Caulobacter crescentus é uma bactéria gram-negativa que dá origem a duas células filhas a cada divisão celular, a célula móvel e a célula talo, que se distinguem por sua morfologia, programa de desenvolvimento e capacidade de replicação do DNA. O gene alkB de C. crescentus foi identificado num clone que contém os genes de choque térmico dnaK e dnaJ (Gomes et al, 1990). Em E. coli, o gene alkB mostrou estar envolvido, juntamente com os genes alkA e ada, no reparo de lesões do DNA causadas por agentes alquilantes (Teo et al, 1986). O gene alkB de E coli forma um operon com o gene ada, sendo que o gene ada precede o gene alkB. A expressão de ambos os genes é induzida por doses não letais de agentes alquilantes, a nível de transcrição. A seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência de nucleotídeos do gene alkB de Caulobacter crescentus mostrou uma identidade de 42,5 % com a proteína AlkB de E. coli (Kondo et al, 1986). Ao contrário do que ocorre em E.coli, este gene não faz parte de um operon com o gene ada e sua expressão não é induzida por agentes alquilantes. Através do ensaio de proteção à nuclease S1 foi demonstrada a existência de um único início de transcrição para este gene. Para medir o nível de expressão do gene alkB foi construída a fusão de transcrição alkB-placZ/290, onde o vetor repórter de transcricão (placZ/290) (Gober & Shapiro, 1992) contendo o gene da (β-galactosidase sem o seu promotor foi ligado ao fragmento Sall/Stul (0,3 kb) que contém apenas a região promotora do gene alkB. Observou-se que a transcrição do gene alkB é regulada durante o ciclo celular de Caulobacter crescentus, apresentando níveis máximos na célula talo. Verificou-se ainda, através do experimento de dupla sincronia, que a proteína AlkB de C. crescentus sintetizada na célula prédivisional é segregada tanto para a célula móvel como para a célula talo, não apresentando um padrão polar de expressão. A resposta adaptativa a agentes alquilantes foi demonstrada em C. crescentus pela detecção de um aumento na sobrevivência aos efeitos letais dos agentes alquilantes em células pré-tratadas com baixas doses destes agentes e pela identificação de uma proteína induzida por agentes alquilantes utilizando anticorpos monoclonais anti-Ada de E. coli. / Caulobacter crescentus is a gram-negative bacterium that yields two different progeny cells at each division cycle, the swarmer cell and the stalked cell, which differ in structure, developmental program and ability to replicate DNA. The alkB gene in Caulobacter crescentus was identified in a clone which contains also the heat shock genes dnaK and dnaJ (Gomes et al, 1990). In Escherichia coli the alkB gene has been shown to be involved, with alkA and ada, in the pathway for repair of DNA alkylation damage (Teo et al, 1986). The E. coli alkB gene forms an operon with the ada gene, being downstream of it. The addition of the alkylating agent MMS to E. coli cultures induces the expression of both ada and alkB, at the level of transcription. The aminoacid sequence deduced from the nucleotide sequence of the C. crescentus alkB gene has shown 42,5% identity with the AlkB protein of E. coli (Kondo et al, 1986). Contrary to what happens in E. coli, the alkB gene of Caulobacter cescentus does not form an operon with the ada gene and its expression is not induced by alkylating agents. S1 nuclease protection assays have shown the presence of a single start of transcription for the alkB gene. To investigate the expression of the alkB gene during the cell cycle of the bacterium, its regulatory region was fused to a promoterless lacZ gene present in the vector placZJ290 (Gober & Shapiro, 1992), and β-galactosidase activity and synthesis, directed by the alkB gene promoter, were determined. It was observed that expression of the alkB gene is cell cycle controlled in Caulobacter. The placZJ290 transcriptional fusion with alkB, expressed in predivisional cells did not display a polar pattern of segregation in Caulobacter crescentus. β-galactosidase synthesized in predivisional cell was partitioned in equal amounts to both cell types after cell division. An adaptive response to alkylation damage has been demonstrated in C. crescentus. The response was detected by the increased resistance to cell killing of pretreated cells with low doses of methylating agents, followed by exposure to higher doses of these agents, and by cross-reactivity of an inducible protein of 39 kDa with E. coli anti-Ada monoclonal antibodies.

