Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2010. / Includes bibliographical references (p. 176-207). Also available online.

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2010. / Includes bibliographical references (p. 176-207). Also available in print.

Οι θειωμένες γλυκοζαμινογλυκάνες είναι σημαντικά μόρια του εξωκυττάριου χώρου που επιτελούν σημαντικές διεργασίες. Η βιοσύνθεσή τους επιτυγχάνεται με τη συμμετοχή πολλών ενζύμων που έχουν διάφορους ρόλους. Τα κυριότερα ένζυμα που βιοσυνθέτουν θειική χονδροϊτίνη/ δερματάνη είναι οι συνθάσες χονδροϊτίνης, οι γλυκοσυλοτρανσφεράσες, οι σουλφοτρανσφεράσες και η επιμεράση της θειικής δερματάνης. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης έχουν διττό ρόλο, γιατί έχουν δύο ενεργά κέντρα: Το ένα προσθέτει γλυκουρονικό οξύ και το άλλο Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη στο μη αναγωγικό άκρο μιας νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Παράλληλα, οι σουλφοτρανσφεράσες προσθέτουν θειικά σε συγκεκριμένες θέσεις ενώ η επιμεράση μετατρέπει κατάλοιπα γλυκουρονικού σε ιδουρονικό πριν συμβεί θείωση του δισακχαρίτη. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης είναι οι εξής: CHSY1, CHSY2 (CHPF) και CHSY3. Η γλυκουρονυλοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είναι η CSGlcA-T. Οι κυριότερες σουλφοτρανσφεράσες είναι οι C4ST1, D4ST1 και CHST3. Η μελέτη των ενζύμων αυτών στον καρκίνο είναι εξαιρετικού ενδιαφέροντος, γιατί έχει βρεθεί ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες συμμετέχουν στην ανάπτυξη του καρκίνου. Έχει παρατηρηθεί ότι οι γλυκοζάμινογλυκάνες υφίστανται ποιοτικές και ποσοτικές μεταβολές στους διάφορους καρκίνους. Οι μεταβολές αυτές φαίνεται να συμβάλλουν τόσο στην ανάπτυξη του καρκίνου όσο και στον φαινότυπό του. Η κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν στις μεταβολές των γλυκοζαμινογλυκανών είναι πολύ σημαντική. Η μελέτη επικεντρώθηκε στις μεταβολές που υφίστανται τα παραπάνω ένζυμα στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του λάρυγγα. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: RT-PCR ανάλυση έπειτα από απομόνωση ολικού RNA, Western blotting ύστερα από διαδοχική εκχύλιση με PBS, υδροχλωρική γουανιδίνη και υδροχλωρική γουανιδίνη Triton-X100 για τη διερεύνηση της έκφρασης των γονιδίων, μεθυλοειδική PCR (MSP) για τη διερεύνηση των επιγενετικών μηχανισμών μετά από απομόνωση DNA και μέτρηση της δραστικότητας C-4 σουλφοτρανσφεράσης με χρήση αποθειωμένης δερματάνης ως υπόστρωμα. Στα δείγματα του παχέος εντέρου, η έκφραση της συνθάσης χονδροϊτίνης Ι ήταν υψηλότερη στα πρώτα στάδια του καρκίνου. Επίσης, ήταν αρκετά υψηλή στα μακροσκοπικά φυσιολογικά δείγματα που είναι παρακείμενα στους καλοήθεις όγκους. Στους τελευταίους και στους υγιείς ιστούς δεν υπήρχε σημαντική έκφραση του ενζύμου. Όσον αφορά τον λάρυγγα η έκφραση ήταν υψηλή στα παθολογικά δείγματα και ελαφρώς χαμηλότερη στα υγιή. Τα φυσιολογικά δείγματα δεν παρουσίαζαν σημαντική έκφραση του ενζύμου. Ο παράγοντας πολυμερισμού της χονδροϊτίνης, είχε υψηλότερη έκφραση στα παθολογικά δείγματα σε σχέση με τα φυσιολογικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Επίσης, φαίνεται να αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα με το στάδιο του καρκίνου. Η έκφρασή του στους υγιείς ιστούς και στους παρακείμενους μακροσκοπικά φυσιολογικούς ιστούς των αδενωμάτων ήταν περιορισμένη. Αντίθετα, στα λαρυγγικά δείγματα η έκφρασή του ήταν αυξημένη στους υγιείς ιστούς. Η γλυκουρονυλoτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είχε περιορισμένη και σταθερή έκφραση στα πρώτα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου αλλά στα ανώτερα στάδια αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στη έκφραση των γονιδίων συνθάση χονδροϊτίνης ΙΙΙ και 6-σουλφοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου ή του λάρυγγα. Παρόλο αυτά, στον υγιή λάρυγγα τα δύο αυτά ένζυμα εκφράζονταν περισσότερο από τον