Der 3D-Druck ist ein elementarer Bestandteil der Biofabrikation. Beispielsweise wird mittels Biotinten und einem geeigneten 3D-Druckverfahren Schicht für Schicht eine Geometrie aufgebaut. Durch die Gestaltung von mikrofluidischen Druckköpfen wird eine Möglichkeit geschaffen multiple Materialansätze im Druckkopf zu vermischen und so in einem bestimmten Mischungsverhältnis zu drucken. Mit dem DLP-SLA-Drucker Vida HD Crown and Bridge (EnvisionTEC) und dem Harz E-Shell 600 (EnvisionTEC) wurden zunächst die Auflösungsgrenzen des Druckers ermittelt sowie Komponenten für die Realisierung eines mikrofluidischen Druckkopfes prozessiert. Bei den Komponenten handelt es sich zum einen um Geometrien, die beispielsweise als Mischeinheit im Kanal dienen können und des Weiteren um senkrechte Kanäle die Biotinten führen können, sowie um Kanäle, die als Zuläufe für den Hauptkanal des mikrofluidischen Druckkopfs dienen können. Die Eigenschaften und die technische Realisierbarkeit der gedruckten Objekte wurden eruiert. Dabei wurden die jeweiligen Geometrien und Kanalöffnungen vermessen, große Aspektverhältnisse der Geometrien untersucht und die Durchgängigkeit der Kanäle geprüft. Zukünftig können die prozessierten Komponenten für einen mikrofluidischen Druckkopf variabel kombiniert werden und auf dieser Basis weiterführende Experimente stattfinden. / 3D printing is an essential part of biofabrication. For example, geometries are built up layer by layer using bio-inks and a suitable 3D printing process. New options are given by the fabrication of a microfluidic print head. The design of microfluidic print heads creates the possibility of mixing multiple materials inside the print head and thus start printing certain mixing ratios. The resolution limits of the DLP-SLA printer Vida HD Crown and Bridge (EnvisionTEC) using the resin E-Shell 600 (EnvisionTEC) were first determined and components for the layout of a microfluidic print head were processed. The components are, on one hand, geometries that can serve as a mixing device inside the channel, and on the other hand, vertical channels that can carry bio-inks and channels that serve as inlets for the main channel of the microfluidic print head. The properties of the printed objects were examined, the respective geometries and channel openings were measured, large aspect ratios of the geometries were examined and the consistency of the channels investigated. In future, the processed components for a microfluidic print head can be combined variably and further experiments can take place on this basis.

Osteochondral defects comprise cartilage and bone tissue in the joint region and create challenges for orthopedic surgery, also because intrinsic regeneration capacities of the articular cartilage are limited. Furthermore, tissue layer-specific characteristics regarding cell types, mechanical properties and biochemical composition need to be considered. Research questions: In this work, concepts were developed which allow mimicking of osteochondral interfacial layers in a patient-individual and zonally specified manner by 3D extrusion (bio)printing. This feature of patient specificity was proven on different levels within this project: Besides the option for application of patient-own, expanded stem cells or chondrocytes within a scaffold to support regeneration and neo-tissue formation, a workflow was implemented which enables the consideration of magnetic resonance imaging (MRI) data and zonal geometry of the defect. With the materials suitable to achieve this design and a bioprinting-compatible process, the impact of such a system on embedded cells was investigated. A zonally structured, partly mineralized construct was evaluated regarding its capability to allow or support chondrogenesis of primary human chondrocytes (hChon). Furthermore, a strategy based on core-shell bioprinting technology was developed which allows simultaneous embedding of different cell types in a zonally defined distribution with a targeted effect by incorporated growth factors while reducing the off-target effects that would be expected when applied homogeneously via the surrounding medium. In addition, hybrid multi-material scaffolds were developed to adjust the stiffness of these systems. Materials and methods: To define design and patient-specific requirements for an osteochondral implant, an anonymized MRI dataset of a patient with osteochondritis dissecans (OCD) was used. The main constituent of the developed fabrication system was a bioink based on 3% alginate and 9% methylcellulose (algMC) with hChon. Laponite was added to alg-MC-based inks in order to control the release of differentiation factors for a sustained delivery in multi-zonal osteochondral constructs. A printable calcium phosphate cement (CPC) was used as a mineral phase. For the bioprinting process, multi-channel extrusion was applied for an alternating printing of hChon-laden algMC and CPC in order to mimic a zone of mineralized cartilage. Cell fate was investigated on biochemical and gene expression level. A coaxial extrusion module was applied for the co-extrusion of a bioink (shell) – algMC or plasma-functionalized algMC loaded with hChon or human pre-osteoblasts (hOB), respectively – and a biomaterial ink (core) doped with the corresponding growth factors TGF-β3 or BMP-2 as central target-specific factor depot. By melt electrowriting technology (MEW), additional scaffolds from polycaprolactone (PCL) microfibers with a freely adjustable fiber structure were generated. To trigger the mechanical stiffness of cell-laden hydrogels, these scaffolds were manually added to the bioprinting process as an extra support. Results: Suggested strategies of 3D extrusion (bio)printing for clinically relevant dimensions (Publication I)were successfully applied on algMC-based inks, bioinks and CPC to generate multi-material cell-laden constructs of an individual, patient-specific shape. With the use of flexible and reversible software solutions, MRI data from an OCD patient were utilized for the design and later fabrication of a bi-zonal implant (Publication II). The resulting implant showed a suitable geometry fitting into a model of the lesioned femoral condyles fabricated by stereolithography. For surgical fixation of such a potential implant, an individual implantation adapter was developed. The same materials processable via multi-channel printing were compatible with bioprinting of hChon isolated from the femoral head of human hip arthroplasty patients. The majority of cells survived the printing process and cultivation conditions in monophasic scaffolds consisting of cell-laden algMC, and in biphasic scaffolds with a zonally separated or interwoven mineral zone of calcium phosphate cement. Cells in both setups, representing plain articular cartilage and calcified cartilage, were able to re-differentiate and demonstrated the characteristic ECM marker production and gene expression. The calcium-deficient CPC led to a decrease of calcium ions and an initial increase of phosphate ions in the surrounding medium. In the presence of the CPC phase, chondrogenesis was enhanced (Publication III). The core-shell bioprinting concept allowed the spatially defined differentiation of cells (hChon or hOB), encapsulated in a bioink extruded as shell compartment, adjacent to a respective factor-loaded core depot with specific differentiation factors. The biomaterial inks for the core depot were successfully adjusted regarding viscosity and release kinetics by addition of nanoclay (Laponite) nanoparticles. Optical coherence tomography (OCT) was introduced as a tool to monitor the coaxial strand pattern and the location of embedded cells in a contactless manner. The applied inks allowed adjustment of release properties of components such as growth factors BMP-2 and TGF-β3. In hChon, characteristic genes such as collagen 2 or aggrecan were upregulated, while hOB were able to express the typical genes ALP, BGLAP and IBSP. Although both incorporated differentiation factors also demonstrated enhancing effects on both compartments, respectively, the induced adverse effects of hypertrophy in the cartilage zone and collagen 2 expression in the bone zone were successfully prevented. This was done by applying the factors with a sustained release via a Laponite-supported ink as the core depots, instead of homogeneously supplementing the surrounding cell culture medium (Publication IV). By adding PCL microfiber mesh scaffolds, fabricated by MEW, with a decreasing fiber density from 1000 to 250 µm, the Young’s modulus of the algMC scaffolds increased from 10 kPa to more than 50 kPa. The resulting hybrid scaffolds were proven cytocompatible; bioprinted hChon reacted to this hybrid algMC structure with a PCL density of 750 µm with an improved release of sulphated glycosaminoglycans (Publication V). Conclusions: A fully integrated approach for a multiphasic implant design, embedding of primary cells and simultaneous application of respective growth factors was realized by 3D extrusion (bio)printing. Concepts for bioprinting of mineralized cartilage based on algMC and CPC and for local factor delivery in osteochondral tissue substitutes by core-shell bioprinting were developed. The presented approaches allow an adjustable zonal design and full control over spatial differentiation and fate of bioprinted cells. The versatility of this modular system allows addition of further features as demonstrated for the combination with PCL microfiber scaffolds to adjust mechanical properties of the cartilage zone. Another option can be the mechanical stimulation of magnetically deformable algMC-magnetite scaffolds. These valuable insights for the field will serve as basis for further applications in vitro and in vivo. They might open up new research directions with a potential translation to other material combinations and other tissue defect types.:Table of Contents List of abbreviations List of figures Legal note 1. Introduction 1.1 The osteochondral interface – function, anatomy and histology 1.2 Pathology of cartilage and osteochondral tissue 1.3 State of the art: treatment of cartilage defects and osteochondral defects 1.4 Tissue engineering for osteochondral regeneration 1.5 Biomedical additive manufacturing and bioprinting 1.6 Hydrogels for bioprinting 1.7 Multi-component and multiphasic strategies to add specific cues and features to bioprinted tissue models 1.8 Additive Manufacturing of patient-specific bone and cartilage substitutes 2. Aims of the thesis List of publications included in the thesis 3. Strategies for biofabrication of volumetric constructs with an individual shape (Publication I) Publication I: Review article 4. Workflow for an MRI-guided, bi-zonal implant design (Publication II) 41 Publication II: Article Publication II: Published supporting information 5. Chondrogenesis in 3D bioprinted constructs and its