Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2012-10-24T10:38:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 267110.pdf: 954345 bytes, checksum: b3fa10b12edbe2bb18921b258b55a293 (MD5) / Materials prepared from biodegradable polymers can be an alternative for reducing the environmental problems provoked by petroleum derived polymers used to produce packages. Starches from different sources have been considered as a technically viable raw material for producing biodegradable films at low cost. Moreover, starches are from renewable sources, which allow applying environmental politics for controlling the carbon cycle. Starch based films dot not resist to the mechanical stress they are submitted when used in commercial packages, and have high water vapor permeability (WVP). Incorporation of nanoclay and cellulose fibers have been reported as a viable alternative for reinforcing these films. The objective of this work was to investigate the influence of the incorporation of nanoclay and cellulose fibers on the properties of starch bases films. The work was performed in two steps. In the first step, films were prepared with different formulations and different processes of nanoclays incorporation their mechanical properties and WVP were determined. In the second step, the addition of nanoclay and cellulose fibers was investigated. For that, starch films, starch-nanoclay films and starch-nanoclay-cellulose fibers composites-films were prepared. The starch-nanoclay composites-films showed WVP one-fold lower that the values found for starch films. These composites were seven-fold more rigid than starch films, but with the same tensile strength of starch films, indicating that the added nanoclay did not reinforce the starch films. On the other hand, the incorporation of fibers and nanoclay increased the films tensile strength in 8.5 times and their rigidity (Young modulus) in 14 times. The composites diffractograms indicated intercalation between the clay lamellas and the starch chains. The WVP of composites-films were lower than the values found for starch films, and increased with the air relative humidity. The results reported in this work indicate that the incorporation of nanoclay and fibers to starch films is a viable alternative for reinforcing mechanically these films, and for reducing their WVP.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2018-01-09T03:24:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348721.pdf: 1592957 bytes, checksum: 2e89503c3edbaaf11fd6f04b31a76351 (MD5) Previous issue date: 2017 / As lipases são um grupo de enzimas de grande importância para a indústria de alimentos. Dessa forma, a realização de estudos que visem aumento da atividade e da estabilidade da enzima se faz necessário. Modificações genéticas, imobilização, alterações de condições do meio e aplicação de tecnologias não-térmicas são algumas das alternativas utilizadas para aumentar a competitividade e usabilidade das enzimas como catalisadores na indústria. O uso de campos magnéticos tem se destacado nesse contexto por ser uma tecnologia de simples operação, baixo custo, baixa demanda energética e mínimo impacto ambiental. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do campo magnético na atividade das lipases CalB e NS-40116. Formulações líquidas das enzimas (soluções de proteína enzimática em água com vários aditivos, incluindo sais e estabilizadores), fornecidas pela Novozymes, foram submetidas a módulos com ímãs que produzem campo magnético de intensidades 0,7 e 1,34 T, e os valores foram comparados com ensaios sem a influência do campo magnético (controle). Foram testadas condições de campo estático e por recirculação. O efeito do campo não foi significativo para a NS-40116 em nenhum dos tratamentos no modo estático. Contudo, observou-se incremento de atividade de 22% na condição de recirculação no campo de 1,34 T. O campo magnético estático teve efeito positivo para a CalB, e este foi maior em campo de intensidade 0,7 T. Desta forma, foi fixada essa intensidade, e testados a influência do pH da solução na atividade da enzima tratada magneticamente, as temperaturas do meio (25, 45 e 65 °C) para as amostras submetidas ao campo, e o tempo de indução, de 2, 3 ou 4 h. A melhor condição de incremento de atividade (134%), foi para a lipase CalB, diluída em tampão pH 7 (1:5), a 65 °C, por 2 horas. Para investigar a influência do campo na estrutura da molécula, estudos de caracterização foram conduzidos pelas técnicas de potencial zeta, infravermelho e espectroscopia de fluorescência. Os resultados sugerem aumento da ação do campo pelo aumento das cargas superficiais na condição ótima de incremento de atividade. / Abstract : Lipases are a group of enzymes of great importance to food industry. Thus, an assay of studies aimed at increasing the activity and stability of the enzyme is necessary. Genetic modifications, immobilization, changing conditions of use and non-thermal technologies are some of the alternatives used to increase the competitiveness and usability of enzymes as catalysts in the industry. Magnetic fields is a simple operation technology, with low cost, low energy demand and minimal environmental impact. The aim of this work was to evaluate the effect of the magnetic field on the activity of CalB and NS-40116 lipases. Liquid enzyme formulations (enzyme solutions in water with various additives, including salts and stabilizers), supplied by Novozymes, were submitted to modules producing 0.7 and 1.34 T magnetic field intensities, and the values were compared with tests without the influence of the magnetic field. Static and recirculation field conditions were tested. The field effect was not significant for NS-40116 in any of the static-mode treatments. However, the activity increment of 22% was observed in the recirculation condition of 1.34 T. The static magnetic field had a positive effect for a CalB, and it was higher at 0.7 T. The intensity of 0,7 T was fixed, and the influence of the pH of the solution, medium temperatures (25, 45 and 65 ° C) and the induction time (2, 3 or 4 h) were tested. The best activity increase condition was 134% for a CalB lipase, diluted in pH 7 buffer (1: 5), 65 ° C, 2 hours. To investigate an influence of the field on the structure of the molecule, characterization studies were conducted in zeta potential, infrared and fluorescence spectroscopy techniques. The results suggest the increase of the field action by the increase of the surface loads in the optimum condition of the increase of the activity.

