Spelling suggestions: "subject:"θρόμβωσης"" "subject:"θρόμβος""
1 |
Σύνθεση του RGD και αναλόγων του με ενσωματωμένα παράγωγα σαλικυλικού οξέος και μελέτη της αντιπηκτικής τους δράσηςΣαρηγιάννης, Ιωάννης 20 September 2010 (has links)
Η συγκόλληση των αιμοπεταλίων προάγεται από το ινωδογόνο, μια εξωκυττάρια πρωτεΐνη, η οποία δεσμεύεται εκλεκτικά στον υποδοχέα GP IIb/IIIa. Το τριπεπτίδιο RGD (Arg-Gly-Asp) συνιστά τη μικρότερη αλληλουχία, η οποία είναι απαραίτητη για την αναγνώριση και πρόσδεση του ινωδογόνου στον υποδοχέα και απαντάται και σε άλλες συγκολλητικές πρωτεΐνες, οι οποίες είναι παρούσες στον εξωκυττάριο χώρο και στο αίμα, όπως η ινοσυνδετίνη, το κολλαγόνο, ο παράγοντας Von Willebrand, κτλ.
Η αντιπηκτική θεραπεία έχει βασιστεί σε δύο διαφορετικές προσεγγίσεις του προβλήματος. Η μία προσέγγιση αφορά την εμπόδιση της πρωταρχικής διέγερσης των αιμοπεταλίων από διάφορους αγωνιστές, όπως θρομβίνη, επινεφρίνη, κολλαγόνο, κτλ. Η άλλη προσέγγιση περιλαμβάνει την διακοπή του μηχανισμού μεταγωγής σήματος, ο οποίος ακολουθεί την πρόσδεση του αγωνιστή στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Η ασπιρίνη, παράγωγο του σαλικυλικού οξέος, αναστέλλει το πρώτο βήμα στη βιοσύνθεση της θρομβοξάνης Α2 από αραχιδονικό οξύ μέσω ακετυλίωσης του ενζύμου κυκλοοξυγενάση 1.
Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε ο σχεδιασμός και η σύνθεση γραμμικών και κυκλικών αναλόγων του τριπεπτιδίου RGD με ενσωματωμένο σαλικυλικό οξύ ή παράγωγά του. Τα διάφορα ανάλογα συντέθηκαν με κλασικές μεθόδους πεπτιδικής σύνθεσης σε υγρή και στερεά φάση.
Τη σύνθεση των αναλόγων ακολούθησε καθαρισμός τους (HPLC) και προσδιορισμός της δομής τους με (ESI-MS). Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε in vitro με φωτομετρική μέθοδο στους 37C και συνεχή καταγραφή της διερχόμενης ακτινοβολίας με ειδικό όργανο (Dual Channel Aggregometer) η ανασταλτική τους δράση στη συγκολλητικότητα των αιμοπεταλίων του ανθρώπου. Προς περαιτέρω επιβεβαίωση των πειραμάτων συσσώρευσης και μελέτη της πρόσδεσης των αναλόγων στις ιντεγκρίνες χρησιμοποιήθηκε η κυτταρομετρία ροής με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των υποδοχέων Gp Ia, Gp IIb/IIIa, Gp IIIa και GMp 140.
Αναλύοντας τα αποτελέσματα των βιολογικών μελετών, τόσο της αναστολής της συσσωμάτωσης των αιμοπεταλίων του ανθρώπου in vitro όσο και της κυτταρομετρίας ροής σε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια για τα δραστικά πεπτίδια, οδηγούμαστε στα επόμενα συμπεράσματα:
1. Από τη σειρά των RGD γραμμικών αναλόγων που μελετήθηκαν, βρέθηκαν δραστικά μόνο στην περίπτωση που τα πεπτίδια έχουν στο C-τελικό τους άκρο αμίδιο.