compatibility with a mineral phase (Publication III) Publication III: Article Publication III: Published supporting information 6. Concept for a zonally defined factor delivery (Publication IV) Publication IV: Article Publication IV: Published supporting information 7. Hybrid bioscaffolds for tailoring mechanical properties of cartilage tissue substitutes (Publication V) Publication V: Article 8. Discussion and outlook References SUMMARY ZUSAMMENFASSUNG Acknowledgements List of other publications (co-)authored by the candidate Scientific congress contributions during PhD phase Journal ranking in Journal Citations Report Appendix I – Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Appendix 2 – Erklärung zur Einhaltung gesetzlicher Bestimmungen / Osteochondrale Defekte umfassen Knochen- und Knorpelgewebe innerhalb des betroffenen Gelenks und stellen die klinische Orthopädie vor Herausforderungen dar, auch da die intrinsische Regenerationsfähigkeit des Gelenkknorpels stark limitiert ist. Zudem sind in den zu unterscheidenden Gewebeschichten spezifische Charakteristika wie unterschiedliche Zelltypen, mechanische Eigenschaften und die biochemische Zusammensetzung zu berücksichtigen. Fragestellungen: In der vorliegenden Arbeit wurden Konzepte entwickelt, mit dem sich per 3D-Extrusions(bio)druck Gewebeschichten dieser osteochondralen Grenzschicht zonenspezifisch und patientenindividuell nachbilden lassen. Diese patientenindividuellen Merkmale wurden innerhalb des Projektes auf mehreren Ebenen nachgewiesen: Zum einen können patienteneigene Stammzellen oder Chondrozyten nach Vermehrung im Labor innerhalb einer Gerüststruktur (“Scaffold”) zur Unterstützung der Regeneration und Gewebeneubildung angewandt werden. Zum anderen wurde ein Workflow vorgestellt, der die Berücksichtigung einer individuellen, per Magnetresonanztomographie (MRT) detektierten, schichtweisen Geometrie einer Läsion erlaubt. Mit Hilfe von Materialien, die diese Formgebung ermöglichen, wurde in einem Biodruck-kompatiblen Prozess der Einfluss eines solchen Systems auf eingebettete Zellen untersucht: Ein zonal aufgebautes, teilweise mineralisiertes Konstrukt wurde hinsichtlich dessen Eignung, Chondrogenese humaner Knorpelzellen (hChon) zu ermöglichen oder zu unterstützen, evaluiert. Zudem wurde eine auf der Kern-Mantel-Biodrucktechnologie basierende Strategie entwickelt, die das Einbetten unterschiedlicher Zelltypen mit zonal definierter Verteilung kombiniert mit einem gezielten Effekt durch inkorporierte Wachstumsfaktoren. Hierbei sollten unerwünschte Nebeneffekte der im Kern dargebrachten Faktoren auf die jeweils andere Zellsorte, die man bei homogener Faktorengabe über das umgebende Medium erwarten würde, reduziert werden. Weiterhin sollte mittels hybrider Multi-Material-Scaffolds die Steifigkeit des Systems angepasst werden. Material und Methoden: Um ein Design und patientenindividuelle Anforderungen für ein osteochondrales Implantat zu definieren, wurde ein anonymisierter MRT-Datensatz eines Osteochondrosis dissecans(OCD)-Patienten genutzt. Hauptbestandteil des entwickelten Fabrikationssystems war eine Biotinte aus 3% Alginat und 9% Methylcellulose (algMC) mit hChon. Laponit wurde zu den auf algMC basierenden Tinten hinzugefügt, um die Freisetzung von Differenzierungsfaktoren zu kontrollieren und damit eine verzögerte Gabe in mehrschichtigen osteochondralen Konstrukten zu ermöglichen. Ein druckbarer Kalziumphosphatzement (CPC) wurde als Mineralphase genutzt. Im Biodruckprozess wurde der Mehrkanaldruck angewandt, um durch alternierende Extrusion von hChon-beladenem algMC und CPC die mineralisierte Knorpelschicht nachzubilden. Die Zellentwicklung wurde auf biochemischer Ebene und hinsichtlich der exprimierten Gene untersucht. Ein koaxiales Extrusionsmodul wurde zur Ko-Extrusion einer Biotinte (Mantel), bestehend aus algMC beladen mit hChon oder Plasma-funktionalisierter algMC beladen mit humanen Prä-Osteoblasten (hOB), und einer korrespondierenden faktorenbeladenen Biomaterialtinte (Kern) genutzt. Dieses zielspezifische Faktorendepot enthielt jeweils TGF-β3 oder BMP-2. Durch die Technik des Melt Electrowritings (MEW) wurden zusätzliche Scaffolds aus Polycaprolacton(PCL)-Mikrofasern mit einer justierbaren Faserstruktur generiert. Um die Steifigkeit von zellbeladenen Hydrogelen anzupassen, wurden diese Scaffolds als mechanischer Support manuell während des Biodruckprozesses eingebracht. Ergebnisse: Die zugrundeliegenden Strategien des 3D-Extrusions(bio)drucks in klinisch relevanten Dimensionen (Publikation I) wurden an algMC-basierten Tinten, Biotinten und CPC erfolgreich angewandt, um zellbeladene Konstrukte patientenindividueller Form aus mehreren Materialien zu generieren. Durch den Einsatz flexibler und reversibler Software-Lösungen, wurden MRT-Daten eines Patienten mit einem osteochondralen Defekt verwendet, um ein zweischichtiges Implantatdesign zu entwerfen und zu fertigen (Publikation II). Dieses Implantat wies eine adäquate Passgenauigkeit in einem Modell der Läsion in den Femurkondylen, hergestellt per Stereolithografie, auf. Zur chirurgischen Fixierung eines solchen potenziellen Implantats wurde ein individueller Adapter für einen chirurgischen Stößel entwickelt. Das gleiche Materialsystem, prozessierbar mittels Mehrkanaldrucks, erwies sich als kompatibel zum Biodruck von hChon, isoliert aus dem Femurkopf von Hüft-Totalendoprothese-Patienten. Die meisten der Zellen überlebten den Druckprozess und die