Το Hypericum perforatum φύεται σε όλες τις εύκρατες περιοχές του πλανήτη. Τα υπέργεια τμήματά του συλλέγονται κατά την περίοδο της ανθοφορίας του και αποτελούν τη δρόγη του φυτού, η οποία συνήθως αποξηραίνεται. Υδροαλκοολικά του εκχυλίσματα, βάμματα και ελαιώδη εκχυλίσματα χρησιμοποιούνται κατά ψυχιατρικών παθήσεων και για την επούλωση πληγών και εγκαυμάτων. Η χρήση τους είναι ιδιαίτερα διαδεδομένη, ιδιαίτερα στην κεντρική Ευρώπη. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία χρωματογραφική μέθοδος προσδιορισμού των κύριων βιοδραστικών συστατικών του H. perforatum. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε όργανο HPLC συζευγμένο με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (DAD) με χρήση χρωματογραφικής στήλης ανάστροφης φάσης C-18 και σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης τριών διαλυτών. Διαχωρίστηκαν πλήρως και προσδιορίστηκαν τα επικρατέστερα ποσοτικά συστατικά της δρόγης, δηλαδή: χλωρογενικό οξύ, ρουτίνη, υπεροζίτης, ισοκερσετίνη, κερσετίνη, διαπιγενίνη, ψευδοϋπερικίνη και υπερικίνη. Η επικύρωση της μεθόδου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τα διεθνή πρότυπα εμβολιάζοντας ποσότητες προτύπων ενώσεων σε διάλυμα εκχυλίσματος H.perforatum συγκέντρωσης 0,5 mg/mL. Για καθένα από τα συστατικά αυτά (το χλωρογενικό οξύ, τη ρουτίνη, τον υπεροζίτη, την ισοκερσετίνη, την κερσετίνη και την υπερικίνη) κατασκευάστηκε η καμπύλη βαθμονόμησής του και όλες κατέδειξαν εξαιρετική γραμμικότητα. Η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα της μεθόδου επικυρώθηκαν με έλεγχο της ικανότητας ανάκτησης των συστατικών (ακρίβεια) και με εκτίμηση της εγγύτητας των αποτελεσμάτων επαναλαμβανόμενων πειραμάτων (επαναληψιμότητα) σε τέσσερα επίπεδα συγκέντρωσης. Ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα λήφθηκαν τόσο σε πειράματα εντός της ίδιας μέρας όσο και μεταξύ δύο ημερών για όλα τα συστατικά, με εξαίρεση εκείνων του χλωρογενικού οξέος. Ο έλεγχος της σταθερότητας, διάρκειας 30 ημερών, έγινε σε τρία επίπεδα συγκεντρώσεων υπό διάφορες συνθήκες φύλαξης (θερμοκρασία δωματίου, ψυγείο, κατάψυξη). Κάθε συστατικό παρουσίασε διαφορετική συμπεριφορά, όλα όμως εμφάνισαν αξιοσημείωτη σταθερότητα ακόμη και 30 ημέρες μετά, όταν φυλάσσονταν στους -18 οC. Τέλος, ελέγχθηκε το μέγεθος του φαινομένου της μεταφοράς υλικού (carry over) μεταξύ των αναλυτικών κύκλων. Διαπιστώθηκε ότι η μεταφορά υλικού είναι σημαντική και πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στην αναλυτική διαδικασία όταν οι συγκεντρώσεις των συστατικών ξεπερνούν το ήμισυ του ULOQ. Η εφαρμογή της μεθόδου έδειξε ότι στο μεθανολικό εκχύλισμα και το έγχυμα του H. perforatum τα κυριότερα συστατικά που προσδιορίστηκαν ήταν τα φλαβονοειδή, εκ των οποίων ο υπεροζίτης βρέθηκε σε μεγαλύτερες ποσότητες. Στο έγχυμα, αν και γενικότερα προσδιορίστηκαν μικρότερες ποσότητες των διαφόρων συστατικών, εντοπίστηκε και χλωρογενικό οξύ το οποίο απουσιάζει από το μεθανολικό εκχύλισμα. Στο μεθανολικό εκχύλισμα της πόας H.vesiculosum κυριότερη ομάδα συστατικών εμφανίζονται τα φλαβονοειδή, με την ισοκερσετίνη και διαπιγενίνη σε μεγαλύτερες ποσότητες. Όσον αφορά στο έλαιο H. perforatum εξετάστηκαν δύο εκχυλιστικές μέθοδοι οι οποίες και ελέγχθηκαν ως προς την αποτελεσματικότητά τους. Στην πρώτη μέθοδο πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με χρήση ενός υδατικού διαλύματος και στη δεύτερη με χρήση οξειδίου του πυριτίου ως προσροφητικό υλικό. Αν και καμία δεν είχε ικανοποιητική απόδοση εκχύλισης όπως εδείχθη με προσδιορισμό της ανάκτησης από εμβολιασμένα