2. Η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος στο τριπεπτίδιο - αμίδιο RGD ενισχύει την αντισυγκολλητική του δράση έναντι των αιμοπεταλίων in vitro. Από αυτά τα ανάλογα 26 (IC50= 50μΜ), 27 (38μΜ) και 28 (53μΜ) (ενσωματωμένο σαλικυλικό οξύ στο τριπεπτίδιο) έχουν την ισχυρότερη δράση, ενώ μόνο το τριπεπτίδιο 23 έχει IC50= 540μΜ
3. Η προστασία του β-καρβοξυλίου του Asp με βενζυλομάδα αυξάνει τη δράση του πεπτιδίου σε σχέση με την ύπαρξη ελεύθερου β-καρβοξυλίου. Αυτό διαπιστώνεται από το γεγονός ότι όλα τα βιολογικώς δραστικά ανάλογα έχουν το β-καρβοξύλιο προστατευμένο με βενζυλομάδα και αυτό έρχεται σε συμφωνία με βιβλιογραφικά δεδομένα άλλων ερευνητών περί αναγκαιότητας ύπαρξης λιπόφιλης ομάδας στο C-τελικό άκρο του πεπτιδίου.
4. Αντίθετα, η ενσωμάτωση σαλικυλο-παραγώγων (βρώμο-, χλώρο-, νίτρο-, άμινο-, κτλ) στα ανάλογα δίνει πολύ μικρή αντισυγκολλητική δράση στα αιμοπετάλια του ανθρώπου in vitro σε σχέση με το σαλικυλικό οξύ.
5. Από τα συντεθέντα κυκλικά ανάλογα μόνο το ανάλογο 61, που φέρει δισουλφιδικό δεσμό μεταξύ της κυστεΐνης και του θειοσαλικυλικού οξέος, επέδειξε ισχυρή αντισυγκολλητική δράση έναντι των αιμοπεταλίων του ανθρώπου in vitro με τιμή IC50= 8μΜ, που είναι και η καλύτερη τιμή IC50 για όλα τα ανάλογα που συντέθηκαν (γραμμικά και κυκλικά).
6. Και στην περίπτωση των κυκλικών πεπτιδίων, τα ανάλογα με το προστατευμένο β-καρβοξύλιο εμφανίζουν ισχυρότερη ανασταλτική δράση έναντι εκείνων που φέρουν το β-καρβοξύλιο ελεύθερο.
7. Από όλα τα γραμμικά ανάλογα που περιέχουν παράγωγα του σαλικυλικού οξέος το ανάλογο 39 που περιέχει το 5-χλωρο σαλικυλικό οξύ εμφανίζει ισχυρή ανασταλτική δράση έναντι του υποδοχέα Gp Ib.
8. Τέλος, θα πρέπει να αναφερθεί ότι είναι η πρώτη φορά που συνθετικά πεπτιδικά ανάλογα του RGD εμφανίζουν ισχυρή πρόσδεση στον υποδοχέα Gp Ib, o οποίος ευθύνεται για την προσκόλληση των αιμοπεταλίων στο κυτταρικό τοίχωμα. / Integrins constitute a large family of heterodimeric cell-surface, transmembrane receptors, which play a major role in cell/cell and cell/matrix adhesive interactions. The Arg-Gly-Asp (RGD) sequence is known to be the integrin recognition site of many extracellular matrix proteins such as fibronectin, osteopontin, collagen, fibrinogen, von Willebrand factor, laminin, etc. On the other hand, it is well known that low doses of aspirin (acetyl salicylic acid) decrease platelet aggregation by causing an inhibitory effect on thromboxane A2 production by platelets. Several antiplatelet strategies have already been developed and are under preclinical or clinical investigation. In the present thesis, the synthesis of linear and cyclic RGD analogs incorporating salicylic acid derivatives is reported. The syntheses of the new analogs were carried out by using classic methods of peptide synthesis in liquid or solid phase. The synthesized compounds were purified by RP-HPLC and lyophilised to give fluffy solid, identified by ESI-MS spectra.
