνης όσο και στο υαλουρονικό. Για την αξιολόγηση της κυτταροσυμβατότητας αορτικά βόεια ενδοθηλιακά κύτταρα καλλιεργήθηκαν στα ακυτταροποιημένα υλικά. Η επιθηλιοποίησή τους επετεύχθη από 24 ώρες μέχρι και 4 μέρες. Προσδιορίστηκε επίσης η δύναμη προσκόλλησης των κυττάρων μετά από 4 μέρες καλλιέργειας στους ακυτταροποιημένους περικαρδιακούς ιστούς με την εφαρμογή διατμητικών τάσεων μέσω ροϊκού πεδίου, με χρήση κατάλληλης μηχανής περιστροφής των δειγμάτων σε ακινητοποιημένο υγρό. Τα αποτελέσματα έδειξαν εξάπλωση και πολλαπλασιασμό των κυττάρων στην επιφάνεια των βιοϋλικών, ενώ παρατηρήθηκε καλή συγκέντρωση κυττάρων (> 60%) στην κλίμακα των φυσιολογικών διατμητικών τάσεων. Συμπερασματικά, η ακυτταροποίηση του βόειου περικαρδιακού ιστού για μεγάλη χρονική διάρκεια στους 37°C (Trypsin) φάνηκε να μεταβάλλει την εμβιομηχανική συμπεριφορά και τη δομική ακεραιότητα του ιστού, η οποία, αντίθετα, διατηρείται σε φυσιολογική κατάσταση μετά από κατεργασία σε χαμηλή θερμοκρασία και σε σύντομο χρόνο (Triton). Επιπλέον, και τα δύο πρωτόκολλα είχαν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία βιοϋλικού συμβατού με τα ενδοθηλιακά κύτταρα κατά την επαφή τους με την επιφάνειά τους. / In TE scaffolding, the ability of scaffolds to preserve proper mechanical and biological function and compatibility with the surrounding tissues and organs, as well to enhance host cells to adhere with scaffold material in their surface and 3D structure is of paramount importance for potential regenerative cell response in vivo. The aim of the present thesis is to produce and characterise a decellularized extracellular matrix derived from animal soft tissues, scoping to a scaffold capable of exhibiting the mechanical and biological properties desired for tissue engineering (TE) applications. For this work bovine pericardial tissue was selected, due to its broad use as a biomaterial in different implant technologies for decades. Two different protocols for the decellularization of bovine pericardial tissue were developed incorporating Triton® X–100, SDS and deoxycholic acid (12 h, 4°C) in solution 1 (Triton) and trypsin/EDTA with RNAse/DNase at 37°C for 48 h in solution 2 (Trypsin). Histological analysis confirmed total absence of cells after both treatments. The results of the biomechanical tests showed no mechanical differences demonstrated between the fresh and decellularized pericardial tissues by Triton solution in both, apex to base and transverse anatomical directions, contrary to a significant decrease of the low elastic modulus (elastin phase) and high elastic modulus (collagen phase) demonstrated after trypsin solution treatment in both directions. Biochemical analysis verified the direct relationship between mechanical viscoelastic properties of soft tissues with the constituent tissue components (GAGs and collagen content) and their internal arrangement. The comparison of the results from untreated and that from treated tissues suggested that the Triton decellularization method seemed to be a very mild treatment, as the glycozaminoglycans (GAGs) composition remained constant, as well as the collagen content. This was not achieved with the decellularization using Trypsin, where a significant reduction of GAGs, both chondroitin/dermatan sulphate and hyaluronan, was found. Aortic bovine endothelial cell seeding was used for estimation of its biomaterials’ cytocompatibility. Endothelialization achieved after 24hrs to 4 days periods. The adhesion strength of cells, cultured for 4 days on decellularized bovine pericardial tissues, was also determined. By applying a radially increasing shear stress field on rotating material samples within a stationary fluid mesh using a spinning disc device, we determined the shear stress necessary to detach the cells from the sfafolds’ surface. Fine cell spreading and proliferation on biomaterials’ surface and good surface cell density (>60%) at physiological shear stress scale were observed and measured. In conclusion, decellularization of bovine pericardial tissues under long time duration in 37°C (Trypsin) seems to alter its biomechanical behaviour and structural integrity, which, in contrast, was retained under low temperature short duration treatment (Triton). Additionally, both protocols resulted in a cytocompatible biomaterial, regarding its surface interactions with endothelial cells.