καρκίνο. Το αντίθετο ισχύει για το υγιές παχύ έντερο που παρουσίαζε περιορισμένη έκφραση των δύο αυτών γονιδίων σε σχέση με τον καρκίνο. Τα επίπεδα mRNA της C-4 σουλφοτρανσφεράσης της θειικής δερματάνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου φαίνεται να μειώθηκαν με το στάδιο του καρκίνου αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ήταν σταθερά. Στην υγιή κατάσταση το ένζυμο υποεκφραζόταν αλλά το αντίθετο ίσχυε για τα λαρυγγικά δείγματα. Επίσης, η περιοχή του υποκινητή του γονιδίου που εξετάστηκε παρέμενε πλήρως αμεθυλίωτη τόσο στα λαρυγγικά όσο και στα δείγματα του παχέος εντέρου κάτι που σημαίνει ότι πιθανώς δεν υπάρχει ρύθμιση της έκφρασης με μηχανισμό μεθυλίωσης του υποκινητή. Τα επίπεδα mRNA της επιμεράσης της θειικής δερματάνης ήταν αυξημένα στα παθολογικά δείγματα στα ανώτερα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η έκφραση αυτή φαίνεται να επηρεάζεται από τη μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Στα λαρυγγικά δείγματα δεν έγινε ανίχνευσή της στα φυσιολογικά δείγματα παρά μόνο στα παθολογικά και σε μικρότρο βαθμό στα υγιή. Σε ορισμένα τουλάχιστον παθολογικά λαρυγγικά δείγματα φαίνεται να υπάρχει υπομεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Σε αυτό το σημείο φαίνεται να υπάρχει ομοιότητα στη ρύθμιση των διαφορετικών καρκίνων. Η εκχυλισιμότητα των ενζύμων στο PBS τόσο στα λαρυγγικά όσο και στα δείγματα του παχέος εντέρου κατέδειξε ότι ένα σημαντικό μέρος τους εκκρίνεται από τα κύτταρα. Σε προηγούμενες μελέτες η παρουσία τέτοιων ενζύμων (CHSY1, C4ST1 και D4ST1) στο θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών έχει ταυτοποιηθεί. Το ένζυμο που συγκρατείται περισσότερο και έχει τη μικρότερη παρουσία στον εξωκυττάριο χώρο είναι ο CHPF που εκχυλίζεται κυρίως στην GdnHCl. Επιπλέον, αξιοσημείωτη εκχυλισιμότητα τόσο στην GdnHCl όσο και την GdnHCl-Triton X100 παρουσίασε η CHSY1 η οποία ανιχνεύθηκε σε μεγάλη ποσότητα και στα εκχυλίσματα PBS. Όλα τα υπόλοιπα ένζυμα βρέθηκαν κυρίως σε εκχυλίσματα PBS (CHST3, D4ST1, C4ST1 και CHSY3). Τέλος, μελετήθηκαν και κάποια άλλα μόρια στον καρκίνο του παχέος εντέρου-υποστρώματα των ενζύμων- για να εξεταστεί η πιθανή συσχέτισή τους με την έκφραση των ενζύμων: Τα επίπεδα mRNA της διακοσμητίνης, ήταν υψηλότερα στους υγιείς ιστούς. Στον καρκίνο, σε όλα τα φυσιολογικά δείγματα η έκφρασή της ήταν αυξημένη σε σχέση με τα παθολογικά. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης με το στάδιο του καρκίνου τόσο στα φυσιολογικά όσο και τα παθολογικά δείγματα. Η ισομορφή V0 της βερσικάνης ήταν αυξημένη στον καρκίνο (στα ίδια επίπεδα ανάμεσα στους φυσιολογικούς και τους αντίστοιχους παθολογικούς ιστούς) σε σχέση με την υγιή κατάσταση. Με το στάδιο υπήρχε αύξηση. Αντίθετα η ισομορφή V1 της βερσικάνης είχε τα υψηλότερα επίπεδα mRNA στα υγιή δείγματα και ταυτόχρονα υπήρχε μείωση με το στάδιο τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα παθολογικά δείγματα. Οι ισομορφές V2 κια V3 ήταν στα ίδια επίπεδα στους υγιείς, φυσιολογικούς και παθολογικούς ιστούς και δεν παρατηρήθηκε καμία διαφοροποίηση στην έκφρασή τους με το στάδιο του καρκίνου. Από προηγούμενες μελέτες στον καρκίνο του λάρυγγα έχει παρατηρηθεί ότι με το στάδιο του καρκίνου υπάρχει συνεχής μείωση της θειικής χονδροϊτίνης και της θειικής δερματάνης σε σχέση με την υγιή κατάσταση. Πιο συγκεκριμένα υπάρχει δραματική μείωση με το στάδιο της C-6 θείωσης ενώ η μείωση της C-4 θείωσης γίνεται βαθμιαία. Η γενική μείωση της θειικής χονδροϊτίνης και θεικής δερματάνης μπορεί να εξηγηθεί από τη μεγάλη μείωση που παρατηρήθηκε στον CHPF και την CHSY3 στον καρκίνο σε σχέση με τον υγιή λάρυγγα. Η αμυδρή αύξηση της CHSY1 και της CSGlcA-T δεν μπορούν να οδηγήσουν σε αύξηση της CS/ DS. Επιπλέον, η μείωση της CHST3 στον καρκίνο πρέπει να οδηγεί και στην σχετική μείωση της C-6 θείωσης. Επίσης, είναι γνωστό ότι η CHSY1 ευνοεί περισσότερο τη C-4 θείωση τόσο στην χονδροϊτίνη όσο και στην δερματάνη. Η αυξημένη C-4 