δείγματα, τα συστατικά που προσδιορίστηκαν σε δύο διαφορετικά έλαια είναι τα φλαβονοειδή κερσετίνη και διαπιγενίνη καθώς και η ναφθοδιανθρόνη ψευδοϋπερικίνη. / Hypericum perforatum has a cosmopolitan distribution in temperate regions. The aereal parts of the plant are collected during the flowering stage, they are dried and they constitute the drug. The most common preparations are the water-alcohol extracts, tinctures and oily extracts and they are used against psychiatric conditions as well as for wound and burn healing. H. perforatum extracts are so widely used, especially in central Europe, that they are among the most popular formulations against depression. In the current master thesis a chromatographic method for the determination of the major bioactive constituents of H.perforatum was developed and validated. This validated method was applied in methanol extract, infusion and oily extract (Hypericum oil) of the herb. The chromatographic separation was performed using a HPLC instrument coupled with a photo diode array detector (DAD) and a C-18 reverse phase (RP) column in a three solvent multistep gradient program. The identified constituents were: chlorogenic acid, rutin, hyperoside, isoquercetin, quercetin, biapigenin, pseudohypericin and hypericin. All of them were completely resolved. The method was validated in accordance with international standards using spiked quantities of standard solutions of chrorogenic acid, rutin, hyperoside, isoquercetin, quercetin and hypericin in a 0,5 mg/mL H.perforatum extract solution. For each of the above constituents a calibration curve was constructed and all of them have shown great linearity. For each constituent the lower and upper limit of quantification (LLOQ and ULOQ) was estimated. The accuracy and precision of the method were determined in four concentration levels. Accurate and precise results were obtained in both intra and interday (between two days) experiments for every constituent, with the exception of chlorogenic acid. The stability test (30 days duration), was performed in three concentration levels under different storage conditions (room temperature, fridge, refrigerator). Every constituent had a different stability behavior, all of them, though, were found having notable stability even after 30 days, when stored at -18 οC. Finally, the carry over effect between analytical circles was estimated. The carry over effect was significant and should be taken into consideration when concentrations are higher than half the ULOQ. The chemical composition of three H. perforatum preparations (methanol extract, infusion, Hypericum oil) and one H.vesiculosum preparation (methanol extract) was investigated. The major constituents, identified in the methanol extract and the infusion of H. perforatum, were the flavonoids, while hyperoside was found in greater amounts among them. Though, smaller amounts of the constituents were identified in the infusion, chlorogenic acid was present, in contrast with the methanol extract. In the methanol extract of H.vesiculosum the flavonoids were found the major group of constituents, with isoquercetin and biapigenin in larger quantities. Regarding the H. perforatum oil, two kinds of extractions were performed and evaluated for their efficiency. In the first one, the extraction was performed using an aqueous solution and the second one using silicon dioxide as an absorptive material. Even though neither extraction was efficient as was proved by recovery test of spiked samples, the constituents identified in two different oil preparations were the flavonoids quercetin and biapigenin and the naphthodianthrone pseudohypericin.