These compounds were tested for inhibitory activity on human platelet aggregation in vitro, by adding common aggregation reagents to citrated platelet rich plasma (PRP). The aggregation was determined using a dual channel electronic aggregometer by recording the increase of light transmission. Their specificity for the Gp receptors was checked by using flow cytometry with monoclonal antibodies against Gp Ib, Gp IIb/IIIa, Gp IIIa and GMP140 receptors.
Based on the results of the biological studies we could report the next inferences:
1. From the studied synthetic RGD analogs only peptides – amides are active against human platelet aggregation in vitro.
2. The coupling of salicylic acid with the RGD peptides enforces the antiplatelet activity in vitro of the single tripeptide. From the above peptides, the analog 26 (tripeptide incorporating salicylic acid) shows strong antiplatelet activity (IC50=50 μΜ), whereas the analog 23 (only tripeptide) has IC50= 540μΜ.
3. The protection of the β-carboxy group of Asp as benzylester increases the activity of the peptides in comparison with those having the β-carboxy group unprotected. Thus, our results ensure the theory of necessity of the existence a lipophile center on the C-terminal side of the peptide.
4. The incorporation of salicylic acid derivatives in the RGD peptide does not increase further the antiplatelet activity than the incorporation of salicylic acid does.
5. Among the cyclic RGD peptides only the analog 61, having the disulfide bridge between the cysteine and the thiosalicylic acid, shows strong antiplatelet activity in vitro (IC50= 8μΜ).
6. Most of the analogs show high binding affinity for the Gp Ib receptor. The cyclic analog 61 shows special selectivity for this receptor at concetrations of 110 μΜ.
7. The analog 39, although it shows low antiplatelet activity, has high binding affinity for the Gp Ib receptor. Probably, this activity is due to the atom of Cl at the 5 position of aromatic ring of salicylic acid.
8. According to the literature data, it is the first time that synthetic RGD peptides show strong binding affinity for the Gp Ib receptor, which is responsible for the platelet adhesion to the subenthothelium.
|
2 |
Παράγοντες που επηρεάζουν τη μακροπρόθεσμη λειτουργία και βατότητα των αρτηριοφλεβικών επικοινωνιών για αιμοκάθαρσηΛαμπρόπουλος, Γιώργος 22 December 2009 (has links)
Η θρόμβωση αποτελεί το πιο συχνό αίτιο δυσλειτουργίας της αγγειακής προσπέλασης, στους ασθενείς, με νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου, που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση.
Σκοπός: Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η εκτίμηση του ρόλου του προεγχειρητικού απεικονιστικού ελέγχου στη δημιουργία αγγειακής προσπέλασης και ο έλεγχος των παραγόντων που επηρεάζουν τη βιωσιμότητα της. Εκτιμήθηκε η επίδραση της διαμέτρου των αγγείων, που χρησιμοποιούνται στη δημιουργία αγγειακής προσπέλασης, στη βατότητα αυτής. Ελέγχθηκε ο ρόλος των γονιδιακών θρομβοφιλικών παραγόντων (FV Leiden, FII G20210A και MTHFR C677T→A) στην παρουσία θρόμβωσης και στην επιβίωση της ΑΦΕ. Τέλος ελέγχθηκε η δυνατότητα πρόβλεψης της θρόμβωσης με τη χρήση δημογραφικών, αιμοδυναμικών, αιματολογικών και βιοχημικών παραγόντων, αλλά και των θρομβοφιλικών γονιδιακών μεταλλάξεων.