Made available in DSpace on 2012-09-06T01:12:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 588.pdf: 1026331 bytes, checksum: 3a20a39576117a20545015235297a27a (MD5) Previous issue date: 2003 / O agismo é considerado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) a principal causa de morte evitável em todo o mundo, estando associado com diversas doenças e, especialmente, com um aumento na incidência de aterosclerose prematura. Recentes trabalhos têm mostrado que a paraoxonase (PON), protege contra a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), que pode levar ao desenvolvimento da aterosclerose, e que alterações na atividade e concentração da enzima paraoxonase têm sido observadas em fumantes. Assim, o objetivo principal do presente estudo foi investigar uma possível interferência do agismo sobre a atividade da enzima paraoxonase. Para isso, foi analisado um grupo de 40 indivíduos (20 fumantes e 20 não fumantes) da cidade de Vassouras, Rio de Janeiro. A determinação da atividade paraoxonásica foi realizada a partir do método de Eckerson et al. (1983 a, 1983 b), modificado por Moraes (1997). A dosagem da enzima arilesterase foi feita a partir do método de Lorentz et al. (1979), modificado por Oliveira-Silva et al. (1998). Os dados obtidos nesta pesquisa indicam que o agismo pode influenciar a atividade da paraoxonase, aumentando ainda mais os riscos de desenvolvimento da aterosclerose e que o uso de anticoncepcional também pode exercer uma forte influência sobre a atividade da paraoxonase.

OLIVEIRA, H. P. Purificação, caracterização e atividade antifúngica da Mm-POX, uma peroxidase do látex de Marsdenia megalantha (GOYDER; MORILLO, 1994). 2013. 152 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2015-01-22T17:36:17Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_hpoliveira.pdf: 7775368 bytes, checksum: 04af7f6679b25787c9a736c130f5945a (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-25T20:21:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_hpoliveira.pdf: 7775368 bytes, checksum: 04af7f6679b25787c9a736c130f5945a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T20:21:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_hpoliveira.pdf: 7775368 bytes, checksum: 04af7f6679b25787c9a736c130f5945a (MD5) Previous issue date: 2013 / The peroxidases are present in all living organisms and constitute a group of multifunctional enzymes with several biotechnological applications. In this group, the class III plant peroxidases (POX) (EC 1.11.1.7) are enzymes well characterized, with involvement in lignification, suberization, auxin catabolism, wound healing and plant defense. These enzymes have been detected in different parts of the plant, including the latex. The aim of this work was the purification, characterization and antifungal activity evaluation of a peroxidase from Marsdenia megalantha latex, an endemic species of the Caatinga. The latex was collected from plant grown in Quixadá, Ceará, Brazil, diluted (1:2) in 0.05 M Tris-HCl containing 0.15 M NaCl, pH 8.0, and subjected to centrifugation and dialysis against water. The supernatant was applied to a DEAE-Cellulose matrix previously equilibrated with 0.05 M sodium acetate buffer, pH 5.2 and two protein fractions were obtained. Elution of the non retained proteins (FnRd) was achivied by the equilibrium buffer, whereas the bound proteins (FRd) were eluted with 0.2 M NaCl in the same buffer. FnRd was subjected to a chromatography on Superose 12 HR 10/30 column, yielding two protein fractions (S1 and S2). S1 was shown to be a pure protein with peroxidasic activity, apparent molecular mass of 60 kDa, pI 5.2 and identity with other POXs, being named of M. megalantha peroxidase (Mm-POX). Mm-POX follows the Michaelis-Menten kinetics, with high affinity for guaiacol and H2O2, elevated thermal stability (60 °C, 1 hour) and optimum pH around 6.0. The catalytic activity of Mm-POX was reduced in the presence of classic peroxidases inhibitors, including azide, DTT, EDTA and Na2S2O5 and also in high concentrations of Na+, Mn2+ and salicylic acid. On the other hand, Ca2+ and Mg2+, even at low concentrations, were able to enhance the enzymatic activity of Mm-POX. In addition, Mm-POX was able to inhibit the Fusarium oxysporum and F. solani conidia germination. This action is probably due to changes in the cell membrane as well as induction of oxidative stress. The results reveal that Mm-POX is a class III peroxidase, being the first enzyme isolated from M. megalantha species, with potential use in the control of plant disease caused by fungi, adding biotechnological value to this enzyme. / As peroxidases estão presentes em todos os organismos vivos e constituem um grupo de enzimas multifuncionais com diversas aplicações biotecnológicas. Nesse grupo, as peroxidases de plantas classe III (POX) (EC 1.11.1.7) são enzimas bem caracterizadas, com participação na lignificação, suberização, catabolismo de auxinas, cicatrização e defesa vegetal. Tais enzimas têm sido detectadas em diferentes partes do vegetal, inclusive no látex. Esse trabalho teve como objetivo a purificação, caracterização e avaliação da atividade antifúngica de uma peroxidase presente no látex de Marsdenia megalantha, uma espécie endêmica da Caatinga. O látex foi coletado de plantas nativas da região do Quixadá Ceará, Brasil, diluído (1:2) em Tris-HCl 0,05 M, contendo NaCl 0,15 M, pH 8,0 e submetido à centrifugação e diálise contra água. O sobrenadante foi aplicado em matriz de DEAE-Celulose, equlibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, resultando nas proteínas não retidas (FnRd) e nas proteínas retidas (FRd), essas últimas eluídas