Ο Kρόκος ο ήμερος (Crocus sativus Linneaus) ή ζαφορά ή σαφράνι, είναι ένα από τα σπάνια φαρμακευτικά, αρτυματικά και με μεγάλη χρωστική ικανότητα φυτά, που απαντάται από πολύ παλιά στην Ελλάδα. H δρόγη του Crocus sativus L. (saffron) είναι το υπέργειο μέρος του στύλου το οποίο έχει έντονη χρωστική ικανότητα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βαφική ύλη, αποτελεί σημαντικό άρτυμα και έχει φαρμακευτική δράση με νευροπροστατευτικές, αντινεοπλασματικές και αντιλιπιδαιμικές ιδιότητες. Το φυτό Crocus sativus L. (οικογένεια Iridaceae) σήμερα καλλιεργείται σε πολλές περιοχές του κόσμου όπως στην Ινδία, στο Ιράν, στην Κίνα στην Ισπανία, στην Ελλάδα κ.α Εδώ και περίπου 300 χρόνια ο Κρόκος Κοζάνης καλλιεργείται και αναπτύσσεται αποκλειστικά στο Νομό Κοζάνης και κατατάσσεται στην πρώτη κατηγορία κρόκου βιολογικής καλλιέργειας στον κόσμο. Η υψηλή τιμή της δρόγης ευνοεί τη νοθεία της με προσθήκη άλλων ειδών του γένους και με ίνες από κολλώδιο και ζελατίνη που έχουν διασκευασθεί και χρωματισθεί. Η νοθεία του κρόκου απασχόλησε και εξακολουθεί να απασχολεί σοβαρά το εμπόριο αυτού του προϊόντος. Έχει αναφερθεί ότι το 30 % του εμπορικού saffron δεν πληρεί τις προδιαγραφές ποιότητας κάνοντας επιτακτική την ανάγκη μιας αξιόπιστης αναλυτικής μεθοδολογίας για τον ποιοτικό έλεγχο των δειγμάτων του saffron. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη αναλυτικής μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό και την ποσοτικοποίηση μερικών βιοδραστικών συστατικών του Crocus sativus L. (κροκίνες και πικροκροκίνη) των στύλων του Crocus sativus L. με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή υπεριώδους-ορατού συστοιχίας φωτοδιόδων (Ηigh Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector, HPLC-DAD). Η αναπτυχθείσα αναλυτική μεθοδολογία περιελάμβανε τρία κύρια στάδια: 1. Προκατεργασία των δειγμάτων του Crocus sativus L. πριν την ανάλυση. 2. Κατασκευή καμπύλης βαθμονόμησης με τη μέθοδο του εσωτερικού προτύπου (IS). 3. Επικύρωση της μεθόδου ( Method Validation) και συγκεκριμένα την εκτίμηση της γραμμικότητας (linearity), της ακρίβειας (precision), της ορθότητας (accuracy)και των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (Limit Of Detection/Quantitation, LOD/LOQ). Η μεθοδολογία HPLC-DAD που αναπτύχθηκε επιτρέπει την αξιόπιστη ποσοτικοποίηση των υπό μελέτη βιοδραστικών συστατικών σε δείγματα saffron. Η μέθοδος παρουσίασε καλή ευαισθησία, ακρίβεια, ορθότητα και γραμμικότητα για ευρεία δυναμική περιοχή καθώς και μικρό χρόνο ανάλυσης (περίπου 30 min) συγκρινόμενη με παλιότερες δημοσιευμένες μεθόδους. Από την εφαρμογή της μεθόδου για την μέτρηση δειγμάτων saffron συμπεράθηκε ότι οι ελληνικοί στύλοι του εμπορικού saffron (Cooperative De Safran, Kozani) είναι πλούσιοι στα υπό μελέτη βιοδραστικά συστατικά και περιείχαν μεγαλύτερες ποσότητες αυτών συγκρινόμενοι με εμπορικά saffron από την Ισπανία και την Συρία. Επίσης χρησιμοποιήθηκε για την χαρτογράφηση βιοδραστικών συστατικών των στύλων σε άλλα ενδημικά taxa του γένους Crocus και συνεπώς για την κατηγοροποίηση αυτών σύμφωνα με την χημική τους ανάλυση και σύγκριση τους ως προς το χημικό περιεχόμενο των στύλων τους και των στύλων του καλλιεργούμενου Crocus. Sativus L. Συνεπώς η προτεινόμενη αναλυτική μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για χαρτογράφηση και ποσοτικοποίηση των κύριων συστατικών του saffron και είναι