Caulobacter crescentus é uma bactéria gram-negativa que dá origem a duas células filhas a cada divisão celular, a célula móvel e a célula talo, que se distinguem por sua morfologia, programa de desenvolvimento e capacidade de replicação do DNA. O gene alkB de C. crescentus foi identificado num clone que contém os genes de choque térmico dnaK e dnaJ (Gomes et al, 1990). Em E. coli, o gene alkB mostrou estar envolvido, juntamente com os genes alkA e ada, no reparo de lesões do DNA causadas por agentes alquilantes (Teo et al, 1986). O gene alkB de E coli forma um operon com o gene ada, sendo que o gene ada precede o gene alkB. A expressão de ambos os genes é induzida por doses não letais de agentes alquilantes, a nível de transcrição. A seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência de nucleotídeos do gene alkB de Caulobacter crescentus mostrou uma identidade de 42,5 % com a proteína AlkB de E. coli (Kondo et al, 1986). Ao contrário do que ocorre em E.coli, este gene não faz parte de um operon com o gene ada e sua expressão não é induzida por agentes alquilantes. Através do ensaio de proteção à nuclease S1 foi demonstrada a existência de um único início de transcrição para este gene. Para medir o nível de expressão do gene alkB foi construída a fusão de transcrição alkB-placZ/290, onde o vetor repórter de transcricão (placZ/290) (Gober & Shapiro, 1992) contendo o gene da (β-galactosidase sem o seu promotor foi ligado ao fragmento Sall/Stul (0,3 kb) que contém apenas a região promotora do gene alkB. Observou-se que a transcrição do gene alkB é regulada durante o ciclo celular de Caulobacter crescentus, apresentando níveis máximos na célula talo. Verificou-se ainda, através do experimento de dupla sincronia, que a proteína AlkB de C. crescentus sintetizada na célula prédivisional é segregada tanto para a célula móvel como para a célula talo, não apresentando um padrão polar de expressão. A resposta adaptativa a agentes alquilantes foi demonstrada em C. crescentus pela detecção de um aumento na sobrevivência aos efeitos letais dos agentes alquilantes em células pré-tratadas com baixas doses destes agentes e pela identificação de uma proteína induzida por agentes alquilantes utilizando anticorpos monoclonais anti-Ada de E. coli. / Caulobacter crescentus is a gram-negative bacterium that yields two different progeny cells at each division cycle, the swarmer cell and the stalked cell, which differ in structure, developmental program and ability to replicate DNA. The alkB gene in Caulobacter crescentus was identified in a clone which contains also the heat shock genes dnaK and dnaJ (Gomes et al, 1990). In Escherichia coli the alkB gene has been shown to be involved, with alkA and ada, in the pathway for repair of DNA alkylation damage (Teo et al, 1986). The E. coli alkB gene forms an operon with the ada gene, being downstream of it. The addition of the alkylating agent MMS to E. coli cultures induces the expression of both ada and alkB, at the level of transcription. The aminoacid sequence deduced from the nucleotide sequence of the C. crescentus alkB gene has shown 42,5% identity with the AlkB protein of E. coli (Kondo et al, 1986). Contrary to what happens in E. coli, the alkB gene of Caulobacter cescentus does not form an operon with the ada gene and its expression is not induced by alkylating agents. S1 nuclease protection assays have shown the presence of a single start of transcription for the alkB gene. To investigate the expression of the alkB gene during the cell cycle of the bacterium, its regulatory region was fused to a promoterless lacZ gene present in the vector placZJ290 (Gober & Shapiro, 1992), and β-galactosidase activity and synthesis, directed by the alkB gene promoter, were determined. It was observed that expression of the alkB gene is cell cycle controlled in Caulobacter. The placZJ290 transcriptional fusion with alkB, expressed in predivisional cells did not display a polar pattern of segregation in Caulobacter crescentus. β-galactosidase synthesized in predivisional cell was partitioned in equal amounts to both cell types after cell division. An adaptive response to alkylation damage has been demonstrated in C. crescentus. The response was detected by the increased resistance to cell killing of pretreated cells with low doses of methylating agents, followed by exposure to higher doses of these agents, and by cross-reactivity of an inducible protein of 39 kDa with E. coli anti-Ada monoclonal antibodies.