Kultivierungsbedingungen in monophasigen Scaffolds bestehend aus zellbeladener algMC-Biotinte, sowie in biphasigen Scaffolds mit einer in einer getrennten Schicht verlaufenden oder verwobenen mineralisierten Zone aus CPC. Zellen waren in beiden Ansätzen, als monophasiger oberflächlichen Gelenkknorpel, sowie als kalzifizierte Knorpelschicht, in der Lage, sich zu redifferenzieren; sie zeigten die Expression charakteristischer Matrix-Komponenten und -Gene. Der Kalzium-defizitäre CPC führte zu einer Verminderung der Kalziumionenkonzentration und zu einem initialen Anstieg der Phosphationen im umgebenden Medium. In Gegenwart der CPC-Phase war die Chondrogenese verstärkt (Publikation III). Das Konzept des Kern-Mantel-Biodrucks ermöglichte die örtlich aufgelöste Differenzierung von Zellen (hChon oder hOB), eingebettet in eine Biotinte extrudiert als Mantel-Kompartment, in unmittelbarer Nähe zu einem entsprechenden Faktor-beladenen Depot mit spezifischen Differenzierungsfaktoren. Die Biomaterialtinten für das Kern-Depot wurden durch die Zugabe von Nanoclay(Laponit)-Nanopartikeln hinsichtlich Viskosität und Freisetzungskinetik erfolgreich angepasst. Optische Kohärenztomographie (OCT) wurde als eine zerstörungsfreie Methode zur Beobachtung des koaxialen Strangmusters und der Zellverteilung eingeführt. Die genutzten Tinten erlaubten die Adaption der Freisetzungskurven unterschiedlicher Moleküle wie der Wachstumsfaktoren BMP-2 und TGF-β3. In hChon war die Expression charakteristischer Gene wie Kollagen 2 oder Aggrecan verstärkt, während hOB die für die osteogene Differenzierung typischen Markergene ALP, BGLAP und IBSP exprimierten. Obwohl beide inkorporierten Faktoren auch verstärkende Effekte auf jeweils beide Kompartimente zeigten, konnte der induzierte unerwünschte Effekt der Hypertrophie innerhalb der Knorpelzone sowie die unerwünschte Kollagen Typ 2-Expression innerhalb der Knochenzone erfolgreich verhindert werden. Dies geschah, indem die Faktoren statt homogen über das umgebende Zellkulturmedium mittels Laponit-Tinte und daher freisetzungsverzögernd über die Kern-Depots dargereicht wurden (Publikation IV). Mittels der PCL-Mikrofaser-Gitter-Scaffolds, hergestellt per MEW, mit enger werdenden Fasernetzdichten von 1000 bis 250 µm konnte der E-Modul der algMC-Scaffolds von 10 kPa auf über 50 kPa erhöht werden. Die Zytokompatibilität der hybriden Scaffolds wurden nachgewiesen; auf die Struktur in hybriden algMC-Scaffolds mit einer PCL-Faserdiche von 750 µm reagierten biogedruckte hChon mit einer erhöhten Freisetzung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (Publikation V). Schlussfolgerungen: Ein integrierter Ansatz für ein mehrphasiges Implantatdesign, das Einbetten von primären Zellen und die gleichzeitige Anwendung der entsprechenden Wachstumsfaktoren wurde mittels 3D-Extrusions(bio)druck realisiert. Konzepte zum Biodruck von mineralisiertem Knorpel basierend auf algMC und CPC und zur lokalen Faktorengabe in osteochondralen Gewebeersatzstrukturen per Kern-Mantel-Druck wurden entwickelt. Die vorgestellten Ansätze erlauben ein vielseitig adaptierbares, zonales Design, die volle Kontrolle über die örtliche Differenzierung sowie die Reifung der biogedruckten Zellen. Die Vielseitigkeit des modularen Systems ermöglicht zudem das Hinzufügen weiterer Merkmale, was anhand des Einbringens von PCL-Mikrofaser-Scaffolds zur Justierung der mechanischen Eigenschaften der Knorpelzone demonstriert wurde. Eine weitere Option stellt die mechanische Stimulation magnetisch verformbarer algMC-Magnetit-Scaffolds dar. Die wertvollen Erkenntnisse werden als Basis für weitere Anwendungen in vitro sowie in vivo dienen können. All dies kann neue Möglichkeiten und Forschungsrichtungen eröffnen und ist in vielerlei Hinsicht übertragbar auf weitere Materialkombinationen, sowie verschiedene Defekt- und Gewebearten.:Table of Contents List of abbreviations List of figures Legal note 1. Introduction 1.1 The osteochondral interface – function, anatomy and histology 1.2 Pathology of cartilage and osteochondral tissue 1.3 State of the art: treatment of cartilage defects and osteochondral defects 1.4 Tissue engineering for osteochondral regeneration 1.5 Biomedical additive manufacturing and bioprinting 1.6 Hydrogels for bioprinting 1.7 Multi-component and multiphasic strategies to add specific cues and features to bioprinted tissue models 1.8 Additive Manufacturing of patient-specific bone and cartilage substitutes 2. Aims of the thesis List of publications included in the thesis 3. Strategies for biofabrication of volumetric constructs with an individual shape (Publication I) Publication I: Review article 4. Workflow for an MRI-guided, bi-zonal implant design (Publication II) 41 Publication II: Article Publication II: Published supporting information 5. Chondrogenesis in 3D bioprinted constructs and its compatibility with a mineral phase (Publication III) Publication III: Article Publication III: Published supporting information 6. Concept for a zonally defined factor delivery (Publication IV) Publication IV: Article Publication IV: Published supporting information 7. Hybrid bioscaffolds for tailoring mechanical properties of cartilage tissue substitutes (Publication V) Publication V: Article 8. Discussion and outlook References SUMMARY ZUSAMMENFASSUNG Acknowledgements List of other publications (co-)authored by the candidate Scientific congress contributions during PhD phase Journal ranking in Journal Citations Report Appendix I – Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Appendix 2 – Erklärung zur Einhaltung gesetzlicher Bestimmungen