ένα ιδανικό αναλυτικό εργαλείο για τον έλεγχο ποιότητας των δειγμάτων του saffron καθώς και για την χαρτογράφηση άλλων ενδημικών taxa του γένους Crocus. / Crocus sativus L., a stemless perennial herb of the Iridaceae family, is cultivated in many areas of the Mediterranean region and South Asia (mainly in Iran, India, Greece, Morocco, Italy and Spain) for its red stigmas (style branches, commonly known as saffron) that are used for culinary purposes (spice, food colorant, and in alcoholic and non-alcoholic beverages) and are important ingredients in Mediterranean, Indian and Chinese diet. From ancient times saffron has been also used as a drug to treat various human health conditions. The worldwide saffron production is facing challenging tasks mainly due to the need for quality control and prevention of adulteration, which is especially important for human health. Chemical analysis of Crocus sativus L. styles has shown the presence of unusually polar carotenoids (crocins) that are mono-, di-, and triglycosydic esters of crocetin, a polyene dicarboxylic acid. Crocins (cis and trans glycosyl esters of crocetin) are the colouring components of saffron. The monoterpene aldehydes picrocrocin and its deglycosylated derivative, safranal formed in saffron during drying and storage by hydrolysis of the picrocrocin, are also important components of saffron, responsible of its bitter flavour and aroma, respectively. Saffron extract or its active constituents, crocetin and crocins, could be useful as a treatment for neurodegenative disorders accompanying memory impairment and it is a protective agent against chromosomal damage, a modulator of lipid peroxidation, and an antioxidant and detoxifying spice. Anticeptive and anti-inflammatory, as well as antiseizure, or reducing blood pressure effects have also been reported in animals. The aforementioned beneficial properties of Crocus sativus has made imperative the development of analytical methodologies for monitoring the quality control and batch adulteration, which is especially essential for human health. The goal of the research work was the development of a liquid chromatography diode array detector (HPLC-DAD) method for the quantification of bioactive substances (crocins and picrocrocin) from saffron samples. A simple, sensitive and specific high performance liquid chromatography (HPLC) has been developed in order to quantify simultaneously six major biologically active ingredients of Crocus sativus L. (saffron) namely trans-crocin-4, trans-crocin-3, trans-crocin-2, cis-crocin-4, cis-crocin-3 and picrocrocin. In addition, other extracts of styles of other Crocus taxa, endemic in Greece were analyzed and characterized using the aforementioned developed methodology. The developed analytical methodology included three main stages: 1. Pretreament of styles of Crocus sativus L. prior to analysis. 2. Construction of calibration curves with the method of internal standard (IS). 3.Method Validation) and particularly estimation of linearity, precision, accuracy and Limits Of Detection/Quantitation, LOD/LOQ). The above chromatographic method demonstrated a high separation capability, high sensitivity, precision, accuracy and short analysis time (less than 30 min), compared to previously published methods. The proposed method could be used for monitoring and quantification of the major saffron components. It is an ideal analytical tool for quality control of saffron batches as well as the screening of styles of other Crocus taxa.