Reaction Diffusion Master Equation (RDME) framework, characterized by the discretization of the spatial domain, is one of the most widely used methods in the stochastic simulation of reaction-diffusion systems. Discretization sizes for RDME have to be appropriately chosen such that each discrete compartment is "well-stirred" and the computational cost is not too expensive. An efficient discretization size based on the reaction-diffusion dynamics of each species is derived in this dissertation. Usually, the species with larger diffusion rate yields a larger discretization size. Partitioning with an efficient discretization size for each species, a multiple grid discretization (MGD) method is proposed. MGD avoids unnecessary molecular jumping and achieves great simulation efficiency improvement. Moreover, reaction-diffusion systems with reaction dynamics modeled by highly nonlinear functions, show large simulation error when discretization sizes are too small in RDME systems. The switch-like Hill function reduces into a simple bimolecular mass reaction when the discretization size is smaller than a critical value in RDME framework. Convergent Hill function dynamics in RDME framework that maintains the switch behavior of Hill functions with fine discretization is proposed. Furthermore, the application of stochastic modeling and simulation techniques to the spatiotemporal regulatory network in Caulobacter crescentus is included. A stochastic model based on Turing pattern is exploited to demonstrate the bipolarization of a scaffold protein, PopZ, during Caulobacter cell cycle. In addition, the stochastic simulation of the spatiotemporal histidine kinase switch model captures the increased variability of cycle time in cells depleted of the divJ genes. / Ph. D.

Caulobacter crescentus é uma bactéria Gram-negativa de vida livre cujo ciclo celular depende de eventos de diferenciação celular. A célula pré-divisional assimétrica dá origem a duas células filhas morfológica e funcionalmente distintas: a célula-talo e a célula móvel. A expressão do operon groESL é regulada por choque térmico e durante o ciclo celular a temperaturas normais, sendo a transcrição máxima na célula pré-divisional, com níveis baixos na célula-talo. Numa linhagem superexpressando σ32, os níveis do mRNA e da proteína GroEL estão aumentados, indicando que a transcrição ocorre a partir de um promotor ativado por σ32. A região regulatória também apresenta uma sequência repetida invertida, CIRCE, em que mutações de ponto aumentam a transcrição apenas a temperaturas normais de crescimento, indicando o papel inibitório desse elemento. Fusões de transcrição groESL-/acZ com mutações em CIRCE deixam de apresentar regulação temporal, bem como a síntese de GroEL numa linhagem hrcA-, em que o gene codificando o provável repressor que se liga em CIRCE está interrompido. Estes resultados indicam que o sistem CIRCE/HrcA está envolvido com a regulação da expressão de groESL durante o ciclo celular. Tentativas de se construir uma linhagem com groEL interrompido não tiveram sucesso, indicando ser este um gene essencial em todas as temperaturas. Um mutante condicional de groESL foi construído por recombinação homóloga e, em condições restritivas, o crescimento é inibido, os níveis de DnaK aumentam e as células se tomam filamentosas, porém não foi observada lise celular. As proteínas essenciais que são dependentes de GroEL/GroES para atingirem sua conformação funcional ainda não foram determinadas. / Caulobacter crescentus is an aquatic free-living Gram-negative bacterium whose cell cycle depends on cell differentiation. The asymmetrical predivisional cell gives rise to two morphologically and functionally different daughter cells: the swarmer cell an the stalked cell. The expression of the groESL operon is induced by heat shock and is cell cycle controlled at normal temperatures, with maximal transcription in the predivisional cell and very low levels in the stalked cell. In this work, it was demonstrated that, in a strain overexpressing σ32, the levels of groESL transcripts and the synthesis of GroEL are increased, confirming that this factor is responsible for the transcriptional activation of the σ32 -like promoter of this operon, that also presents a inverted repeat called CIRCE in its regulatory region. groESL-lacZ transcription fusions with point mutations in CIRCE indicated a negative role of this cis-acting element only at normal growth temperatures, with a minor effect on heat shock induction. In addition, the expression of these fusions are no longer cell-cycle regulated, as well as GroEL synthesis in a strain which does not have the HrcA protein, the putative repressor that binds CIRCE, indicating that the CIRCE-HrcA system are involved in cell cycle regulation of groESL in C. crescentus. It was also shown that groEL is an essential gene at normal growth temperatures, since a strain with groEL disrupted is not viable. A conditional mutant was obtained by homologous recombination and in restrictive conditions growth is inhibited, DnaK levels are increased and the cells become filamentous, but no celllysis was observed. The proteins that require GroEL/GroES for proper folding have not been identified yet.

