京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(農学) / 乙第12847号 / 論農博第2799号 / 新制||農||1027(附属図書館) / 学位論文||H26||N4864(農学部図書室) / 31430 / (主査)教授 宮川 恒, 教授 西田 律夫, 教授 植田 和光 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

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結核病是目前全球傳染病中死亡率最高的疾病，由於抗藥菌株的產生以及與愛滋病的共同感染而使得結核病的控制面臨更嚴厲的挑戰。目前，結核病的預防主要是施打卡介苗，卡介苗是世界上使用最廣泛的疫苗之一，其優點是沒有施打時間的限制、便宜、副作用小、穩定性高。卡介苗目前仍然是採用培養後統計可培養之菌落數來判定疫苗之效價。但由於卡介苗菌的生長十分緩慢，培養時間有時甚至長達二個月，製程監控不易達到效果。本研究的目的即是利用同步定量聚合酶連鎖反應技術檢測BCG 16S ribosomal RNA及IS6110基因，並分別比較檢測BCG菌之DNA及RNA檢體的敏感度及專一性，以建立一個快速、靈敏度高且專一性高的BCG效價檢測方法。在研究中已成功建立檢測之標準曲線，並能在8天培養後檢測出BCG菌的生長，可以有效率的減少BCG疫苗菌數的檢測時間。因此，期望未來能夠將此技術應用做為BCG疫苗生產製程中管控的工具，以取代曠日費時的傳統檢測方式，並期望將來可以將此檢測系統應用於結核病之臨床檢測。 / Tuberculosis is one of the important infectious diseases with the highest mortality rate worldwide. The control of tuberculosis infection is facing an even more strict challenge because of the evolving of drug-resistant clones and the co-infection of AIDS. Currently, the prevention of tuberculosis is mainly done by BCG vaccination, which is one of the most widely used vaccines. The advantages of BCG vaccine are its low cost, low side effects, and high stability. At present, the BCG potency is analyzed by calculating the growth of colonies after culture. However, the growth of BCG is pretty slow, sometimes it can take as long as two months and has made the in process control very difficult. The aim of this study was to establish a rapid, sensitive, and specific real-time quantitative PCR (Q-PCR) method for the detection of BCG potency and separately compares BCG DNA and RNA samples for BCG 16S ribosomal RNA and IS6110 genes for Q-PCR detection system. We have successfully set up the standard curves for the detection of BCG using Q-PCR, and the method could detect the growth of BCG after 8 day of cultivation. Using Q-PCR system, the detection of BCG vaccine is more efficient and the detection time can be largely reduced. We hope we will be able to apply this method as a tool for the in process control during the BCG vaccine production and to replace the time-consuming traditional culture method. / 目錄 誌謝 ------------------------------------------------------------------------ i 中文摘要 ------------------------------------------------------------------------ ii 英文摘要 ------------------------------------------------------------------------ iii 目錄 ------------------------------------------------------------------------ iv 表目錄 ------------------------------------------------------------------------ vi 圖目錄 ------------------------------------------------------------------------ viii 第一章 緒論------------------------------------------------------------------ 1 第二章 文獻回顧------------------------------------------------------------ 4 第一節 結核病 (Tuberculosis)-------------------------------------------- 4 第二節 分歧桿菌 (Mycobacteria)---------------------------------------- 6 第三節 卡介苗 (Bacille Calmette-Guérin vaccine ; BCG vaccine) 的發展--------------------------------------------------------------- 8 第四節 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction；PCR) 及其應用------------------------------------------------------------------ 