com a adição de NaCl 0,2 M no tampão inicial. A FnRd foi submetida à cromatografia em matriz de Superose 12 HR 10/30, originando duas frações proteicas (S1 e S2). S1 se mostrou como uma proteína pura, com atividade peroxidásica, massa molecular aparente de 60 kDa, pI de 5,2 e identidade com outras POXs, que foi denominado de peroxidase de M. megalantha (Mm-POX). Mm-POX obedece à cinética de Michaelis-Menten, apresenta alta afinidade pelo guaiacol e H2O2, estabilidade térmica elevada (60 ºC, 1 hora) e pH ótimo em torno de 6,0. A atividade catalítica da Mm-POX foi reduzida diante de inibidores clássicos de peroxidases, incluindo azida, DTT, EDTA e Na2S2O5 e de concentrações elevadas Na+, Mn2+ e ácido salicílico. Por outro lado, os íons Ca2+ e Mg2+, mesmo em baixas concentrações, foram capazes de potencializar a atividade enzimática da Mm-POX. Testada contra fungos, Mm-POX (0,2 µg/mL) foi capaz de inibir a germinação de conídios de Fusarium oxysporum e F. solani, ação que provavelmente decorre de alteração na membrana celular e indução de estresse oxidativo. Os dados em conjunto demonstram que a Mm-POX é uma peroxidase classe III, se constituindo na primeira proteína isolada de M. megalantha, com possibilidade de uso no controle de doenças vegetais ocasionadas por fungos, agregando valor biotecnológico a essa enzima.

LIMA, M. A. Recuperação e purificação de β-galactosidase de Kluyveromyces lactis utilizando cromatografia de modo misto. 2014. 98 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2015-02-25T17:47:52Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_malima.pdf: 1758126 bytes, checksum: 3eef5075013be8a9368e83cd463174fe (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2015-02-26T13:06:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_malima.pdf: 1758126 bytes, checksum: 3eef5075013be8a9368e83cd463174fe (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-26T13:06:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_malima.pdf: 1758126 bytes, checksum: 3eef5075013be8a9368e83cd463174fe (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / The most important lactases, as far as biotechnological interest is concerned, are those produced by Kluyveromyces yeasts, which are intracellular and currently obtained mostly by submerged-state fermentation. This technique, just as the mainstream biotechnological processes, involves a need for protein and peptide purification from a variety of sources. In this context, one of the most promising notable techniques that can be highlighted is Mixed Mode Chromatography, which allows simultaneous ionic and hydrophobic interactions between the adsorbent and the adsorbate. Thus, the aim of this work was to assess the feasibility of recovery and purification of a Kluyveromyces lactis β-galactosidase, produced via fermentation process, by employing Mixed Mode Chromatography. Unit operations, such as protein precipitation and dialysis were also performed in order to concentrate the enzyme of interest and eliminate cell debris and other interferences inherent in the fermentation medium, something that would result in a decrease in the process yield. The production showed satisfactory results, with mean values for total enzyme concentration of 0.45 mg/mL, enzymatic activity of 77 U/mL and specific activity of 167,9 U/mg. The Purification Factor obtained was 1.17. A precipitation step, followed by a dialysis process, was performed and the later chromatographic run carried out in fixed bed with this material yielded recovery values of 41.0 and 48.2% of total protein and activity, respectively. SDS-PAGE Electrophoresis confirmed the purification evolution throughout the unit operations employed, confirming the viability of the employment of the techniques used to obtain an enzyme of considerable degree of purity and possessing high-added value. / As mais importantes lactases, em termos de interesse biotecnológico, são aquelas produzidas por leveduras do gênero Kluyveromyces, que são intracelulares e, em sua maioria, são obtidas por fermentação em cultura submersa. Esta técnica, assim como a maioria dos processos biotecnológicos, envolve a necessidade de purificação de proteínas e peptídeos a partir de uma variedade de fontes. Neste contexto, uma das técnicas mais notavelmente promissoras é a cromatografia de modo misto, que permite interações iônicas e hidrofóbicas simultaneamente entre o adsorvente e o adsorbato. O objetivo do presente trabalho foi estudar a viabilidade da recuperação e purificação da enzima β-galactosidase, produzida por meio de processo fermentativo e utilizando o micro-organismo Kluyveromyces lactis, por técnica de cromatografia de modo misto. Operações unitárias de precipitação proteica e diálise foram também realizadas com o intuito de concentrar a enzima de interesse e eliminar detritos celulares e outros interferentes advindos do meio de fermentação, o que ocasionaria uma diminuição do rendimento do processo. A produção se apresentou satisfatória, com uma média de valores de concentração de enzimas totais de 0,45 mg/mL, atividade enzimática de 67 U/mL, atividade específica de 167,9 U/mg. O Fator de Purificação obtido foi de 1,17. Uma precipitação seguida de diálise foi realizada e a posterior corrida cromatográfica em leito fixo com esse material rendeu valores de recuperação de 41,0 e 48,2% de proteína total e atividade total, respectivamente. A análise de eletroforese SDS-PAGE confirmou a evolução do processo de purificação no decorrer das operações unitárias, atestando a viabilidade do emprego das técnicas utilizadas para obtenção de enzimas com considerável grau de pureza com alto valor comercial agregado.