θείωση πρέπει να οφείλεται σε θειική χονδροϊτίνη, γιατί ενώ η D4ST1 μειωνόταν σε σχέση με την υγιή κατάσταση η C4ST1 αυξανόταν. Επιπλέον, ο CHPF που επίσης μειωνόταν στον καρκίνο ευνοεί περισσότερο τη C-6 θείωση. Σε αυτό το σημείο πρέπει να αναφερθεί ότι τα καλύτερα υποστρώματα για όλες τις συνθάσες χονδροϊτίνης είναι η αθείωτη πολυμερής χονδροϊτίνη και η CSC. Σε προηγούμενες μελέτες που αφορούν τον καρκίνο του παχέος εντέρου έχει παρατηρηθεί αύξηση της C-6 θείωσης και σχετική μείωση της C-4 θείωσης. Η C-6 θείωση φαίνεται να αυξάνεται και με το στάδιο του καρκίνου ενώ η C-4 θείωση τείνει να μειώνεται. Τα αποτελέσματα αυτά μπορούν να εξηγηθούν από τη μείωση της CHSY1 και της C4ST1 στα ανώτερα στάδια καθώς και στην ταυτόχρονη αύξηση του CHPF. Είναι αξιοσημείωτο το ότι δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στα επίπεδα πρωτεΐνης με το στάδιο του καρκίνου στην CHST3 ή την D4ST1. Παρόλο αυτά, στην υγιή κατάσταση (όπου η παρουσία χονδροϊτίνης-δερματάνης είναι περιορισμένη) τα ένζυμα εκφράζονταν ελάχιστα. Επιπλέον, τα επίπεδα του miR124 ήταν σταθερά. Συμπερασματικά, τα γονίδια βιοσύνθεσης των θειωμένων γλυκοζαμινογλυκανών υφίστανται μεταβολές στην έκφρασή τους στον καρκίνο του παχέος εντέρου συμμετέχοντας στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου. Έτσι, πρωτεογλυκάνες που περιέχουν γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες με συγκεκριμένες ιδιότητες επηρεάζουν την κυτταρική σηματοδότηση. Η διαλεύκανση των μηχανισμών που επηρεάζουν την έκφραση των βιοσυνθετικών ενζύμων των γλυκοζαμινογλυκανών είναι μεγάλης σημασίας. / Sulfated glycosaminoglycans are important molecules of the extracellular matrix. Their biosynthesis is accomplished by the contribution of many different enzymes which have distinct roles. The most important enzymes in the chondroitin/ dematan sulfate biosynthesis are chondroitin synthases, glycosyltransferases, sulfotransferases and dermatan sulfate epimerase (DSE). Chondroitin synthases possess dual role containing two different active sites: One adding glucuronic acid and one adding N-acetylgalacosamine in the non-reducing end of a synthesizing chain. In parallel, sulfotransferases modify the newly-synthesized chains by adding sulfate in certain positions. The chondroitin synthases are CHSY1, CHSY2 (CHPF) and CHSY3. The glycosyltransferase acting in chondroitin is CSGlcA-T. Prior to sulfation, dermatan sulfate epimerase converts glucuronic acid to iduronic. The main sulfotransferases are C4ST1, D4ST1 and CHST3. CHST3 and C4ST1 acting mainly in chondroitin whereas D4ST1 acts mainly in dermatan. It was observed that the various glycosaminoglycans undergo many alterations in quantitative and qualitative terms. These alterations seem to contribute in cancer development and progression as well as in cancer phenotype. The deep understanding of the mechanisms which lead in glycosaminoglycan changes is of great importance. The study focuses in the variation of the levels of the chondroitin / dermatan polymerizing and modifying enzymes in healthy and cancerous tissues (both macroscopically normal and pathological specimens) in colorectal and laryngeal cancer.RT-PCR analysis was carried out to determine the expression of these enzymes after RNA isolation. For Western blotting tissue samples were subjected to sequential extraction with PBS, 4 M guanidine hydrochloride and 4 M guanidine hydrochloride – 1% Triton X-100. For epigenetic studies, methylation-specific PCR was carried out after DNA isolation. Furthermore, we have examined the levels of other molecules (decorin, versican isoforms and miR124) to find out if their presence can be correlated with the obtained enzymes’ profile. In colorectal samples, chondroitin synthase I expression was higher in the adjacent normal tissue of the benign tumors. In healthy tissues and benign tumors the enzyme was expressed in trivial amounts. In cancer, its expression was high