Made available in DSpace on 2017-05-12T14:36:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MULTIFUNCIONAcrescentus.pdf: 2433174 bytes, checksum: e25ac7003e428ac0baf41c43a48f0e42 (MD5) Previous issue date: 2014-12-04 / The genetic manipulation of microorganisms has provided great advances in the production of enzymes involved in the bioconversion of biomass to fuels and chemicals. The main component of hemicellulose that compose the plant biomass is xylan, and its degradation dependent on the synergistic action of several enzymes, including xylanases and β-xylosidases stand as the major. The analysis of the genome of Caulobacter crescentus showed that this bacterium has at least eight genes encoding enzymes involved in the degradation of xylan, three coding for endo-xylanases and five β-xylosidases. In the present report, the enzymatic characterization of a C. crescentus β-glucosidase/β-xylosidase V was performed. For this purpose the xynB5 gene (CCNA 03149) was cloned into pJET1.2 /blunt and subcloned into the expression vector pTricHisA for producing a recombinant protein fused to an amino-terminal His-tag. The recombinant enzyme was induced with IPTG in E. coli (TOP10 strain) and the protein was purified using pre-packaged nickel-sepharose column. The characterization of the pure enzyme showed an optimum pH of 6 for both enzyme activity and a temperature optimum of 50 ° C to β-glucosidase and 60 ° C to β-xylosidase in the presence of NPG and NPX substrates, respectively, while also there has been a small activity in the presence of NPA. The multifunctional protein had its predominant enzyme activity to β-glucosidase (7.6 U ml-1) and a secundary β-xylosidase activity (4.3 U ml-1). In addition to greater specificity for NPG (Km = 0.24  0.008 mM) compared to that obtained for NPX (Km = 0.64  0.032 mM) although the Vmáx for both substrates was not statistically significant difference in optimal conditions of each enzyme (NPG = 0.041  0.001 M min-1 and NPX = 0.055  0.002 M min-1). In fact, data to enzymatic characterization corroborated the suggested in genomic annotation to C. crescentus. These multifunctional characteristics of the protein are important for biotechnological applications like the future reuse of agroindustrial residues / A manipulação genética de microrganismos tem propiciado grandes avanços para a produção de enzimas que possam auxiliar na bioconversão da biomassa vegetal a combustíveis e químicos. O principal componente da hemicelulose que compõem a biomassa vegetal é o xilano, e sua degradação depende da ação sinérgica de várias enzimas, das quais Xilanases e β-Xilosidases destacam-se como as principais. A análise do genoma de Caulobacter crescentus revelou que esta bactéria apresenta pelo menos oito genes envolvidos com a degradação do xilano, três deles codificam para endo-Xilanases, e cinco codificam para β-Xilosidases. O presente trabalho objetivou a caracterização enzimática de uma destas enzimas, a β-Glicosidase/β-Xilosidase de C. crescentus. Para isto o gene xynB5 (CCNA 03149) foi clonado em pJET1.2/blunt e subclonado no vetor de expressão pTricHisA para a produção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidinas amino-terminal. A enzima recombinante foi induzida com IPTG na cepa TOP10 de E. coli e a proteína foi purificada com o auxílio de colunas pré-empacotadas de níquel-sepharose. A caracterização da enzima pura mostrou um pH ótimo igual a 6 para ambas as atividades enzimáticas e uma temperatura ótima de 50 C para -Glicosidase e 60 C para -Xilosidase, na presença dos substratos NPG e NPX, respectivamente, embora também tenha ocorrido uma pequena atividade na presença de NPA. A proteína multifuncional teve sua atividade enzimática preponderante para -Glicosidase (7,6 U mL-1) em relação a atividade de -Xilosidase (4,3 U mL-1). Além de maior especificidade para NPG (Km = 0,24  0,008 mM) em relação à obtida para NPX (Km = 0,64  0,032 mM) embora a Vmáx para ambos substratos não tenham apresentado diferença significativa nas condições ótimas de cada enzima (NPG = 0,041  0,001 M min-1 e NPX = 0,055  0,002 M min-1). Os dados de caracterização confirmaram os sugeridos na anotação genômica para C. crescentus. Estas características multifuncionais da proteína são importantes para futuras aplicações biotecnológicas como o reaproveitamento dos resíduos agroindustriais.