Hintergrund: Die Anzahl von Knochenfrakturen im Zusammenhang mit Traumata, sowie osteoporosebedingten Fragilitätsfrakturen oder auch Knochendefekten in Folge von Tumorresektionen steigt stetig an. Die Nutzung autologen, aber auch allogenen und xenogenen Spendermaterials ist limitiert. Eine vielversprechende Alternative sind Knochenkonstrukte, die über einen Tissue Engineering-Ansatz hergestellt werden. Dabei werden resorbierbare Biomaterialien mit biologisch aktiven Substanzen wie Wachstumsfaktoren oder Zellen kombiniert. Diese funktionalisierten Konstrukte regen nach einer Implantation in den Patienten die gesunde Knochensubstanz zur Heilung an und resorbieren idealerweise zugunsten des nachwachsenden, natürlichen Knochens. Eine neuartige Form des Tissue Engineerings ist der 3D-Biodruck („Bioprinting“), bei dem biologisch aktive Proteine und/oder Zellen mit Biomaterialien vermischt werden und anschließend durch ein additives Fertigungsverfahren zu Konstrukten verarbeitet werden. Dies hat einige Vorteile: Z.B. die Fertigung eines patientenspezifischen Konstrukts, welches direkt an den Defekt angepasst ist, aber auch eine gute Einstellbarkeit der Porosität des finalen Konstrukts, was vorteilhaft für die Nährstoffversorgung und Vaskularisierung sein kann. Vor allem erlaubt es eine ortsaufgelöste Verteilung, wodurch beispielsweise Zellen in einem Konstrukt so positioniert werden können, dass diese zu einem gewebeähnlichen Knochenkonstrukt reifen können. Fragestellung: Im letzten Jahrzehnt wurden einige technologische Fragestellungen im Bereich des Bioprintings gelöst. Für das Knochen-Tissue Engineering sind bisher allerdings nur wenige Ansätze präsentiert wurden. Dies liegt unter anderem daran, dass im Bioprinting vor allem Hydrogele verarbeitet werden. Diese sind allerdings sowohl chemisch, als auch mechanisch weit von natürlichem Knochengewebe entfernt und daher weniger als Knochenersatz geeignet. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob (Bio-)printing eine für Knochen-Tissue Engineering-Strategien geeignete Methode ist. Dazu wurden zwei vielversprechende Ansätze verfolgt: (I) Mehrphasendruck von bioaktiven Calciumphosphatzementen in Kombination mit Zellen oder mit Wachstumsfaktoren funktionalisierten, biologisch aktiven Hydrogelen. (II) Entwicklung einer neuen Bioink, indem ein wachstumsfaktor- oder zellbeladenes Hydrogel mit einem bioaktiven Füllstoff geblendet wird. Die in der Doktorarbeit vorgestellten Studien sollen dabei insbesondere die Entwicklung dieser Ansätze darstellen, sowie deren Grenzen aufzeigen. Zusätzlich sollen grundlegende mechanische und biologische Eigenschaften der biogedruckten Knochenkonstrukte untersucht werden. Materialien und Methoden: Eine Technologie, die das Prinzip des Bioprintings ermöglicht, ist das sogenannte 3D-Plotten. Mit Hilfe eines Multikanal-Plotters können mehrphasige Konstrukte (Ansatz I), aber natürlich auch einphasige Konstrukte (Ansatz II) hergestellt werden. Für Ansatz I wurde ein klinisch zugelassener Calciumphosphatzement (CPC) als bioaktive Komponente verwendet. Für Ansatz II wurde ein bisher noch wenig erforschtes Nanomaterial namens Laponit verwendet, welches großes Potential für das Tissue Engineering besitzt. Die Biopoylmere Alginat und Methylcellulose bildeten die Grundlage für plottbare, wachstumsfaktor- und zellbeladene Pasten (Biomaterial-inks bzw. Bioinks). Zur Entwicklung einer spezifischen Bioink wurde humanes gefrorenes Frischplasma verwendet. Die rheologischen Eigenschaften neu entwickelter Biomaterial-inks und Bioinks, sowie die mechanischen Eigenschaften der geplotteten Hydrogele wurden charakterisiert. Weitere Untersuchungen schlossen die Quellung der Hydrogele und die Porosität der Konstrukte ein. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Formgenauigkeit der geplotteten Strukturen gelegt. Entsprechend der Untersuchungsansätze wurden verschiedene Zelltypen verwendet, insbesondere mesenchymale Stammzellen (MSC), die direkt mit der Paste verdruckt wurden. Als Modellwachstumsfaktor diente der angiogene vascular endothelial growth factor (VEGF). Dessen Freisetzung aus geplotteten Scaffolds wurde mittels ELISA überprüft; die biologische Aktivität wurde anhand des Wachstums von humanen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) untersucht. Ergebnisse: Zunächst wurde untersucht, ob Multikanal-Plotten geeignet ist, um CPC-Konstrukte patientenindividuell zu fertigen. Dies wurde mit Hilfe einer auflösbaren Methylcellulosepaste erreicht. Dieses Verfahren erlaubte die Herstellung von inneren Kavitäten, die mit anderen Herstellungsverfahren nicht möglich gewesen wären. Darüber hinaus konnte aus einem CT-Scan einer Hand ein Kahnbein extrahiert und virtuell modelliert werden, welches mit hoher Formgenauigkeit geplottet werden konnte. Es wurde gezeigt, dass dies auch auf biphasige Konstrukte aus CPC und einer Bioink anwendbar ist. Dies wurde durch die Entwicklung und Verarbeitung von Bioinks ermöglicht. Biogedruckte Zellen können in vitro und in vivo spezifische biologische Effekte bewirken. Dazu wurden innerhalb der Arbeit zwei Bioinks als plottbare Zellträgermaterialien entwickelt. Eine Bioink enthielt das Nanomaterial Laponit (Ansatz II), welches bereits in anderen Studien vorteilhafte Effekte für Knochen-Tissue Engineering-Ansätze gezeigt hat. Die neuentwickelte