9 第五節 同步定量聚合酶連鎖反應 (Real-time quantitative polymerase chain reaction; 定量PCR)------------------------- 10 第三章 材料與方法--------------------------------------------------------- 13 一 BCG菌製備與培養----------------------------------------------- 13 二 定量PCR的primer與probe設計----------------------------- 13 三 定量PCR的primer與probe最適化-------------------------- 14 四 BCG DNA檢體萃取---------------------------------------------- 14 五 BCG RNA萃取與反轉錄---------------------------------------- 15 六 定量PCR反應條件----------------------------------------------- 16 七 傳統PCR反應條件----------------------------------------------- 16 八 洋菜膠體 (agarose gel) 電泳分析----------------------------- 16 九 BCG定量標準曲線製作與製圖-------------------------------- 17 第四章 結果與討論--------------------------------------------------------- 18 一 定量PCR primer 與 probe的設計----------------------------- 18 二 16S rRNA及IS6110 定量PCR中primers與 probes 之最適化--------------------------------------------------------------- 19 三 建立BCG疫苗之定量PCR檢測標準曲線------------------- 20 四 以16S rRNA primer進行BCG疫苗培養分析--------------- 22 五 以定量PCR檢測BCG疫苗菌株之最佳檢測濃度--------- 23 六 依16S rRNA及IS6110定量PCR建立BCG疫苗效價之檢測------------------------------------------------------------------ 25 第五章 結論與建議--------------------------------------------------------- 27 參考文獻 ------------------------------------------------------------------------ 30 附錄一 16S ribosomal RNA 基因序列---------------------------------- 81 附錄二 IS6110基因序列--------------------------------------------------- 83 表目錄 表一 臨床中重要的分歧桿菌------------------------------------------ 37 表二 分歧桿菌之致病力------------------------------------------------ 38 表三 Primer Express軟體設計之16S rRNA及IS6110 primers與probes------------------------------------------------------------ 39 表四 定量PCR primer與probe最適化測試濃度組合------------ 40 表五 反轉錄反應藥品配方--------------------------------------------- 41 表六 定量PCR試劑配方------------------------------------------------ 42 表七 定量PCR反應條件------------------------------------------------ 43 表八 傳統PCR試劑配方------------------------------------------------ 44 表九 16S rRNA定量PCR之primer與probe最適化結果------- 45 表十 IS6110定量PCR之primer與probe最適化結果------------- 46 表十一 以16S rRNA及IS6110定量PCR檢測DNA檢體結果---- 47 表十二 以16S rRNA及IS6110定量PCR檢測RNA檢體結果---- 48 表十三 16S rRNA及IS6110定量PCR標準曲線之有效檢測範團及靈敏度比較------------------------------------------------------ 49 表十四 16S rRNA定量PCR檢測BCG疫苗在不同培養條件下之生長情形------------------------------------------------------------ 50 表十五 以16S rRNA定量PCR檢測BCG疫苗之最佳檢測濃度--- 51 表十六 以IS6110定量PCR檢測BCG疫苗之最佳檢測濃度-------- 52 表十七 16S rRNA定量PCR檢測BCG疫苗之效價------------------ 53 表十八 IS6110定量PCR檢測BCG疫苗之效價---------------------- 55 圖目錄 圖一 TaqMan Probe之定量PCR的作用原理反應流程--------- 57 圖二 ABI 7700 Sequence Detection System之同步偵測光學路徑原理--------------------------------------------------------------- 58 圖三 定量PCR偵測螢光後之Threshold cycle圖---------------- 59 圖四 PCR過程及定量PCR偵測原理------------------------------- 60 圖五 Primer Express軟體中，設計primer與probe的 Preferences操作界面---------------------------------------------- 61 圖六 以傳統PCR測試16S rRNA primer之PCR產物agarose gel電泳分析-------------------------------------------------------- 62 圖七 以傳統PCR測試IS6110 primer之PCR產物agarose gel電泳分析------------------------------------------------------------ 