OLIVEIRA, S. L. R. Otimização da produção de celulases de Melanoporia sp. por fermentação submersa. 2014. 112 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química ) – Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2015-03-13T13:31:23Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_slroliveira.pdf: 1958052 bytes, checksum: 02ee7a52a43cdd7b063e6a151dc5f82f (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2015-03-20T18:31:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_slroliveira.pdf: 1958052 bytes, checksum: 02ee7a52a43cdd7b063e6a151dc5f82f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-20T18:31:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_slroliveira.pdf: 1958052 bytes, checksum: 02ee7a52a43cdd7b063e6a151dc5f82f (MD5) Previous issue date: 2014-12-19 / Cellulases are enzyme complex composed of endoglucanases, exoglucanases and β-glucosidases with several biotechnological applications. However, their production cost is a major obstacle for its industrial application. About 40% of the total cellulase production cost is related to the culture medium used for the microorganism growth. In this context, efficient processes for cellulolytic enzyme production are of technical and economical interest. Thus, the present study aimed to optimize the production of cellulases by Melanoporia sp. using coconut shell powder as substrate in submerged fermentation. The influence of pH and temperature on the enzyme activity was evaluated by univariate experimental design. Then, the composition of the culture medium was sequentially optimized through Plaket -Burman followed by Central Composite experimental designs. The fermentation under optimized conditions was subsequently conducted in bioreactor to evaluate the influen ce of pH control and aeration on enzyme production. The stability of the enzyme was evaluated for 6 and 8 months at 4 °C and - 20 °C, respectively. The ability of the enzyme to hydrolyze coconut shell powder was evaluated at 65 °C and 80 °C using the crude enzyme extract produced by Melanoporia sp. The enzyme activity was determined by the quantification of reducing sugars using DNS method at pH 5.5 and 80 °C (optimum conditions). The composition of the culture medium which provided the highest enzyme yield was: 5 g/L of coconut shell; 15 g/L lactose; 3% tween 80; 1 g/L of KH2PO4 and 0.05 g/L FeSO4; pH 6.5 at 30°C for 72 hours. For batch enzyme production, the cult ure medium using non-delignified substrate, with pH controlled at 6.5, without aeration resulted in an increase of 90% in enzyme activity compared to the fermentation in a rotatory shaker. Under these conditions, the maximal enzyme production was obtained after 24 hours of fermentation. The crude enzyme extract produced by Melanoporia sp. was able to hydrolyze cellulose (coconut shell powder) efficiently, presenting industrial potential for the degradation of lignocellulosic residues. Unlike most of the cellulases produced by Trichoderma species, the strain reported as one of the best producers, the microorganism was capable of producing cellulases efficiently without the need of substrate pretreatment. Another feature of this enzyme complex is its high stability in the crude broth at-20°C e 4 °C / Celulases são um complexo enzimático constituído por endoglucanases, exoglucanases e β-glicosidases com diversas aplicações biotecnológicas. No entanto, o elevado custo de produção dessas enzimas é o principal obstáculo para sua aplicação industrial. Estima-se que cerca de 40% do custo total de produção de celulases esteja relacionado ao meio de cultura utilizado para o crescimento do micro-organismo. Nesse contexto, é de fundamental importância o desenvolvimento de processos para a produção de enzimas do complexo celulolítico que se mostrem técnico e economicamente viáveis. Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a produção de celulases produzidas por Melanoporia sp. utilizando o pó da casca de coco como substrato em fermentação submersa. A influência dos parâmetros pH e temperatura na determinação da atividade da enzima foi avaliada através de planejamento experimental univariado. Em seguida, a composição do meio de cultura foi otimizada através dos planejamentos experimentais Plaket-Burman e Composto Central. A fermentação em condições otimizadas foi posteriormente conduzida em fermentador para avaliar a influência do controle de pH e oxigênio na produção da enzima. A estabilidade da enzima foi avaliada por 6 e 8 meses nas temperaturas de 4 °C e -20 °C, respectivamente. A capacidade das enzimas em hidrolisar o pó da casca do coco foi avaliada nas temperaturas de 65 °C e 80 °C utilizando o extrato enzimático bruto produzido por Melanoporia sp. A atividade da enzima foi determinada através da quantificação de açúcares redutores pelo método de DNS. O pH e a temperatura de determinação da atividade enzimática foram pH 5,5 e 80 °C, respectivamente. A composição do meio de cultura que proporcionou o maior rendimento de produção da enzima foi: 5 g/L de casca de coco; 15 g/L de lactose; 3% de tween 80; 1 g/L de KH2PO4 e 0,05 g/L de FeSO4; pH 6,5 a 30 °C em 72 horas. Para a produção da enzima em fermentador, o meio de cultura utilizando substrato não deslignificado, com