Laponit-haltige Bioink erlaubte die Fabrikation von Konstrukten mit hoher Formgenauigkeit. Darüber hinaus war die Zellviabilität, sowie die Zelldichteentwicklung erhöht im Vergleich zu einer Laponit-freien Kontrolle. Da Laponit eine heterogene Ladungsverteilung aufweist, wurde überprüft, inwieweit es ein geeignetes Freisetzungssystem für VEGF darstellt. Scaffolds, die aus einer VEGF-haltigen Paste hergestellt wurden, wiesen ein deutlich verändertes Freisetzungsprofil in Anwesenheit von Laponit auf, als Scaffolds ohne Laponit. So konnte eine initiale Freisetzung (Burstrelease) vermieden und gleichzeitig eine gleichmäßige Freisetzung beobachtet werden. VEGF war auch nach längerer Zeit im Scaffold noch biologisch aktiv. Die zweite Bioink wurde auf Basis gefrorenen, menschlichen Frischplasmas entwickelt. Blutplasma enthält Fibrinogen, das eine RGD-Sequenz für die Anheftung von MSC besitzt. Biogedruckte MSC, aber auch präosteoblastäre Zellen, zeigten eine hohe Neigung, sich in der Bioink aufzuspreizen, was für eingekapselte Zellen erschwert ist. Die plasmahaltige Bioink war dazu geeignet, zusammen mit CPC zu biphasigen Konstrukten (Ansatz I) verarbeitet zu werden. \par Dazu musste zunächst ein Postprozessierungsprotokoll für biphasige Konstrukte aus CPC und zellhaltigen Bioinks entwickelt werden. Aus vorherigen Studien ist bekannt, dass geplottete CPC-Konstrukte in wässrigen Lösungen Mikrorisse bilden, die die mechanischen Eigenschaften signifikant verschlechtern. Die Ausbildung der Mikrorisse kann durch eine Aushärtung in wasserdampfgesättigter Atmosphäre vermieden werden. In biphasigen Konstrukten mit Bioinks sollte diese Aushärtungsphase allerdings nur kurz sein, da eine lange Inkubation ohne wässrige Zellmedien zu einem Absterben der biogedruckten Zellen führen würde. Es konnte gezeigt werden, dass eine Inkubation für 20 min in wasserdampfgesättigter Atmosphäre ausreichend ist, um die Ausbildung von Mikrorissen im CPC zu vermeiden. Diese Zeitspanne konnte von den Zellen toleriert werden. In Kombination mit der plasmahaltigen Bioink wurde eine starke Proliferation und osteogene Reifung von biogedruckten präosteoblastären Vorläufern beobachtet. Schlussfolgerungen: In der vorliegenden Doktorarbeit wurde das Prinzip des extrusionsbasierten Biodrucks (3D-Plotten) verwendet, um biofunktionelle Konstrukte herzustellen. Dies erfolgte entweder durch die Beladung mit Wachstumsfaktoren oder mit Zellen vor der Fabrikation der Konstrukte. Bioaktive Materialien wurden entweder durch Multikanal-Plotten oder durch Supplementierung einer Bioink eingebracht. Beide Ansätze können prinzipiell sogar miteinander kombiniert werden. Die erzielten Ergebnisse belegen, dass Bioprinting eine geeignete Methode für das Knochen-Tissue Engineering darstellt. Patientenindividualisierte Konstrukte können mit dieser Technologie gefertigt werden. Auf diesen Ergebnissen aufbauend können weitere Untersuchungen in vivo die Wirksamkeit der vorgestellten Ansätze überprüfen und neue Therapieansätze für die Heilung von Knochendefekten entwickelt werden.:Abstract 9 Zusammenfassung 13 Index of Abbreviations 19 List of Figures 20 Preface 23 i generalis 1 introduction to the topic 29 1.1 Background 29 1.2 Terminology 29 1.3 Physiological Properties of Bone Tissue 31 1.3.1 Composition of Bone 31 1.3.2 Bone Cytology 33 1.3.3 Crosstalk 34 1.4 Bone Grafting 34 1.4.1 Biopolymers 35 1.4.2 Calcium Phosphates 38 1.4.3 Nanoclays 41 1.5 Additive Manufacturing in Medicine & Bioprinting 43 1.5.1 Additive Manufacturing in Tissue Engineering 43 1.5.2 Bioprinting Techniques 44 1.6 Bioinks & Biomaterial Inks 48 1.6.1 Rheology 48 1.6.2 Plottability & Shape Fidelity 49 1.6.3 Post-Processing 52 1.6.4 Biocompatiblity & Biodegradation 53 1.6.5 The Biofabrication Window 53 2 aim of the thesis 55 2.1 Preliminary Studies 55 2.2 Research Questions 57 ii specialis 3 A methylcellulose hydrogel as support for 3D plotting of complex shaped calcium phosphate scaffolds 61 4 Development of a clay based bioink for 3D cell printing for skeletal application 77 5 Bioprinting of mineralized constructs utilizing multichannel plotting of a self-setting calcium phosphate cement and a cell-laden bioink 97 6 A novel plasma-based bioink stimulates cell proliferation and differentiation in bioprinted, mineralized constructs 113 iii conclusio 7 Summary & Conclusion 133 7.1 Bioprinting of bone tissue constructs 133 7.2 Technological Improvements 134 7.3 Bioink Development 136 7.4 Limitations & Future Research Directions 138 Bibliography 140 Danke 155 Appendix Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 165 Erklärung über die Einhaltung gesetzlicher Bestimmungen 166 Auszug aus dem Journal Citation Report 166 Conferences 167 / Background: The number of trauma-related bone fractures, fragility fractures resulting from osteoporosis or bone defects after tumor resections is increasing. The usability of autologous, but also allogenous and xenogenous bone grafts is limited. Bone grafts being manufactured using a tissue engineering approach are a promising alternative. For this, resorbable biomaterials are combined with biological components such as cells and growth factors. These functionalized constructs stimulate the formation of novel bone tissue after implantation in the patient and resorb in favor of regrowing, native bone. A new form of tissue engineering is 3D bioprinting. Biologically active proteins and/or cells are mixed with biomaterials and get fabricated