Οι COUP-TFs είναι πυρηνικοί μεταγραφικοί παράγοντες, οι οποίοι υπάγονται στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων. Τα μέλη της οικογένειας COUP-TF γενικά θεωρούνται καταστολείς της μεταγραφής και πολυάριθμοι μηχανισμοί έχουν προταθεί να υποστηρίζουν αυτή τους τη δράση. Με σκοπό να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός καταστολής των μελών της οικογένειας των COUP-TFs, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος yeast two-hybrid για να αναγνωριστούν πρωτεΐνες που εκφράζονται επίσης στον εγκέφαλο και ταυτόχρονα αλληλεπιδρούν άμεσα με μέλη της συγκεκριμένης οικογένειας. Η πρωτεΐνη CTIP1, ένα μέλος της καινούργιας οικογένειας των C2H2 πρωτεϊνών δακτύλου ψευδαργύρου, που απομονώθηκε σαν μία πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά άμεσα με τον ARP1 και πιθανόν να εμπλέκεται στη μεταγραφική καταστολή που διαμεσολαβείται από τον ARP1, η οποία είναι ανεξάρτητη από την ευαίσθητη στην τριχοστατίνη Α αποακετυλίωση των ιστονών. Τόσο η CTIP1 όσο και η CTIP2 εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στον εγκέφαλο μια περιοχή για την οποία είναι γνωστό ότι εκφράζονται τα μέλη της οικογένειας των COUP-TFs, υπονοώντας ότι αυτή η καινούρια οικογένεια των πρωτεϊνών C2H2 δακτύλου ψευδαργύρου πιθανόν να εμπλέκεται στο σηματοδοτικό μονοπάτι των COUP-TFs. Στο πρώτο μέρος της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής, ο στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης COUP-TF Interactive Protein (CTIP) στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια του αχινού Paracentrotus lividus με τη μέθοδο του ανοσοφθoρισμού και να συγκρίνουμε το πρότυπο αυτό με το πρότυπο έκφρασης του COUP-TF και ταυτόχρονα να ελέγξουμε αν οι δύο αυτοί μεταγραφικοί παράγοντες αλληλεπιδρούν μέσω πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης. Ταυτόχρονα σημαντική ήταν και η προσπάθεια να μελετηθεί και η κατανομή των δύο ισομορφών του COUP-TF στα Μετάζωα. Το γονίδιο του COUP-TF αποτελείται, σε όλους τους μέχρι σήμερα μελετημένους οργανισμούς, από τρία εξώνια και δύο εσώνια που διακόπτουν την κωδική περιοχή του γονιδίου σε συντηρημένες θέσεις. Ωστόσο, έχει βρεθεί ότι ο αχινός Paracentrotus lividus διαφοροποιείται από αυτό το μοντέλο καθώς το γονίδιο αποτελείται από τέσσερα εξώνια (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας). Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι το επιπλέον εξώνιο βρίσκεται μεταξύ του πρώτου και του δεύτερου εξωνίου και έχει μέγεθος 63nt. Στο πρωτογενές μετάγραφο του COUP-TF συμβαίνει εναλλακτικό μάτισμα που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δύο m RNAs που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες, οι οποίες διαφέρουν ως προς το μέγεθος λόγω της εισαγωγής 21 επιπρόσθετων αμινοξέων στην καρβόξυτελική περιοχή (CTE) της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). Αν και πολλά δεν είναι γνωστά σχετικά με την ενδοκυτταρική τοποθέτηση κυρίως της μεγάλης ισομορφής, πειράματα EMSA ωστόσο εδειξαν οι δύο αυτές πρωτεΐνες διαφέρουν ως προς την ικανότητα πρόσδεσής τους στο DNA, με τη μεγάλη υπομονάδα του COUP να στερείται της ικανότητας να προσδένεται σε COUP στοιχείο απόκρισης. Σε μια προσπάθεια να μελετηθεί διεξοδικότερα το φαινόμενο του εναλλακτικού ματίσματος και συγκεκριμένα να διαπιστωθεί αν πρόκειται για ένα φαινόμενο συντηρημένο στα εχινοειδή, αποκλειστικό ή όχι αυτών, το συμπέρασμα που προέκυψε είναι ότι το εναλλακτικό μάτισμα είναι συντηρημένο και εμφανίζεται σταθερά στα είδη των αχινών που μελετήθηκαν (Paracentrotus lividus, Spaerechinus granularis, Strongylocentrotus purpuratus). Το εναλλακτικό μάτισμα λαμβάνει χώρα σε όλα τα στάδια από τα αγονιμοποίητα