at early stages. In laryngeal samples, chondroitin synthase I was expressed mainly in the pathologic samples and to a lower extent in the healthy specimens. Trivial amounts of the enzyme were detected in the pathologic samples. Chondroitin polymerizing factor was found to be elevated in colorectal cancer in the pathologic specimens compared to macroscopically normal. Furthermore, its mRNA levels had the tendency to elevate progressively with cancer stage in the pathologic specimens. In healthy samples and the adjacent normal specimens of the benign tumors its expression was trivial. In contrast in laryngeal samples the enzyme was elevated in the healthy tissues. In colorectal tissues CSGlcA-T expression was increased in adenomas (in the pathological parts) and in advanced stages of the disease. In the middle stages its expression is relatively suppressed and the tumors possess the same amount of the enzyme with the adjacent macroscopically normal tissue. No significant differences between macroscopically normal and pathologic specimens were observed at the levels of chondroitin-6-sulfotransferase and chondroitin synthase III in both laryngeal and colorectal cancer. Besides, in healthy larynx the specified enzymes were expressed intensively compared to cancer but the opposite profile was obtained in colon. In colorectal cancer, dermatan-4-sulfotransferase mRNA levels were in decreasing amounts in both macroscopically normal and cancerous tissues but its protein levels were constant in cancer. In laryngeal samples D4ST1 was expressed mainly in the healthy tissues but the oppοsite profile was obtained for colorectal samples. The CpG island near the promoter region of the D4ST1 gene in both colorectal and laryngeal cancer was fully unmethylated therefore it did not affect the enzyme expression another regulatory mechanism(s) should be considered. C4ST1 levels were trivial in healthy tissues and pre-cancerous situations in colon samples. In advanced stages C4ST1 was expressed about at the same levels in both normal and cancerous specimens. Its promoter was heavily methylated in the pathologic specimens but the unmethylated allele was not intense possibly due to semimethylation. In laryngeal tissues, C4ST1 gene expression was very low in healthy specimens and increased in patients' specimens. Its expression seemed to be controlled via methylation of a CpG island, since hypomethylation of the gene was observed in the pathologic samples compared to the macroscopically normal samples RT-PCR analysis indicated that in colorectal cancer dermatan sulfate epimerase mRNA levels were elevated in the pathologic specimens in the advanced stages. All the macroscopically normal specimens as well as the pathologic specimens of early stage of cancer possessed trivial amounts. MSP revealed that the mRNA levels observed correlate with the promoters’ methylation status. In laryngeal tissues, dermatan sulfate epimerase mRNA was detected in healthy and mainly in the pathologic specimens but not in the corresponding normal tissues. Relative hypomethylation of its promoter was observed in some pathologic specimens. The extractability of the studied enzymes in PBS in both laryngeal and colorectal samples indicated that a major part of them is secreted from the cells. In previous studies, the presence of such enzymes (CHSY1, D4ST1 and C4ST1) in the conditioned medium in cultured cells was also identified. The most “restrained” enzyme is CHPF which was extracted mainly in GdnHCl. CHSY1 showed a remarkable extractability in both GdnHCl and GdnHCl-Triton X100 but it was also detected in great amounts in the PBS extracts. All the other enzymes were found mainly in the PBS extracts (CHST3, D4ST1, C4ST1 and CHSY3). We have also studied some other molecules to find out if they have acorrelation with the enzymes’ profile in colorectal cancer: Decorin mRNA levels were the highest in the healthy