63 圖八 16S rRNA定量PCR primer與probe 最適化結果----------- 64 圖九 IS6110定量PCR primer與probe 最適化結果--------------- 65 圖十 16S rRNA定量PCR primer與probe最適化結果產物agarose gel 電泳分析--------------------------------------------- 66 圖十一 16S rRNA定量PCR以DNA建立檢測標準曲線之結果--- 67 圖十二 16S rRNA定量PCR以DNA檢體所建立之標準曲線----- 68 圖十三 16S rRNA定量PCR以RNA檢體建立標準曲線之結果-- 69 圖十四 16S rRNA 定量PCR以RNA檢體所建立之標準曲線---- 70 圖十五 IS6110定量PCR以DNA檢體建立標準曲線之結果------ 71 圖十六 IS6110 定量PCR以DNA檢體所建立之標準--------------- 72 圖十七 IS6110定量PCR以RNA檢體建立標準曲線之結果------ 73 圖十八 IS6110定量PCR於RNA檢體所建立之標準曲線---------- 74 圖十九 以16S rRNA 定量PCR檢測BCG疫苗DNA檢體之生長------------------------------------------------------------------------ 75 圖二十 以16S rRNA 定量PCR檢測BCG疫苗RNA檢體之生長------------------------------------------------------------------------ 76 圖二十一 建立16S rRNA 定量PCR之BCG菌最佳檢測濃度-------- 77 圖二十二 建立IS6110定量PCR之BCG菌最佳檢測濃度------------ 78 圖二十三 以16S rRNA定量PCR檢測BCG疫苗效價----------------- 79 圖二十四 以IS6110定量PCR檢測BCG疫苗效價---------------------- 80

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(文学) / 甲第22189号 / 文博第836号 / 新制||文||691(附属図書館) / 京都大学大学院文学研究科歴史文化学専攻 / (主査)教授 髙嶋 航, 教授 中砂 明徳, 准教授 村上 衛 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Letters / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第12969号 / 論医博第2102号 / 新制||医||1012(附属図書館) / 32407 / 新制||医||1012 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 山田 泰広, 教授 福田 和彦, 教授 伊達 洋至 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18140号 / 医博第3860号 / 新制||医||1002(附属図書館) / 30998 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 富樫 かおり, 教授 伊達 洋至, 教授 武藤 学 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

本次研究使用全民健康保險研究資料庫2005承保抽樣歸人檔(LHID2005)，共40萬人的承保資料，針對肺癌患者的特徵進行分析，並與美國國家癌症研究所的肺癌資料作比較，罹患肺癌的人數都呈現男性多於女性，罹癌年齡的最高峰同樣落在65歲至74歲。 接著，將門診處方及治療明細檔和住院醫療費用清單明細檔進行彙整，整理出肺癌患者在2005年至2012年之間的門診費用以及住院費用，並比較不同項目的差距及特徵，門診費用以用藥明細點數最高，住院花費前五名的項目為葯費、病房費、放射線診療費、檢查費以及治療處置費。 最後，建構肺癌治療的多重型態模型，治療方式包含手術治療、放射線治療、化學治療，估計不同狀態之間的轉換力，進而算出五年定期躉繳肺癌保單之純保費。 / This study used Longitudinal Health Insurance Database 2005 (LHID2005) from Taiwan’s National Health Insurance Research Database (NHIRD). Screening the 400,000 insured of NHIRD to select the lung and bronchus cancer patients. This study analyzed and described their characteristics. Furthermore, it compared Taiwan’s lung and bronchus cancer data with the data in the United States derived from National Cancer Institute of the USA. The results revealed that the number of male patients is more than female patients and lung cancer is most frequently diagnosed among people aged 65-74 in both countries. Another aim was to sum up the lung cancer medical cost in 2005 to 2012 from NHIRD database, including ambulatory care expenditures by visits and inpatient expenditures by admissions. The highest cost of outpatients was medicine fee. The top five inpatient expenditures were medicine fee, ward fee, radiation therapy fee, inspection fee and therapeutic treatment fee. Finally, this study constructed a multiple state model of lung cancer treatment, including surgery, radiotherapy, chemotherapy. Estimating the transition intensities from multiple state model to calculate the pure premium of a five-year lung cancer policy.