Com objetivo de elucidar se CspD em Caulobacter crescentus possui a mesma função que em E. coli de inibir a replicação do DNA, foi avaliado o efeito da superexpressão de CspD em C. crescentus, e constatamos que, diferentemente do observado em E. coli, não houve efeito deletério ao crescimento. Quando superexpressa em E. coli, CspD de C. crescentus não demonstrou efeito no crescimento da bactéria. Além disso, através da eletroforese bidimensional do mutante deletado de cspD, foi investigado se a proteína afeta o padrão de expressão de outras proteínas. Além da protease ClpP, enzimas envolvidas no metabolismo de purinas e aminoácidos estão entre as que demonstraram expressão diferencial na ausência do gene cspD. Os dados obtidos na eletroforese bidimensional foram validados por meio de qRT-PCR. Um ensaio da ligação de CspD com ácidos nucléicos foi realizado mas, não se observou ligação entre a proteína e o DNA ou RNA. Finalmente, foi possível concluir, por meio de ensaios de western blotting, que CspD sofre regulação pós traducional pela protease Lon. / In order to elucidate if CspD in Caulobacter crescentus has the same role as in E. coli, we analyzed the effect of overexpressing CspD in bacterial growth and concluded that opposite from what its observed in Escherichia coli, it didnt affect growth. Yet, when over expressed in E. coli, CspD did not show any effect on the bacterial growth. Through two-dimensional gel electrophoresis of the cspD null mutant, it was possible to investigate if the protein is affecting the expression pattern of the cell. Along with ClpP protease, enzymes that are involved in the purine and amino acid metabolism are among those that showed differential expression in the absence of cspD. The data obtained from the two-dimensional gel electrophoresis were validated through qRT-PCR. The binding of CspD to nucleic acids was investigated. However, no binding of the protein to the nucleic acids was observed. Finally through western blotting assays, it was possible to conclude that CspD is post- translationally regulated by the Lon protease.

Caulobacter crescentus sobrevive em baixas temperaturas e mostrou ser um organismo psicrotolerante e de alta resistência ao congelamento, característica resultante de múltiplos fatores. C. crescentus possui quatro genes codificantes para CSPs, sendo cspA e cspB induzidos em baixas temperaturas e cspB, cspC e cspD em fase estacionária. A ausência de cspA e cspB ou cspA e cspC confere grande deficiência de crescimento em baixas temperaturas. cspA e cspB não são autorregulados e são regulados pós-transcricionalmente via estabilização de seu mRNA e traducionalmente após o choque-frio. A expressão de cspB é influênciada por CspC a 30 graus e durante o choque-frio, e por CspC, SpdR e SpoT durante a fase estacionária. A ausência de CspC ou CspC e CspD compromete a adaptação à fase estacionária promovendo alterações morfológicas. Nenhuma das CSPs de C. crescentus é capaz de reverter o fenótipo de E. coli BX04 por expressão heteróloga, embora todas possuam atividade antiterminadora que, nestas proteínas, não depende dos mesmos aminoácidos que CspE de E. coli. / Characterization of Caulobacter crescentus cold response was performed. This bacterium showed to be psicrotolerant and have remarkable freezing resistance, which may be a result of multiple traits. C. crescentus has four CSP encoding genes, being cspA and cspB cold-induced and cspB, cspC and cspD stationary phase-induced. The absence of cspA and cspB or cspA and cspC led to growth deficiency under low temperature incubation. cspA and cspB are not self-regulated and are post-transcriptionally and translationally regulated during cold-shock. The cspB gene expression is affected by CspC at exponential growth phase and by CspC, SpdR and SpoT at stationary phase. The absence of CspC, or CspC and CspD, affects stationary phase fitness of this organism, also promoting morphological alterations. None of the C. crescentus CSPs were able to restore the phenotype of E. coli BX04 strain by heterologous expression. Although all of them have shown to be transcription antiterminators, this ability is not dependent on the same critical aminoacids displayed by CspE from E. coli.