ωάρια εως τον πλουτέα και σε όλους τους ιστούς που o COUP-TF εκφράζεται (κοιλωματικά κύτταρα, μύες, έντερο). Για να μελετήσουμε την εξάπλωση του εναλλακτικού ματίσματος στα Μετάζωα, επιλέχθηκαν αντιπρόσωποι απ΄ όλες τις ομοταξίες του φύλου των Εχινόδερμων (Strongylocentrotus purpuratus, Amphiura filiformis, Patiria miniata, Marthasteria glacialis, Holothuria polii, Oxycomanthus japonicas), του φύλου των Ημιχορδωτών (Sakoglossus kowalevski), του φύλου των Χαιτόγναθων (Sagita minima), του υπόφυλου των Ουροχορδωτών (Ciona intestinalis) και του φύλου Xenoturbella (Xenoturbella bocki) για την απομόνωση ολικού RNA από καθέναν από αυτούς τους οργανισμούς. Αυτό το υλικό αποτέλεσε το υπόστρωμα για την πραγματοποίηση μιας σειράς πειραμάτων RT-PCR και Nested PCR με τη χρήση ειδικά σχεδιασμένων εκκινητών (degenerate primers). Η κλωνοποίηση των προιόντων σε κατάλληλο φορέα συνέβαλλε στην αλληλούχηση των κατάλληλων κλώνων. Παράλληλα, με το πρόγραμμα BLAST ψάξαμε για ομολογία της μικρής ισομορφής της πρωτεΐνης του COUP-TF του Paracentrotus lividus με άλλες πρωτεΐνες άλλων οργανισμών. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν τόσο μέσα από τη νουκλεοτιδική αλληλούχηση όσο και μέσω της ηλεκτρονικής διερεύνησης συνηγορούσαν υπέρ της παρουσίας του εναλλακτικού ματίσματος ως ενός φαινομένου καθολικού που αφορά ευρύτερες (αν όχι όλες) ομάδες των Μεταζώων. / --

Οι μεταγραφικοί παράγοντες COUP-TF (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor) ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων στεροειδών/ θυρεοειδών ορμονών και θεωρούνται “ορφανοί”, αφού μέχρι στιγμής δεν έχει βρεθεί το υπεύθυνο πρόσδεμα για την ενεργοποίηση τους. Πειραματικές διαδικασίες στο εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι στο πρωτογενές μετάγραφο των COUP-TFs συμβαίνει εναλλακτικό μάτισμα που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δύο mRNAs που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες οι οποίες διαφέρουν ως προς το μέγεθος λόγω της εισαγωγής 21 επίπρόσθετων αμινοξέων στην καρβοξυτελική περιοχή (Carboxy Terminal Extension) της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). Πειράματα EMSA με τη χρήση in vitro μεταφρασμένων πρωτεϊνών, αποκάλυψαν ότι η μεγάλη πρωτεΐνη δεν μπορεί να προσδεθεί σε κανένα COUP-TF στοιχείο απόκρισης. Επίσης παρατηρήθηκε ότι παρουσία της μεγάλης πρωτεΐνης, η ικανότητα της μικρής πρωτεΐνης να προσδένεται στο DNA μειώνεται με ανταγωνιστικό τρόπο, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι το ετεροδιμερές πρωτεϊνικό σύμπλοκο δεν μπορεί να προσδεθεί στο DNA. Σκοπός μας είναι να ερευνήσουμε το ρόλο της ένθεσης των 21 αμινοξέων στην μεγάλη πρωτεΐνη, ως προς την ικανότητα πρόσδεσης της στο DNA. Στον αχινό Paracentrotus lividus, η αμινοξική ένθεση στην καρβοξυτελική περιοχή (CTE) της μεγάλης πρωτεΐνης περιέχει δύο προλίνες. Η υπόθεση μας είναι ότι αυτές οι δύο προλίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην στερεοδιαμόρφωση της πρωτεΐνης, επηρεάζοντας την ικανότητα πρόσδεσης στο DNA. Για να ελέγξουμε την υπόθεση αυτή, προκαλέσαμε σημειακές μεταλλάξεις, μεταλλάσσοντας συγχρόνως τις δύο προλίνες σε αλανίνες αλλά κάθε μία προλίνη σε αλανίνη μεμονωμένα, καθώς επίσης μελετήσαμε και μια σειρά εσωτερικών αμινοξικών ελλειμάτων μέσα στην ένθεση των 21 αμινοξέων στην καρβοξυτελική περιοχή. Το σύνολο των μεταλλάξεων έδειξε ότι οι μεταλλαγμένες μεγάλες πρωτεΐνες δεν προσδένονται στο DNA καθώς επίσης ότι οι μεταλλαγμένες μεγάλες πρωτεΐνες ετεροδιμερίζονται πιο αποτελεσματικά με την μικρή ισομορφή πιθανότατα λόγω επαγόμενης αλλαγής της στερεοδιαμόρφωσης της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης. Επίσης μελετήσαμε