controle do pH em 6,5, sem aeração proporcionou um aumento de 90% na atividade da enzima, comparado à fermentação em shaker. Nessas condições, a máxima produção da enzima foi obtida após 24 horas de fermentação. O extrato enzimático bruto produzido por Melanoporia sp. exibiu capacidade de hidrolisar celulose presente na casca de coco com eficiência, apresentando potencial industrial para a degradação de resíduos lignocelulósicos. Diferentemente da maior parte das celulases produzidas por espécies de Trichoderma, micro-organismo reportado como bom produtor de enzimas celulolíticas, o micro-organismo utilizado neste trabalho é capaz de produzir celulases de forma eficiente, sem necessidade de pré-tratamento do substrato. Outra característica diferencial desta enzima é sua elevada estabilidade nas temperaturas de -20 °C e 4 °C no caldo bruto.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é amplamente empregado comercialmente como agente biocontrolador de artrópodes em pragas na agricultura e pecuária, abrangendo vasta gama de hospedeiros. Para que o processo infectivo tenha sucesso, é necessário que o fungo atravesse a cutícula, a primeira e principal defesa do artrópode. A transposição dessa primeira barreira ocorre pela secreção de proteases, lipases e quitinases para degradar seus principais componentes estruturais. Dentre as proteases expressas por M. anisopliae, a família Pr1 de serino-proteases está associada à virulência. Essa família possui 11 isoformas - Pr1A a Pr1K - em M. anisopliae, sendo subdivididas em duas classes. A Classe II compreende 10 isoformas subdivididas em três subfamílias. Essas isoformas agem de forma sinergística entre si e com outros fatores, conferindo maior virulência e permitindo a infecção de diferentes hospedeiros. É suposto que a virulência coevolui por seleção recíproca com o hospedeiro, havendo seleção positiva para a evolução de novas proteases ou isoformas que não sejam inativadas por inibidores do hospedeiro. O presente trabalho busca testar essa hipótese na Classe II da família Pr1, com especial foco em M. anisopliae, utilizando diferentes métodos de inferência filogenética em conjuntos de aminoácidos e nucleotídeos das isoformas individuais, bem como agrupadas por subfamílias, abrangendo homólogos do gênero Metarhizium e fungos relacionados. As árvores obtidas e seus respectivos alinhamentos nucleotídicos foram analisados quanto à substituições sinônimas e não sinônimas para inferência de seleção positiva. Tanto para os conjuntos de dados individuiais quanto para aqueles agrupados por subfamília, as filogenias retratam grupos com alto suporte estatístico condizentes com a taxonomia dos organismos que sintetizam essas proteínas, embora contendo pequenas discrepâncias. Foram identificados sítios sob seleção positiva em seis das nove isoformas avaliadas, em sua maioria localizados no domínio proteolítico. Esses resultados indicam que existe pressão seletiva diferenciada para gerar novas variações de Pr1, com efeito potencial na especificidade por hospedeiros, aumento de virulência, ou adaptação a outros estilos de vida hospedeiro-independente. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplie is widely applied as a pest-arthropod biocontrol agent in crops and animal production, encompassing a wide array of hosts. For a successful infection, it is vital that the fungus breaches the host’s cuticle, the first and main defense of artrhopods. Transposing this first barrier requires secreted proteases, lipases and chitinases that degrade the cuticle’s main structural components. Among the expressed proteases of M. anisopliae, the Pr1 family of serine proteases is related to its virulence. In M. anisopliae, this family contains 11 isoforms – Pr1A through Pr1K – divided into two classes. Class II comprises 10 isoforms further divided into three subfamilies. It is believed that these isoforms act synergistically and with other virulence fators, allowing the infection of different hosts. Presumably, virulence coevolves through reciprocal selection with the host, where positive selection occurs for the evolution of new proteases or isoforms that are not inactivated by the host’s inhibitors. The current work tests this hypothesis in Class II of the Pr1 family, with a special focus in M. anisopliae, employing different methods for phylogenetic inference in aminoacid and nucleotide datasets alike for each isoform individually as well as grouped by subfamily, encompassing homologs for the Metarhizium genus and related fungi. The inferred trees and their respective alignments were analyzed regarding synonymous and non-synonymous substitutions to detect positive selection. For each individual dataset, as well as for their subfamily groups, phylogenies depict groups that match the taxonomy of their respective organisms with high statistical support, albeit with minor discrepancies. Positively selected sites were identified in six out of nine Pr1 isoforms, most of them located within the proteolytic domain. These results imply that there exists a differential selective pressure for the evolution of novel Pr1 variations, potentially affecting host specificity, increasing virulence or adapting the fungus to different host-independent lifestyles.