Como é de suma importância a integridade da informação contida no DNA, este recebe proteção contra agentes danosos que podem prejudicar sua estrutura. Mesmo em caso de dano, a célula possui um grupo de proteínas que estão envolvidas na correção e mitigação destes danos. O primeiro grupo é um conjunto de proteínas envolvidas no reparo de DNA livre de erro. Caso estas proteínas não consigam minimizar os danos, outro conjunto de proteínas é expresso como uma alternativa ao reparo. Dentre estas, estão as DNA polimerases especializadas em usar uma fita de DNA danificada como molde para replicação. Este mecanismo possibilita à célula sobreviver aos danos potencialmente citotóxicos, às custas de mutagênese. Em bactérias, a reposta ao dano de DNA envolve um conjunto de proteínas que são expressas como parte da resposta SOS. Dentre elas estão enzimas envolvidas na síntese translesão (TLS). Diferentemente de Escherichia coli que possui três polimerases propensas a erro especializadas em TLS, Caulobacter crescentus possui um cassete mutagênico imuABC que está implicado na síntese de DNA usando como molde uma fita danificada. Neste trabalho, estudamos o mecanismo de TLS mediado por ImuABC nesta bactéria, e encontramos uma série de diferenças com o mecanismo de bypass realizado pela principal polimerase implicada em TLS em E. coli (Pol V). As proteínas ImuABC quando expressas em níveis máximos da resposta SOS não são capazes de aumentar as taxas de mutagênese espontânea. O produto do operon imuABC, diferentemente da Pol V, não necessita de RecA para realizar TLS. Apenas a expressão destas proteínas em um background sem o gene recA já é suficiente para que ocorra a mutagênese induzida por UVC. Ao estudar a mutagênese como resposta ao dano de DNA induzido por radiação UVC em níveis genômicos em C. crescentus, notamos que a maioria das mutações encontradas está presente em regiões que possuem pirimidinas adjacentes que sabidamente são extremamente reativas à radiação UVC, levando à formação de fotoprodutos. Nossos dados sugerem que existe uma região no cromossomo circular de C. crescentus que é preferencialmente mutada, e este acúmulo de mutações pode ser consequência do reparo que acontece próximo à origem replicativa, deixando as mutações acumuladas próximas à região de término da replicação. / As the integrity of information contained in DNA is of utmost importance, it receives protection against harmful agents that may harm its structure. Even in case of damage, the cell has a group of proteins that are involved in the correction and mitigation of these damages. The first group is a set of proteins involved in error-free DNA repair. If these proteins fail to minimize damage, another set of proteins is expressed as an alternative to repair. Among these are DNA polymerases that specialize in using a damaged DNA strand as a template for replication. This mechanism enables the cell to survive potentially cytotoxic damage at the expense of mutagenesis. In bacteria, the DNA damage response involves a set of proteins that are expressed as part of the SOS response. Among them are enzymes involved in translesion synthesis (TLS). Unlike Escherichia coli that has three TLS error-prone polymerases, Caulobacter crescentus bears the imuABC mutagenic cassette that is involved in DNA synthesis using a damaged template. In this work, we studied the mechanism of TLS mediated by ImuABC in this bacterium, and we found a number of differences relative to the characteristics of the principal polymerase involved in TLS in E. coli (Pol V). ImuABC proteins when expressed at maximum levels of the SOS response are not able to increase the rates of spontaneous mutagenesis. ImuABC, unlike Pol V, does not require RecA to perform TLS. The presence of these proteins in a background without the recA gene is sufficient for UVC-induced mutagenesis to occur. In studying mutagenesis as a response to DNA damage induced by UVC radiation at genomic levels in C. crescentus, we noted that most of the mutations found are present in regions that have adjacent pyrimidines, which are known to be extremely reactive to UVC radiation, leading to the formation of photoproducts. Our data suggest that there is a region on the circular chromosome of C. crescentus that is preferably mutated, and this accumulation of mutations may be a consequence of the repair occurring near the replicative origin, leaving the accumulated mutations close to the replication termination region.