tissues. In cancer, in all the normal specimens its expression was found to be elevated compared to pathological specimens. Furthermore, a stage-related decrease was observed in both normal and cancerous specimens. Versican-V0 isoform was increased in cancer (in normal and pathological specimens) compared to the healthy specimens with no significant differences between them. By stage, the mRNA levels increased. On the other hand, versican-V1 mRNA levels were the highest in the healthy specimens. Both normal and cancerous specimens contained similar levels of its mRNA which was in decreasing amounts by stage. Versican-V2 and V3 isoforms were similar in healthy, normal and cancerous specimens without any change in the various cancer stages. The present study took place in order to explain the chondroitin/ dermatan sulfate profiles obtained in colorectal and laryngeal cancer in previous studies. In laryngeal cancer, it was indicated that in the cartilaginous parts the chondroitin/dermatan profile is intensively altered in the advanced stages of cancer compared to the healthy cartilage: It was observed that the healthy laryngeal cartilage possesses great amounts of chondroitin/dermatan sulfate which in cancer are decreased. We have found that CHSY3 and CHSY2 were significantly decreased, whereas CHSY1 and CSGlcA-T were slightly increased. Since the decrease of CHSY2 and CHSY3 were very high compared to the increase of the latter, the general decrease of CS/DS is explained. The obtained sulfation profile by previous stydies indicated a dramatic decrease of C-6 sulfation and a more stagy loss of C-4 sulfation. This profile is explainable because CSA and mainly CSB (the C-4 sulfated chondroitin and dermatan sulfate, respectively) are synthesized preferentially by CHSY1. Furthermore, CHST3 gene expression was decreased in cancer compared to healthy tissues profoundly leading to C-6 sulfation decrease. D4ST1 gene expression was decreased, whereas C4ST1 gene was expressed more in the cancerous parts than in the macroscopically normal. Consequently, C-4 sulfation in CS-disaccharides could be relatively augmented in cancer but C-4 sulfation in DS-disaccharides decreased, yielding to an overall gradual C-4 sulfation decrease. Therefore, the C-4 sulfation is favored in cancer. CHPF preferentially synthesizes C-6 chondroitin sulfate. It is noteworthy that all chondroitin synthases prefer nonsulfated and CSC substrates. However, it has been shown that chondroitin polymerization is achieved by formation of complexes between the various chondroitin synthases and CSGlcA-T In colorectal cancer, an increase in absolute amounts of Δdi-6S together with a decrease of Δdi-4S was noted, both having a stage-related order. The amounts of Δdi-6S observed in the pathologic parts followed a stage-related increase. A quite different profile was obtained in the case of Δdi-4S, where its amounts were found to be increased in stage I, compared to healthy. Thereafter Δdi-4S amounts showed a tendency to become lower as the stage of cancer increased. These results can be explained by the decreased expression of CHSY1 and C4ST1 in the advancced stages and the inctrased expression of CHPF. It is noteworthy that significant changes in CHST3 and D4ST1 between the various cancer stages were not observed. In healthy samples which contain the smallest quantity of CS/ DS the latter enzymes were slightly expressed. In addition, we have studied the levels of miR124 which were found constant. In conclusion, the various glycosaminoglycan synthesizing enzymes showed different expression pattern in cancer implying specific roles in cancer development and progression. As a result, the formation of proteoglycans with characteristic features affects the cell signaling. The elucidation of the mechanisms which are involved in the expression of the glycosaminoglycan synthesizing enzymes is of great interest.