Small intestine neuroendocrine tumors (SI-NETs) and lung carcinoids (LCs) are relatively indolent tumors, which originate from neuroendocrine (NE) cells of the diffuse NE system. Metastases can spread before diagnosis. Thus, potential cures become unavailable, which entitles new biomarker development. Indeed, we aimed at developing Ma2 autoantibodies and olfactory receptor 51E1 (OR51E1) as potential novel biomarkers and exploring other candidate protein markers in patients’ serum. First, we established a sensitive, specific and reliable anti-Ma2 indirect ELISA to distinguish SI-NET patients from healthy controls. We detected longer progression-free and recurrence-free survivals in patients expressing low anti-Ma2 titers. Moreover, a high anti-Ma2 titer was more sensitive than chromogranin A for the risk of recurrence after radical operation of SI-NET patients. We then investigated OR51E1 expression in SI-NETs and LCs. OR51E1 mRNA expression, analyzed by quantitative real-time PCR, was high in microdissected SI-NET cells, in LC cell lines and in frozen LC specimens. Immunohistochemistry (IHC) showed abundant OR51E1 protein expression in SI-NETs. OR51E1 co-expressed with vesicular-monoamine-transporter-1 in the majority of normal and neoplastic enterochromaffin cells. Furthermore, the study on LCs revealed that OR51E1, somatostatin receptor (SSTR) 2, SSTR3, and SSTR5 are expressed in 85%, 71%, 25% and 39% of typical carcinoids (TCs), whereas in 86%, 79%, 43% and 36% of atypical carcinoids (ACs). Based on the proposed IHC scoring system, in the LC cases, where all SSTR subtypes were absent, membrane OR51E1 expression was detected in 10 out of 17 TCs and 1 out of 2 ACs. Moreover, higher OR51E1 scores were detected in 5 out of 6 OctreoScan-negative LC lesions. In addition, the last presented study used a novel suspension bead array, which targeted 124 unique proteins, by using Human Protein Atlas antibodies, to profile biotinylated serum samples from SI-NET patients and healthy controls. We showed 9 proteins, IGFBP2, IGF1, SHKBP1, ETS1, IL1α, STX2, MAML3, EGR3 and XIAP as significant contributors to tumor classification. In conclusion, we proposed Ma2 autoantibodies as a sensitive circulating marker for SI-NET recurrence; OR51E1 as a candidate therapeutic target for SI-NETs; whereas as a novel diagnostic marker for LCs and 9 serum proteins as novel potential SI-NET markers. / 小肠神经内分泌肿瘤(SI-NET)和肺类癌(LC)是起源于不同神经内分泌细胞的生长缓慢的肿瘤。肿瘤往往于诊断前已经转移。这导致目前缺乏有效的治疗方法，同时也使得对于新的生物标记物的研发变得有意义。因此，我们在本论文中分别研究了Ma2自身抗体(抗Ma2)，以及潜在的新型生物标记物嗅觉受体51E1(OR51E1)。我们还探讨了患者血清中的其他候选蛋白标记物。 首先，我们建立了一个灵敏特异而可靠的抗Ma2间接酶联免疫吸附试验，用以区分SI-NET患者组和健康对照组。在表达低滴度抗Ma2的患者中，我们检测到了较长的病情无恶化存活率以及肿瘤无复发存活率。此外，高滴度抗Ma2比嗜铬粒蛋白A更为灵敏地检测到了SI-NET患者根治手术后复发的风险。     接下来，我们研究了SI-NET和LC患者肿瘤中的OR51E1受体蛋白的表达。我们用实时定量PCR技术检测到了OR51E1信使核糖核酸在显微切除的SI-NET肿瘤细胞中，以及在LC细胞系和冷冻LC标本中的高度表达。免疫组化结果显示出OR51E1蛋白在SI-NET肿瘤组织中的高度表达。OR51E1与囊泡单胺转运蛋白1在大多数正常和肿瘤的肠嗜铬细胞中可共表达。 另外，我们针对LC患者的研究显示，OR51E1受体蛋白以及促生长素抑制素受体(SSTR)2，SSTR3和SSTR5分别在85％，71％，25％和39％的典型性肺类癌(TC)，以及86％，79％，43％和36的非典型性肺类癌(AC)中表达。基于我们我提出的免疫组化结果得分系统，在无SSTR表达的LC中，OR51E1蛋白在17个TC中的10个以及2个AC中的1个中呈细胞膜表达。而且，在6个OctreoScan显象呈阴性的LC中，有5个OR51E1免疫组化得分很高。     此外，在本论文最后的一项研究中，我们采用了一种新型的悬浮磁珠阵列技术，通过使用来自于人类蛋白质图谱项目的针对124种独特蛋白质的抗体，对SI-NET患者和健康对照组的用生物素标记过的血清样本进行了分析。结果显示，通过利用9种蛋白，即IGFBP2，IGF1，SHKBP1，ETS1，STX2，IL1α，MAML3，EGR3和XIAP，我们可以显著的对肿瘤进行分类。     综上所述，我们提出Ma2自身抗体可作为一个体液中灵敏的生物标记物用以暗示SI-NET肿瘤的复发; OR51E1受体蛋白可作为一个在SI-NET治疗中所能用及的候选生物靶分子，并在LC中作为一种新型的潜在生物标记物。此外，我们在SI-NET患者血清中检测到了9种新的候选标记物蛋白。