to constructs by a convenient additive manufacturing technology. This offers great advantages. For example, the patient-specific tissue engineered constructs can be manufactured fitting exactly to the respective defect. Further, it allows full control about the porosity of the final construct which is considered to be advantageous for nutrient supply and vascularization. Most crucial, it allows the spatial distribution of cells within the three-dimensional construct, which facilitate the maturation of the construct to the tissue-like graft. Research Questions: In the last decade some technological challenges in the field of bioprinting have been solved. Nevertheless, for bone tissue engineering only a small number of approaches had been developed. One of the reasons for this is that bioprinting technologies usually enable the processing of materials that are chemically and mechanically rather distant from the bone, particularly hydrogels. These materials are less suitable as bone substitutes. The aim of this work was to research new approaches of extrusion-based (bio-)printing for bone tissue engineering strategies. For this purpose two promising approaches were investigated: (I) Multichannel printing of bioactive calcium phosphate cements in combination with biologically active hydrogels which were loaded either with growth factors or cells. (II) Development of a new bioink by supplementation of growth factor- or cell-laden hydrogels with a bioactive filler material. The presented studies of this thesis demonstrate the feasibility of these approaches as well as their limits. In addition, fundamental mechanical and biological properties of the bioprinted bone constructs are investigated. Materials and Methods: A technology that makes the principle of bioprinting possible is the so-called 3D plotting. With the aid of a multichannel plotter, multiphasic constructs can be fabricated (approach I), but of course also monophasic constructs are possible (approach II). For approach I, a clinically certified calcium phosphate cement (CPC) was used as bioactive component. For approach II, a less investigated nanomaterial called Laponite was used which was shown before to hold great potential for tissue engineering applications. The biopolymers alginate and methylcellulose formed the basis for plottable, growth factor-laden (biomaterial inks) and cell-laden (bioinks) pastes. For the development of one specific bioink, human fresh frozen plasma was used. Rheological properties of the newly developed biomaterial inks and bioinks were characterized, additionally mechanical properties of plotted constructs were investigated. Further studies investigated the swelling of the hydrogels and the porosity of the constructs. Particular attention was payed to the shape fidelity of the plotted structures. Different cell types were used according to the aim of the subject of research; special attention was payed to the use of mesenchymal stem cells which were plotted directly in combination with the biomaterial, forming the bioink. The angiogenic vascular endothelial growth factor (VEGF) was used as model protein for release studies from bioprinted structures; its biological activity was investigated by proliferation studies of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Results Firstly, it was investigated whether multichannel plotting is a suitable technology for the fabrication of patient-specific CPC constructs. This was achieved by plotting of a fugitive methylcellulose support ink. This procedure allowed the manufacturing of inner cavities which would not have been possible with other scaffold fabrication methods. Moreover, it was possible to extract a scaphoid bone from a CT scan of a human hand which was modeled virtually and fabricated subsequently with high shape fidelity. Later it was demonstrated that this procedure can be adapted to biphasic constructs consisting of CPC and cell-laden hydrogels. This was achieved by developing and processing bioinks. Bioprinted cells can evoke biological effects in vitro and in vivo. For this purpose two bioinks were developed within this work acting as cell carrier materials. The first bioink contained the nano material Laponite (approach II) which has demonstrated positive effects for bone tissue engineering before. The novel Laponite-based bioink enabled the fabrication of constructs with high shape fidelity. Furthermore, cell viability and cell density were increased compared to a Laponite-free control. Since Laponite offers a heterogeneous charge distribution, it was investigated whether it is a suitable delivery system for VEGF. Scaffolds with Laponite demonstrated a distinct different release profile compared to Laponite-free scaffolds. Thus an initial burst-like release could be avoided and at the same time a uniform release could be observed. The released VEGF was biologically active also after longer time in the scaffold. The second bioink was developed using fresh frozen human blood plasma. Plasma contains fibrinogen which holds a RGD motif for the attachment of MSC. Bioprinted MSC and preosteoblastic cells showed a high affinity to spread within the bioink, which is difficult to achieve for encapsulated cells. The plasma-based bioink was suitable for the combined fabrication of biphasic constructs with CPC (approach I). To achieve this, firstly a suitable post-processing for biphasic constructs consisting of CPC and cell-laden bioinks