No description available.

This study was conducted to study absorption of glucosamine and chondroitin sulfate and to measure any changes in blood concentration of these compounds following feeding them to horses in different amounts. Six mature mares were used in a replicated 3x3 Latin square designed experiment. The experiment consisted of three 15-day periods, which included 10 days of diet adaptation followed by a 5-day sampling period. Blood was drawn on one day during each sampling period. Horses were fed a control diet (40% hay, 60% concentrate) balanced to meet NRC (1989) requirements for maintenance of mature horses. In one experimental diet, 2.0 g chondroitin sulfate and 5.5 g glucosamine were added to the basal ration at each feeding. In the other experimental diet, 3.5 g chondroitin sulfate and 8.5 g glucosamine were added to the basal ration at each feeding. Following total collections, blood was centrifuged and plasma was harvested and data analyzed for the presence of each compound. Analyses for plasma glucosamine were performed in the Protein and Chemistry Lab at Texas A&M University using HPLC. Chondroitin sulfate in the plasma was analyzed using a color reagent, dimethylmethylene blue, followed by UV spectrophotometry. There were no significant differences (P<0.05) in the concentration of chondroitin sulfate or glucosamine concentrations in plasma when comparing the three different diets. This leads to a conclusion that these compounds were not absorbed through the intestinal wall into the bloodstream in the same form as they were fed. This poses a question as to whether or not oral forms of these compounds are absorbed and are able to migrate to joints through the blood to improve joint function. With the significant economic impact that products containing chondroitin sulfate and glucosamine are making in the animal nutrition industry, more research is needed to further elucidate actual efficacy of these compounds in diet supplements for horses.

Syndecan-1 is a cell surface proteoglycan which participates in cell adhesion, differentiation, motility, morphogenesis and intracellular signaling. The two glycosaminoglycans heparan sulfate and chondroitin sulfate are covalently attached to the ectodomain of syndecan-1 via a tetra saccharide linkage sequence. However, the ectodomain can be modified having only one or neither of the glycosaminglycans attached. The glycosaminoglycans are capable of binding ligands such as fibroblast growth factors (FGFs) and support activation of receptors. The ectodomain is proteolytically cleaved from the cell surface by metalloproteinases in a process known as shedding. Shedding turns the ectodomain into a soluble effector which can stimulate other cells in the surroundings by delivering growth factors and also translocate into cells through endocytosis. In this study the aim was to find out if a modified ectodomain, which only contains chondroitin sulfate, could support intracellular signaling in the absence of heparan sulfate. The aim was also to find out whether a modified ectodomain could translocate into the cell. The methods used were cell culturing, isolation and purification of syndecan-1 ectodomain, cell signaling and immunohistochemistry. It was found that modified shed syndecan-1 ectodomain was able to support intracellular signaling almost to the same degree as wild type syndecan-1 ectodomain. This may suggest that heparan sulfate does not have to be present on the ectodomain to support intracellular signaling, although the signal is slightly higher when present. When trying to detect translocation of the ectodomain the results were too uncertain and further research is required.