Enzimas microbianas, quando produzidas a um custo acessível e preservadas suas propriedades catalíticas, são ferramentas determinantes para a sustentabilidade das indústrias química e energética. Buscando aprimorar a produção de lipases pela cepa de Staphylococcus warneri EX17, diferentes estratégias de cultivo em biorreatores submersos foram aplicadas para analisar a influência de algumas variáveis na produção da enzima e então foi proposto o cultivo em batelada alimentada. Paralelamente, lipases de S. warneri EX17 (SWL) foram imobilizadas por adsorção hidrofóbica em Octyl-Sepharose, Immobead 150 e MCI GEL CHP20P. Os resultados indicaram que a interação entre enzima e suporte interfere nas propriedades da enzima imobilizada. Os preparados Octyl-SWL e MCI-SWL preservaram sua atividade lipolítica quando expostos a 50 % (v/v) de Butanol, Etanol, n-Hexano, Isopropanol e Metanol. Na síntese do éster aromático butirato de etila, Octyl-SWL e MCI-SWL exibiram desempenho promissor, alcançando em 24 h de reação 28 % e 35,6 % de rendimento, respectivamente. Lipases de S. warneri EX17 purificadas e imobilizadas em suportes hidrofóbicos preservaram propriedades que apontam seu potencial como biocatalisador industrial. / Microbial enzymes, when produced at affordable costs and preserving their catalytic properties, are crucial tools for sustainable chemical and energy industries. To enhance lipase production by Staphylococcus warneri EX17 strain, different cultivation strategies were applied to investigate the influence of some variables on enzyme production and then fed-batch cultivation was proposed. Additionally, three hydrophobic supports, Octyl-Sepharose, Immobead 150 and MCI GEL CHP20P have been assayed to purify and immobilize the lipase from S. warneri EX17 (SWL) via interfacial adsorption. Results indicated that the intensity of the interaction between the lipase and the support surface interferes in properties of the immobilized enzyme. The immobilized preparations Octyl-SWL and MCI-SWL preserved their lipolytic activity in the presence of 50 % (v/v) Butanol, Ethanol, n-Hexane, Isopropanol and Methanol. Octyl-SWL and MCI-SWL catalyzed the ester synthesis reaction giving 28 % and 35.6 % of conversion in 24 h. These enzyme preparations may be promising alternatives as industrial biocatalysts.

Enzimas industriais movimentam um mercado mundial estimado em sete bilhões de dólares anualmente. Entre essas enzimas, incluem-se as queratinases, enzimas capazes de catalisar a hidrólise de queratina e com aplicação potencial na indústria coureira. A queratinase KerS14, produzida pelo Bacillus subtilis S14 é capaz de depilar o couro sem causar danos ao colágeno. Embora tenha esta capacidade de grande interesse biotecnológico, sua baixa termoestabilidade a 50 °C é uma característica desvantajosa para a aplicação industrial da enzima. Visando aumentar a produção de queratinases pelo B. subtilis S14 e a termoestabilidade da KerS14, duas estratégias foram adotadas: mudanças nas condições de cultura do microrganismo selvagem e obtenção de enzimas mutantes recombinantes. Na primeira estratégia, B. subtilis S14 foi cultivado em meio farinha de pena 1,5% e CaCl2 1%. O sobrenadante da cultura foi caracterizado e 60% da atividade queratinolítica permaneceu depois de armazenada por nove dias a temperatura de 50 °C. Em paralelo, a ORF que codifica a KerS14 foi amplificada e clonada em vetor de expressão. Os resíduos de aminoácidos G61, S98 e P239 da KerS14 foram modificados por mutagênese sítio dirigida , as enzimas mutantes foram expressas in Escherichia coli e purificadas. A enzima recombinante (rKerS14) foi mais termoestável do que a enzima selvagem. Além disso, foi verificado que o fibrinogênio e fibrina são hidrolisados pela rKerS14, mostrando que a enzima também tem potencial para desenvolver drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares. / Industrial enzymes have a world market of more than seven billion dollars per year. Keratinases are among these enzymes. They have a potential for use in tannery. The keratinase KerS14, produced by Bacillus subtilis S14, differ from other keratinases because it can depilate leather without damaging collagen. Despite this great biotechnological potential, its low thermal stability at 50 °C is an undesirable property for industrial application. In order to increase keratinases production by B. subtilis S14 and KerS14 thermal stability, two strategies were adopted: changes in wild–type microorganism growth conditions and producing recombinant mutant enzymes. In first strategy, B. subtilis S14 were grown in feather meal 1.5% and CaCl2 1 %. The supernatant obtained after fermentation was characterized and its keratinolytic activity remained in 60% after nine days of storage at 50 °C. In parallel, the KerS14 ORF was amplified and cloned into an expression vector. The KerS14 amino acid residues G61, S98 and P239 were modified and mutant enzymes were expressed in Escherichia coli and purified. It was verified that recombinant enzyme (rKerS14) is more thermal stable than the wild–type enzyme. In addition, it is able to hydrolyze fibrinogen and fibrin which is useful to develop drugs for the treatment of cardiovascular diseases.