Μέθοδος- Υλικό: 137 συνεχόμενα περιστατικά, από Μάρτιο 2005 έως Δεκέμβριο 2006, προσήλθαν για δημιουργία αγγειακής προσπέλασης για αιμοκάθαρση και εντάχθηκαν στην παρούσα μελέτη. Μετά από φυσική εξέταση και λήψη ιστορικού, κατεγράφη το αιματολογικό- βιοχημικό τους προφίλ και η παρουσία θρομβοφιλικών μεταλλάξεων. Υπεβλήθηκαν σε χαρτογράφηση των αγγείων των άκρων με χρήση υπερήχων και φλεβογραφία και συνυπολογίζοντας όλα τα δεδομένα ακλούθησε η δημιουργία αγγειακής προσπέλασης. Δημιουργήθηκαν 26 περιφερικές ΑΦΑ, 74 κεντρικές ΑΦΑ, τοποθετήθηκαν 32 ΑΦΜ και σε 5 περιστατικά ετέθη μόνιμος καθετήρας. Εξαιρέθηκαν από τη μελέτη τα περιστατικά με πρώιμη θρόμβωση (9), τα περιστατικά που δεν χρησιμοποιήθηκε η αγγειακή προσπέλαση (11) και στα περιστατικά που χάθηκαν από την παρακολούθηση η απεβίωσαν πριν συμπληρωθούν τουλάχιστον 4 μήνες ελέγχου (14). Στα υπόλοιπα 102 περιστατικά έγινε υπερηχογραφικός έλεγχος της αγγειακής προσπέλασης στους 2, 6 και 12 μήνες και κλινική εκτίμηση έως το πέρας της μελέτης σε τακτά χρονικά διαστήματα.
Αποτελέσματα: Η USVM άλλαξε το προεγχειρητικό σχεδιασμό σε 31 (22.6%) ασθενείς, χωρίς να αλλάξει η τελική αναλογία του τύπου σε σύγκριση με την αρχική εκτίμηση. 18 ασθενείς (36.7%) που τα υπερηχογραφικά ευρήματα άλλαξαν το σχεδιασμό ήταν διαβητικοί σε σύγκριση με το 14.8% (13) σε μη διαβητικούς (p<.001). Στα περιστατικά που άλλαξε το σχεδιασμό η USVM υπήρξαν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα σε πρόγραμμα αιμοκάθαρσης(2.7 vs. 0.9 έτη). Φλεβογραφικά αναγνωρίστηκαν 18 περιστατικά με κεντρική στένωση και σε 12 από αυτά άλλαξε ο σχεδιασμός. Σημαντική στένωση παρουσίασε το 93% των ασθενών που στο ιστορικό ανέφεραν πάνω από 2 τοποθετήσεις κεντρικών καθετήρων. Η διάμετρος της φλέβας στις αναστομώσεις που παρουσίασαν πρώιμη θρόμβωση υπήρξε μικρότερη από τις υπόλοιπες λιτουργικές ΑΦΑ (2.84 vs 3.94, p<.001). Οι ΑΦΕ που παρουσίασαν θρόμβωση παρουσίασαν αρχική παροχή (Qa) 558.13 ml/min σε σύγκριση με τα 821.26 ml/min των περιστατικών που δεν παρουσίασαν θρόμβωση. Τα περιστατικά που παρουσίασαν θρόμβωση είχαν υψηλότερη συγκέντρωση Lp(a), είχαν ενταχθεί για μεγαλύτερο χρόνο σε αιμοκάθαρση και παρουσίαζαν μετάλλαξη του MTHFR (R2=0.6, p<.001). Οι γυναίκες, τα μοσχεύματα, ο χαμηλότερος όγκος ροής και η παρουσία μετάλλαξης FV Leiden σχετίζονται με συχνότερη εμφάνιση θρόμβωσης (p<.05).