published_or_final_version / Physiology / Doctoral / Doctor of Philosophy

Regeneration is, in simple terms, ‘to re-grow’ damaged or lost parts of the body (e.g. cells, tissues and organs) and is a natural phenomenon occurring throughout the life of an organism. The regenerative capacity varies in the animal kingdom. Invertebrates have high regenerative capacity in contrast to higher vertebrates. This raises several fundamental questions related to the regeneration potential, evolutionary selection and its cellular and molecular mechanisms. An in-depth knowledge in regeneration is warranted to answer the fundamental questions that are still a challenge in regenerative medicine.  Glycosaminoglycans (GAGs) are known to be involved in various physiological processes. Of several GAG types galactosaminoglycans are the focus of this thesis. Galactosaminoglycans such as chondroitin sulfate/dermatan sulfate (CS/DS) are anionic linear polysaccharides covalently linked to core proteins so called proteoglycans (PGs), and form an integral part of both cell surface and extracellular matrix components. Although CS/DS have been associated with different cellular processes from development to homeostasis, not many studies have been carried out to understand their role in regeneration. In this thesis, we aim to study galactosaminoglycans, their structure, and interaction with growth factors of biological importance in the process of regeneration using simple invertebrate model organisms - brittlestars. We have identified CS/DS as the major GAG present in brittlestars. Molecular characterization of these chains indicated a much higher level of sulfation in Amphiura filiformis than so far found in GAGs from invertebrates or vertebrates. This brittlestar CS/DS promotes FGF2 mediated cell signaling similar to heparin. Further, we studied the functional role of these CS/DS chains and their biosynthetic machinery during arm regeneration in A. filiformis. Regeneration is followed by an increase in GAG sulfation from blastema stage to the fully functional arm. Suppressing sulfation on the other hand by sodium chlorate treatment drastically affected the proliferation process and thereby regeneration. Thus our findings suggest a potential biological role of CS/DS in brittlestar limb regeneration that may have relevance to regenerative medicine in future.

Thesis (Ph.D.). / Written for the Dept. of Biochemistry. Title from title page of PDF (viewed 2009/06/11). Includes bibliographical references.

O uso da nisina como conservante natural tem aumentado cada vez mais, assim como os estudos para aprimorar o uso desta. Este trabalho visa o aumento da eficiência da nisina na inibição de microorganismos, como a Listeria, através da encapsulação da mesma na forma de nanolipossomas com incorporação de polissacarídeos. Foram testados nanolipossomas de nisina e nanolipossomas de nisina com incorporação de quitosana e incorporação de sulfato de condroitina. As análises mostraram que estes lipossomas tiveram a mesma eficiência que a nisina livre na inibição da L. monocytogenes 4b* e da Listeria sp.* e uma maior eficiência na inibição da L. monocytogenes 4b ATCC 6477. As análises de potencial zeta indicaram que os lipossomas de nisina com e sem incorporação de polissacarídeos possuem carga em torno de -20mV e estes apresentaram estruturas esféricas e não esféricas quando observados através de TEM. Apesar dos nanolipossomas de nisina com incorporação de quitosana apresentarem uma eficiência de encapsulaçãos mais baixa, em torno de 10%, estes tiveram maior estabilidade e também maior eficiência na inibição da Listeria monocytogenes ATCC 7644, quando comparados aos nanolipossomas de nisina com e sem incorporação de sulfato de condroitina, no tempo final de 24h a redução obtida foi de 2 log comparando-se com os demais tratamentos e de 7 log comparando-se aos controles. / The use of nisin, as a natural preservative, has increased, as well as studies to enhance the use of that. The aim of this study is to increase the efficiency of nisin in inhibition of microorganisms such as Listeria, by encapsulating as nanolipossomes incorporated with polysaccharides. Nisin nanoliposomes and nisin nanoliposomes with incorporation of chitosan and chondroitin sulfate were analysed. The analyzes showed that these liposomes had the same efficiency as free nisin in inhibiting L. monocytogenes 4b and Listeria sp., both isolated from bovine carcass, and greater efficiency in inhibiting L. monocytogenes 4b ATCC 6477. The zeta potential analyzes indicated that nisin liposomes with and without incorporation of polysaccharides have a load around -20mV and these showed spherical and nonspherical structures when observed through TEM. Despite of the efficience of nisin nanoliposomes incorporating chitosan present lower values of encapsulation efficiency, around 10%, they were more stable and also more efficient in inhibiting Listeria monocytogenes ATCC 7644 compared to nisin nanoliposomes with and without incorporation of chondroitin sulfate. In the final time of 24 hours the reduction obtained was 2 log compared with the other treatments and 7 log comparing to the controls.