την εξάπλωση του εναλλακτικού ματίσματός στα Δευτεροστόμια, χρησιμοποιώντας ειδικούς εκφυλισμένους εκκινητές σε πειράματα PCR. Εναλλακτικό μάτισμα των μεταγράφων COUP-TF παρατηρήθηκε επίσης στους οργανισμούς Sphaerechinus granularis (Εχινόδερμο) και Saccoglossus kowalevskii (Ημιχορδωτό). / COUP-TFs (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter- Transcription Factors) belong to the superfamily of steroid/thyroid hormone receptors and they are consider orphans since the proper ligand that activates them is not yet found. Experimental procedures in our laboratory have shown that in Echinoderms the alternative splicing of the COUP-TF primary transcript results in two mRNAs which encode two protein variants that differ by a 21 amino acid insertion in the Carboxy Terminal Extension (CTE) of the DNA Binding Domain (DBD). EMSA experiments with the use of in vitro translated proteins revealed that the large protein variant is incapable of binding any COUP-TF response elements. Furthermore, in the presence of the large variant, the small COUP-TF protein ability to bind DNA is diminished in an antagonistic way, suggesting that the heterodimeric protein is also incapable of DNA binding. Our aim is to investigate the role of the 21aa insertion in the large variant regarding the DNA binding affinity. In sea urchins the CTE insertion in the large variant contains two prolines. Our hypothesis is that these two prolines play an important role in the protein‟s conformation which in turn is responsible for the loss of DNA binding. To check this, we created point mutations by mutating both prolines to alanines simultaneously and then each proline to alanine separately. We also analyzed a series of internal amino acid deletions within the 21aa insertion of the CTE. All the mutations proved that the large mutated proteins are incapable of binding DNA and that they heterodimerize more effectively with the small protein variant possibly because of the changed conformation of the large protein variant. We also studied the alternative splicing among Deuterostomes, by using degenerate primers in PCR experiments. We observed that alternative splicing of COUP-TF transcripts occurs in the sea urchin Sphaerechinus granularis and in the hemichordate Saccoglossus kowalevskii.

Τα τελικά προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (AGEs: Advanced Glycation Endproducts) παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των διαβητικών αγγειακών επιπλοκών. Το καλύτερα χαρακτηριζόμενο είναι η N-καρβοξυμεθυλ-λυσίνη (CML). Τα AGEs προκαλούν σημαντικές επιδράσεις στα αγγεία με την πρόσδεσή τους σε ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, όπως τον RAGE (Receptor for Advanced Glycation Endproducts). Διαλυτές μορφές του RAGE (sRAGE) εμφανίζονται στο ανθρώπινο αίμα και δρουν ως παγίδα αιχμαλωτίζοντας τους φλεγμονώδεις προσδέτες του RAGE εξωκυττάρια, προστατεύοντας με αυτό τον τρόπο τα κύτταρα από τη βλάβη που προάγεται από τα AGEs. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να μελετηθούν τα επίπεδα του sRAGE, η πρωτεϊνική έκφραση του RAGE, καθώς και τα επίπεδα CML σε σχέση με διάφορες κλινικές και βιοχημικές παραμέτρους σε παιδιά, εφήβους και νεαρούς ενήλικες με ΣΔ1. Τα επίπεδα sRAGE και CML προσδιορίστηκαν με ELISA και η πρωτεϊνική έκφραση του RAGE στα μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος με ανοσοαποτύπωση κατά Western σε 74 παιδιά, εφήβους και νεαρούς ενήλικες με ΣΔ1 (13± 4 χρονών) και 43 μάρτυρες αντίστοιχης ηλικίας, φύλου και σταδίου Tanner. Σ’ αυτή την εργασία τα αυξημένα επίπεδα sRAGE στα παιδιά με ΣΔ1 και πιο ειδικά, σ’ αυτά ηλικίας κάτω από 13 ετών και με