Συμπεράσματα: Ο υπερηχογραφικός έλεγχος θα πρέπει να γίνεται συστηματικά στον προεγχειρητικό σχεδιασμό, με μεγαλύτερο όφελος στους διαβητικούς, σε άτομα με περισσότερο χρόνο σε αιμοκάθαρση, με ιστορικό άλλων επεμβάσεων αγγειακής προσπέλασης. Η φλεβογραφία θα πρέπει να γίνεται σε όλους τους ασθενείς με ιστορικό τοποθέτησης κεντρικής γραμμής στην πλευρά του χειρουργείου. Η πρώιμη θρόμβωση της ΑΦΕ συνδέεται με μικρότερη διάμετρο της φλέβας προς αναστόμωση. Ο Qa αποτελεί αξιόπιστο δείκτη καλής λειτουργίας της ΑΦΕ. Η θρόμβωση εμφανίζεται πιο συχνά στις γυναίκες, στους ασθενείς με αυξημένα επίπεδα Lp(a), σε ατόμα με περισσότερα χρόνια σε αιμοκάθαρση και στα ΑΦΜ. Τόσο ο FV Leiden όσο και το MTHFR φαίνεται να παίζουν ρόλο στην εμφάνιση θρόμβωσης στις ΑΦΑ. / Vascular access thrombosis (VAT) is one of the most common causes of morbidity in hemodialysis patients.
Objective: In an effort to increase the prevalence of AV fistulae, ultrasound vessel mapping (USVM) and upper extremity venography (UEV) have been suggested; however the effectiveness of their combined use remains unknown. We studied the effect of such a combined protocol on AV access type change, compared to physical examination alone. The vascular access patency had been correlated to vessel diameter and to a number of thrombosis risk factors. Finally the role of genetic thrombophilic risk factors on vascular access thrombosis was studied.
Methods: Consecutive cases with chronic kidney disease (n=137) after an initial estimation of the AV access type based on physical examination, had USVM and UEV, to detect vascular pathology that could potentially alter the original plan. 26 distal AVF, 74 central AVF, 32 AV grafts and 5 permanent catheters were placed. 9 cases presented early thrombosis, 11 cases had delayed first use or the access wasn’t used at all, 14 patients died or did not present at their follow up and were excluded from our study. On the remaining 102 cases an ultrasound control of the VA was performed on 2, 6 and 12 months and clinical evaluation of the VA was performed in a regular base.
Results: USVM changed the preoperative plan in 22.6% (31) patients; this was 36.7% (n=18) in diabetics compared to 14.8% (n=13) in non-diabetics (p<.001). Patients that USVM changed the type of the planned AV access had been on hemodialysis significantly longer (2.7 years vs. 0.9 years, p<.001). Venography identified 18 patients with central vein stenosis that led to a site change in 12 of them. Significant venous stenosis in patients with history of two or more central catheters placed and without such was 93%.Original plan was revised in 31% and this rate was similar for distal AVFs, central AVFs and AV grafts (38%, 26% and 43%, respectively, all p>0.05). The internal vein diameter used in VA creation was significant smaller in cases of early thrombosis (2.84 vs 3.94, p<.001). Thrombosed VA presented with initial flow volume measurement (Qa) of 558.13 ml/min and was significantly lower than VA without thrombosis 821.26 ml/min. Thrombosis was more frequent in a) higher values of cholesterol and Lp(a), b) longer periods under hemodialysis, b) lower blood flow volume in initial testing and with existence of MTHFR mutations. VA was thrombosed sooner in women, when an AV graft was placed and in FV Leiden mutation (p<.05).
Conclusions: A significant proportion of patients have vascular pathology severe enough to alter the access type as suggested by physical examination alone. USVM should be routinely performed, while UEV selectively in patients with history of surgery or instrumentation of their central veins. The early thrombosis of VA appears on a smaller vein diameter. The blood flow volume measurement is a reliable indicator in case of vascular access thrombosis. Thrombosis appears in greater proportion in women, in higher Lp(a) concentration, in AV grafts. Finally FV Leiden and MTHFR mutations seem to play a role in vascular access thrombosis.
|
Page generated in 0.0192 seconds