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T19:55:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 314164.pdf: 3161010 bytes, checksum: 205e23028968071ac13bb22a65278f4e (MD5) / Neste trabalho, a lipase comercial de Burkholderia cepacia (LBC) foi imobilizada nas blendas de amido/PEO e proteína de soja/PEO, na presença ou ausência de B-ciclodextrina (B-CD). Estes sistemas foram usados como catalisadores na acilação do 3-nitro-1-feniletanol [(R,S)-15b] e do 3,4-metilenodioxi-1-feniletanol [(R,S)-16b] com diferentes doadores acilas (acetato de vinila, acetato de etila, acetato de isopropenila, propionato de vinila, laurato de vinila e estearato de vinila), na presença de t-butil metil éter (MTBE). Foram avaliadas a variação molar do álcoois em relação ao acetato de vinila, uso da LBC não imobilizada ou suportada em diversos filmes, efeito da temperatura e a reação na ausência da LBC. Todas as reações utilizando a LBC, apresentaram excelente excesso enantioméricos dos produtos (eep >99%) e razão enantiomérica (E >200), no estudo da razão molar alcool: acetato de vinila. Acima da razão molar 1:2, as conversões foram similares, sendo de 31-50% para o (R)-éster 15c e de 45-50% para o (R)-éster 16c. Ao utilizar a LBC imobilizada em diversos filmes, as conversões em (R)-éster 15c e 16c foram dependentes dos suportes. Foram obtidas conversões baixas (2-14%) com a LBC imobilizada em filmes de amido e carboximetil celulose (CMC). Os melhores resultados foram obtidos com a LBC imobilizada nos filmes de amido/PEO e proteína de soja/PEO, sendo de 28-50%. Na presença de B-CD, as conversões foram de 32-50%. Na ausência da lipase, não foi observada a formação dos produtos, independente do suporte usado. Porém, ao usar as blendas de proteína de soja/PEO, as conversões foram de 3%. Para as reações com a LBC na forma livre, as conversões aos (R)-éster 15c e (R)-éster 16c foram de 4% e 18%, em 48h. Ao usar as temperaturas de 25º, 35º e 45º C, as conversões aos produtos variaram de 16-40%, 28-50% e 26-41% para o (R)-éster 15c e de 27-40%, 37-50% e 33-44% para o (R)-éster 16c, respectivamente. As lipases de Burkholderia cepacia (LPS-SD), de Mucor Javanicus (LMJ 10), de Pseudomonas fluorescens (LAK 20), de Aspergillus niger (LAN 12), de Candida cylindracea (LAY 30) e de Thermomyces lanuginosus (LTL-IM), foram imobilizadas nos filmes de amido/PEO (1/1 m/m) e proteína de soja/PEO (1/1 m/m), com ou sem B-CD. Estes sistemas, foram usados na reação de transesterificação do acetato de vinila com (R,S)-15b. Ao usar as lipases LAY 30, LMJ 10 e LAN 12, as conversões foram de 0-20%, com eep de 65-86%. Ao usar as lipases LPS-SD, LAK 20 e LTL-IM, todos os eep foram >99%, e maior conversão foi obtida com o sistema LPS-SD/proteína de soja/PEO/B-CD (40%). Avaliou-se o efeito do solvente orgânico na reação do acetato de vinila com (R,S)-15b, catalisada pela LBC suportada nas blendas citadas no estudo anterior. Com o uso do t-butanol, ciclohexano, éter di-isopropílico e acetona, as conversões foram de moderadas a boas (19-50%). Na presença de THF, as conversões foram de 2-10%. Não foi observada relação direta com os valores de log P dos solventes. Os álcoois racêmicos 3-nitro-1-feniletanol (15b), 3,4-metilenodioxi-1-feniletanol (16b), 4-nitro-1-feniletanol (17b), 4-metil-1-feniletanol (18b), 4-bromo-1-feniletanol (19b) e o 4-métoxi-1-feniletanol (20b) foram usados em reações com acetato de vinila. Como catalisador foi utilizado a LBC imobilizada em filmes de amido/PEO (1/1 m/m) e proteína de soja/PEO (1/1 m/m), na presença ou ausência de B-CD. As conversões aos produtos foram maiores na presença de grupos doadores de elétrons. Em 24h, as conversões ao (R)- éster 17c (4-nitro) foram de 17-29% e do (R)- éster 16c (3,4-metilenodioxi) variaram de 37-45%. A LBC, imobilizada em quatro (4) suportes diferentes, foi reutilizada após 30 e 90 dias de estocagem a temperatura ambiente em n-hexano, na reação do acetato de vinila com (R,S)-15b em MTBE. Após 30 dias, as conversões ao (R)-éster 15c variaram de 20-43%, e após 90 dias de 11-27%. Concluindo, os resultados obtidos mostraram que as blendas de amido/PEO (1/1 