Caulobacter crescentus sobrevive em baixas temperaturas e mostrou ser um organismo psicrotolerante e de alta resistência ao congelamento, característica resultante de múltiplos fatores. C. crescentus possui quatro genes codificantes para CSPs, sendo cspA e cspB induzidos em baixas temperaturas e cspB, cspC e cspD em fase estacionária. A ausência de cspA e cspB ou cspA e cspC confere grande deficiência de crescimento em baixas temperaturas. cspA e cspB não são autorregulados e são regulados pós-transcricionalmente via estabilização de seu mRNA e traducionalmente após o choque-frio. A expressão de cspB é influênciada por CspC a 30 graus e durante o choque-frio, e por CspC, SpdR e SpoT durante a fase estacionária. A ausência de CspC ou CspC e CspD compromete a adaptação à fase estacionária promovendo alterações morfológicas. Nenhuma das CSPs de C. crescentus é capaz de reverter o fenótipo de E. coli BX04 por expressão heteróloga, embora todas possuam atividade antiterminadora que, nestas proteínas, não depende dos mesmos aminoácidos que CspE de E. coli. / Characterization of Caulobacter crescentus cold response was performed. This bacterium showed to be psicrotolerant and have remarkable freezing resistance, which may be a result of multiple traits. C. crescentus has four CSP encoding genes, being cspA and cspB cold-induced and cspB, cspC and cspD stationary phase-induced. The absence of cspA and cspB or cspA and cspC led to growth deficiency under low temperature incubation. cspA and cspB are not self-regulated and are post-transcriptionally and translationally regulated during cold-shock. The cspB gene expression is affected by CspC at exponential growth phase and by CspC, SpdR and SpoT at stationary phase. The absence of CspC, or CspC and CspD, affects stationary phase fitness of this organism, also promoting morphological alterations. None of the C. crescentus CSPs were able to restore the phenotype of E. coli BX04 strain by heterologous expression. Although all of them have shown to be transcription antiterminators, this ability is not dependent on the same critical aminoacids displayed by CspE from E. coli.

Caulobacter crescentus é uma bactéria Gram-negativa de vida livre cujo ciclo celular depende de eventos de diferenciação celular. A célula pré-divisional assimétrica dá origem a duas células filhas morfológica e funcionalmente distintas: a célula-talo e a célula móvel. A expressão do operon groESL é regulada por choque térmico e durante o ciclo celular a temperaturas normais, sendo a transcrição máxima na célula pré-divisional, com níveis baixos na célula-talo. Numa linhagem superexpressando σ32, os níveis do mRNA e da proteína GroEL estão aumentados, indicando que a transcrição ocorre a partir de um promotor ativado por σ32. A região regulatória também apresenta uma sequência repetida invertida, CIRCE, em que mutações de ponto aumentam a transcrição apenas a temperaturas normais de crescimento, indicando o papel inibitório desse elemento. Fusões de transcrição groESL-/acZ com mutações em CIRCE deixam de apresentar regulação temporal, bem como a síntese de GroEL numa linhagem hrcA-, em que o gene codificando o provável repressor que se liga em CIRCE está interrompido. Estes resultados indicam que o sistem CIRCE/HrcA está envolvido com a regulação da expressão de groESL durante o ciclo celular. Tentativas de se construir uma linhagem com groEL interrompido não tiveram sucesso, indicando ser este um gene essencial em todas as temperaturas. Um mutante condicional de groESL foi construído por recombinação homóloga e, em condições restritivas, o crescimento é inibido, os níveis de DnaK aumentam e as células se tomam filamentosas, porém não foi observada lise celular. As proteínas essenciais que são dependentes de GroEL/GroES para atingirem sua conformação funcional ainda não foram determinadas. / Caulobacter crescentus is an aquatic free-living Gram-negative bacterium whose cell cycle depends on cell differentiation. The asymmetrical predivisional cell gives rise to two morphologically and functionally different daughter cells: the swarmer cell an the stalked cell. The expression of the groESL operon is induced by heat shock and is cell cycle controlled at normal temperatures, with maximal transcription in the predivisional cell and very low levels in the stalked cell. In this work, it was demonstrated that, in a strain overexpressing σ32, the levels of groESL transcripts and the synthesis of GroEL are increased, confirming that this factor is responsible for the transcriptional activation of the σ32 -like promoter of this operon, that also presents a inverted repeat called CIRCE in its regulatory region. groESL-lacZ transcription fusions with point mutations in CIRCE indicated a negative role of this cis-acting element only at normal growth temperatures, with a minor effect on heat shock induction. In addition, the expression of these fusions are no longer cell-cycle regulated, as well as GroEL synthesis in a strain which does not have the HrcA protein, the putative repressor that binds CIRCE, indicating that the CIRCE-HrcA system are involved in cell cycle regulation of groESL in C. crescentus. It was also shown that groEL is an essential gene at normal growth temperatures, since a strain with groEL disrupted is not viable. A conditional mutant was obtained by homologous recombination and in restrictive conditions growth is inhibited, DnaK levels are increased and the cells become filamentous, but no celllysis was observed. The proteins that require GroEL/GroES for proper folding have not been identified yet.

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