διάρκεια διαβήτη κάτω από 5 έτη, μπορεί να είναι ένα προσωρινό προστατευτικό μέτρο ενάντια στην κυτταρική βλάβη και πιθανόν να είναι επαρκές για να εξουδετερώσει επαρκώς τα κυκλοφορούντα CML, εμποδίζοντας έτσι τις διαβητικές αγγειακές επιπλοκές. Επίσης, μια ήπια αύξηση της LDL θα μπορούσε να είναι ένα ερέθισμα για την αύξηση του sRAGE, οδηγώντας στη δέσμευση του CML και τελικά τη μείωση των επιπέδων CML στην κυκλοφορία. Τα μειωμένα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης του RAGE 55 kd (υποδοχέα πλήρους μήκους) μπορεί να αντανακλούν την αυξημένη έκφραση του sRAGE στους ασθενείς με ΣΔ1 συνολικά λόγω της αποκοπής του RAGE με μεταλλοπρωτεϊνάσες. Με την παρουσία κάποιου παράγοντα κινδύνου, όπως αύξηση ηλικίας, περιμέτρου κοιλίας, BMI, συστολικής ή διαστολικής αρτηριακής πίεσης ή επιδείνωση λιπιδαιμικού προφίλ αυξάνεται η πρωτεϊνική έκφραση της ισομορφής αυτής, ενώ φαίνεται αντίστοιχα να μειώνονται τα επίπεδα του sRAGE. Φαίνεται τελικά ότι συνολικά στα παιδιά, τους εφήβους και τους νεαρούς ενήλικες με ΣΔ1 υπάρχει μια υποκλινική διαταραχή του άξονα sRAGE-RAGE-CML, η οποία δύναται να μετατραπεί σε κλινικά εμφανείς αγγειακές βλάβες, αν προστεθούν περαιτέρω επιβαρυντικοί παράγοντες. / The binding of Advanced Glycation Endproducts (AGEs) to their receptor (RAGE) plays a major role in the development of diabetic vascular complications. This work is based on the relation between circulating soluble RAGE (sRAGE) levels in children, adolescents and young adults with IDDM and RAGE protein expression in association with N-(carboxymethyl)lysine (CML), a major antigenic AGEs component. Circulating sRAGE and CML levels were determined by ELISA and RAGE protein expression was evaluated in peripheral blood mononuclear cells by western immunoblotting in 74 children, adolescents and young adults with IDDM (134 years old) and 43 age, sex and Tanner stage-matched controls. Serum sRAGE levels were significantly higher in IDDM than in controls, inversely correlated to diabetes duration and directly correlated to LDL levels. Furthermore, circulating CML levels were not significantly different between IDDM and controls. Also, the protein expression of the RAGE isoforms 55 kd (full-length), 64 kd and 100 kd, measured by western immunoblotting, was significantly lower in IDDM than in controls, whereas RAGE 37 kd levels were not significantly different between IDDM and controls. Finally, when there was a risk factor, such as increased age, poor lipid profile, increased BMI or waist circumference or increased systolic or diastolic pressure, then it seemed that isoforms RAGE 55, 64 and 100 kd were increased. Isoform RAGE 64 kd could be RAGE-v5, a splice variant which resulted in a change of amino acid sequence in the extracellular ligand-binding domain of RAGE. Isoform RAGE 37 kd seemed to be Δ8-RAGE, a soluble splice variant with probably protective function, which had been found increased in patients with increased HDL. Finally, isoform RAGE 100 kd seemed to be some other splice variant in peripheral mononuclear cells. In conclusion, increased serum levels of sRAGE seen in IDDM children may be a temporary protective measure against cell damage and may be sufficient to efficiently eliminate excessive circulating CML. Moreover, the lower protein expression of the full-length RAGE in IDDM may also reflect the increased sRAGE expression in patients due to RAGE cleavage by metalloproteases. Consequently, in IDDM children, adolescents and young adults there may be a subclinical perturbation of the sRAGE-RAGE-CML axis, which could lead to future clinical vascular damage if additional risk factors are added over time.