Made available in DSpace on 2017-07-10T13:59:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MULTIFUNCIONAcrescentus.pdf: 2433174 bytes, checksum: e25ac7003e428ac0baf41c43a48f0e42 (MD5) Previous issue date: 2014-12-04 / The genetic manipulation of microorganisms has provided great advances in the production of enzymes involved in the bioconversion of biomass to fuels and chemicals. The main component of hemicellulose that compose the plant biomass is xylan, and its degradation dependent on the synergistic action of several enzymes, including xylanases and β-xylosidases stand as the major. The analysis of the genome of Caulobacter crescentus showed that this bacterium has at least eight genes encoding enzymes involved in the degradation of xylan, three coding for endo-xylanases and five β-xylosidases. In the present report, the enzymatic characterization of a C. crescentus β-glucosidase/β-xylosidase V was performed. For this purpose the xynB5 gene (CCNA 03149) was cloned into pJET1.2 /blunt and subcloned into the expression vector pTricHisA for producing a recombinant protein fused to an amino-terminal His-tag. The recombinant enzyme was induced with IPTG in E. coli (TOP10 strain) and the protein was purified using pre-packaged nickel-sepharose column. The characterization of the pure enzyme showed an optimum pH of 6 for both enzyme activity and a temperature optimum of 50 ° C to β-glucosidase and 60 ° C to β-xylosidase in the presence of NPG and NPX substrates, respectively, while also there has been a small activity in the presence of NPA. The multifunctional protein had its predominant enzyme activity to β-glucosidase (7.6 U ml-1) and a secundary β-xylosidase activity (4.3 U ml-1). In addition to greater specificity for NPG (Km = 0.24  0.008 mM) compared to that obtained for NPX (Km = 0.64  0.032 mM) although the Vmáx for both substrates was not statistically significant difference in optimal conditions of each enzyme (NPG = 0.041  0.001 M min-1 and NPX = 0.055  0.002 M min-1). In fact, data to enzymatic characterization corroborated the suggested in genomic annotation to C. crescentus. These multifunctional characteristics of the protein are important for biotechnological applications like the future reuse of agroindustrial residues / A manipulação genética de microrganismos tem propiciado grandes avanços para a produção de enzimas que possam auxiliar na bioconversão da biomassa vegetal a combustíveis e químicos. O principal componente da hemicelulose que compõem a biomassa vegetal é o xilano, e sua degradação depende da ação sinérgica de várias enzimas, das quais Xilanases e β-Xilosidases destacam-se como as principais. A análise do genoma de Caulobacter crescentus revelou que esta bactéria apresenta pelo menos oito genes envolvidos com a degradação do xilano, três deles codificam para endo-Xilanases, e cinco codificam para β-Xilosidases. O presente trabalho objetivou a caracterização enzimática de uma destas enzimas, a β-Glicosidase/β-Xilosidase de C. crescentus. Para isto o gene xynB5 (CCNA 03149) foi clonado em pJET1.2/blunt e subclonado no vetor de expressão pTricHisA para a produção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidinas amino-terminal. A enzima recombinante foi induzida com IPTG na cepa TOP10 de E. coli e a proteína foi purificada com o auxílio de colunas pré-empacotadas de níquel-sepharose. A caracterização da enzima pura mostrou um pH ótimo igual a 6 para ambas as atividades enzimáticas e uma temperatura ótima de 50 C para -Glicosidase e 60 C para -Xilosidase, na presença dos substratos NPG e NPX, respectivamente, embora também tenha ocorrido uma pequena atividade na presença de NPA. A proteína multifuncional teve sua atividade enzimática preponderante para -Glicosidase (7,6 U mL-1) em relação a atividade de -Xilosidase (4,3 U mL-1). Além de maior especificidade para NPG (Km = 0,24  0,008 mM) em relação à obtida para NPX (Km = 0,64  0,032 mM) embora a Vmáx para ambos substratos não tenham apresentado diferença significativa nas condições ótimas de cada enzima (NPG = 0,041  0,001 M min-1 e NPX = 0,055  0,002 M min-1). Os dados de caracterização confirmaram os sugeridos na anotação genômica para C. crescentus. Estas características multifuncionais da proteína são importantes para futuras aplicações biotecnológicas como o reaproveitamento dos resíduos agroindustriais.