m/m) e proteína de soja/PEO (1/1 m/m) com ou sem B-CD puderam ser usadas como suportes para diferentes lipases. Esses sistemas foram também usados, com sucesso, na resolução de vários álcoois racêmicos derivados do 1-feniletanol sob condições brandas de reação, e puderam ser reutilizados. <br> / Abstract : In this study, commercial lipase obtained from Burkholderia cepacia (LBC) was immobilized in starch/PEO and soybean protein/PEO blends, in the presence or absence of B-cyclodextrin (B-CD). These systems were used as biocatalyst in the acylation of 3-nitro-1-phenylethanol [(R,S)-15b] and 3,4-methylenedioxy-1-phenylethanol [(R,S)-16b] with various acyl donors (vinyl acetate, ethyl acetate, isopropenyl acetate, vinyl propionate, vinyl laurate and vinyl stearate) in the presence of methyl tert-butyl ether (MTBE). The influence of the alcohol:vinyl acetate molar ratio, the use of LBC, free or immobilized in different films (or blends) and the effect of temperature were studied. The reaction was also carried out in the absence of LBC. In the studies on the alcohol: vinyl acetate molar ratio are used the LBC, in all reactions the enantiomeric excess of products (eep>99%) and the enantiomeric ratio were excellent (E >200). The values for the conversion to products were dependent on this parameter. Using a molar ratio of 1:2 or higher, the conversion degrees were similar, these being 31-50% for (R)-ester 15c and 45-50% to (R)-ester 15c. When LBC immobilized in various films was used the conversion degrees to (R)-esters 15c and 16c were dependent on the support. With the use of starch or carboxymethyl cellulose (CMC) as the support the conversions were low (2-14%). Best results were achieved when LBC was immobilized in Starch/PEO or soybean protein/PEO films, these being of 28-50%. With the presence of B-CD in the films, the conversions were 32-50%. In the absence of lipase, no product was detected regardless of the support used. However, when the soybean protein/PEO blends were used, the conversion was 3%. Using free LBC, the conversion degrees to (R)-esters 15c and 16c in 48h were 4% and 18%, respectively. With the application of temperatures of 25º, 35º and 45º C the conversion degrees were 16-40%, 28-50% and 26-41% for (R)-ester 15c and 27-40%, 37-50% and 33-44% for (R)-ester 16c, respectively. The lipases obtained from Burkholderia cepacia (LPS-SD), Mucor Javanicus (LMJ 10), Pseudomonas fluorescens (LAK 20), Aspergillus niger (LAN 12), Candida cylindracea (LAY 30) and Thermomyces lanuginosus (LTL-IM) were immobilized in starch/PEO(1/1 m/m) and soybean protein/PEO (1/1 m/m) blends in the presence or absence of B-CD. These systems were then used in the transesterification reaction of vinyl acetate with (R,S)-15b. Using LAY 30, LMJ 10 and LAN 12 lipases the conversion degrees were 0-20%, with an eep of 65-86%. With the use of LPS-SD, LAK 20 and LTL-IM lipases the eep was >99%, and the highest conversion (40%) was obtained using the soybean protein/PEO/B-CD. The solvent effect was evaluated in the reaction of vinyl acetate with (R,S)-15b, catalyzed by LBC immobilized in the blends used in the previous study. With the use of t-butanol, cyclohexane, di-isopropyl ether and acetone the conversion degrees were moderate or good (19-50%). In the presence of THF the conversion degrees were 2-10%. No direct relation with the solvent log P values was observed. The racemic alcohols 3-nitro-1-phenylethanol (15b), 3,4-methylenedioxy -1- phenylethanol (16b), 4-nitro-1-phenylethanol (17b), 4-methyl-1-phenylethanol (18b), 4-bromo-1-phenylethanol (19b) and 4-methoxy-1-phenylethanol (20b) were used in the transesterification reaction of vinyl acetate with (R,S)-15b. LBC was immobilized in starch/PEO (1/1 m/m) and soybean protein/PEO (1/1 m/m) blends, in the presence or absence of B-CD. The conversion degrees into products were higher in the presence of electron donor groups. In 24 h the degrees of conversion to (R)-ester 17c were 17-29% and to R-ester 16c were 37-45%. LBC immobilized in four different supports was reused after 30 and 90 days of storage at room temperature in n-hexane, in the reaction of vinyl acetate with (R,S)-15b in MTBE. The conversion degrees for (R)-ester 15c were 20-43% after 30 days of storage and 11-27% after 90 days of storage. In conclusion, the results obtained show that the starch/PEO (1/1 m/m) and soybean protein/PEO (1/1 m/m) blends, in the presence or absence of B-cyclodextrin, can be used as supports for various lipases. These systems were also used successfully in the resolution of racemic alcohols derived from 1-phenylethanol, under mild reaction conditions, and the possibility of their reused was verified.