had to be developed. From previous studies it is known that plotted CPC constructs form microcracks in aqueous media during setting, which impair mechanical properties. The formation of the microcracks can be avoided by setting in water-saturated atmosphere. In biphasic constructs with bioinks this phase should only be short since a long incubation in absence of aqueous cell culture media would lead to cell death within the bioink. It could be shown that incubation for 20 min in water-saturated atmosphere is convenient to avoid the formation of microcracks in CPC strands. This time could be tolerated by the cells. In combination with the plasma-based bioink, a strong proliferation and osteogenic maturation of bioprinted preosteoblastic cells could be observed. Conclusion: In this thesis, the principle of extrusion-based bioprinting (3D plotting) was used to fabricate biofunctionalized constructs. This was achieved by loading cells or growth factors before manufacturing of the constructs. Bioactive materials could be embedded into the constructs by either multichannel plotting or by supplementation of a bioink with a bioactive filler material. In principle both approaches even could be combined with each other. The results obtained prove that bioprinting is a suitable method for bone tissue engineering. Patient-specific constructs can be fabricated by this technology. Based on these results, further studies should be performed in vivo to investigate the potency of the approaches for the development of new regenerative therapies to treat bone defects.:Abstract 9 Zusammenfassung 13 Index of Abbreviations 19 List of Figures 20 Preface 23 i generalis 1 introduction to the topic 29 1.1 Background 29 1.2 Terminology 29 1.3 Physiological Properties of Bone Tissue 31 1.3.1 Composition of Bone 31 1.3.2 Bone Cytology 33 1.3.3 Crosstalk 34 1.4 Bone Grafting 34 1.4.1 Biopolymers 35 1.4.2 Calcium Phosphates 38 1.4.3 Nanoclays 41 1.5 Additive Manufacturing in Medicine & Bioprinting 43 1.5.1 Additive Manufacturing in Tissue Engineering 43 1.5.2 Bioprinting Techniques 44 1.6 Bioinks & Biomaterial Inks 48 1.6.1 Rheology 48 1.6.2 Plottability & Shape Fidelity 49 1.6.3 Post-Processing 52 1.6.4 Biocompatiblity & Biodegradation 53 1.6.5 The Biofabrication Window 53 2 aim of the thesis 55 2.1 Preliminary Studies 55 2.2 Research Questions 57 ii specialis 3 A methylcellulose hydrogel as support for 3D plotting of complex shaped calcium phosphate scaffolds 61 4 Development of a clay based bioink for 3D cell printing for skeletal application 77 5 Bioprinting of mineralized constructs utilizing multichannel plotting of a self-setting calcium phosphate cement and a cell-laden bioink 97 6 A novel plasma-based bioink stimulates cell proliferation and differentiation in bioprinted, mineralized constructs 113 iii conclusio 7 Summary & Conclusion 133 7.1 Bioprinting of bone tissue constructs 133 7.2 Technological Improvements 134 7.3 Bioink Development 136 7.4 Limitations & Future Research Directions 138 Bibliography 140 Danke 155 Appendix Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 165 Erklärung über die Einhaltung gesetzlicher Bestimmungen 166 Auszug aus dem Journal Citation Report 166 Conferences 167

Background: Bioprinting is one of the most rapidly developing fields in medicine. Plastic and reconstructive surgery will be affected enormously by bioprinting, due to its original purpose of restoring injured or lost tissue. This article in particular has the purpose to analyze the current state of bioprinted tissues as well as research engagement for its application in plastic and reconstructive surgery. Material and methods: A systematic search for the time span between 2000 and 2022 was performed on EMBASE, Pub-Med, Scopus, and Web of Science databases according to the PRISMA Guidelines. Criteria for the selection of publications were in vitro, animal in vivo, and human in vivo studies where three-dimensional bioprinting of tissue was performed. We extracted data such as (a) author’s country of origin, (b) in vitro study, (c) animal in vivo study, and (d) human in vivo study and categorized the publications by topics such as (1) neural tissue, (2) vascularization, (3) skin, (4) cartilage, (5) bone, and (6) muscle. Additionally, recent discoveries of in vivo animal trials were summarized. - Results: Out of a pool of 1.629 articles, only 29 publications met our criteria. Of these publications, 97% were published by university institutions. Publications from China (28%, n=8), the USA (28%, n=8), and Germany (10%, n=3) led the publication list on 3D bioprinting. Concerning the publications, 45% (n=13) were in vitro studies, 52% (n=15) in vivo studies on animal models, and 3% (n=1) pilot clinical studies on humans as reported by Zhou et al. (EBioMedicine 28: 287–302, 2018). Regarding the classification of topics, our study revealed that publications were mainly in the field of 3D printing of cartilage (n=13, 39%), skin (n=7, 21%), bone (n=6, 18%), and vascularization (n=5, 15%). - Conclusions: To this date, it has not been yet possible to bioprint whole tissue systems. However, the progress in threedimensional bioprinting is rapid. There are still some challenges, which need to be overcome regarding cell survival before and during the printing process, continuation of architecture of bioprinted multilinear cells, and long-term stabilization and survival of complex tissues. Level of evidence: Not ratable.