CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Cowpea [ Vigna unguiculata (L.) Walpers] is a crop of great importance for the Northeastern Brazil, where it represents one of the basic diet constituents of its population. Although cowpea yield has been crescent every year, the crop suffers from several biotic and abiotic stresses. Under stress conditions, excess reactive oxygen species (ROS) are produced as a result of the plant metabolism alterations. ROS accumulation in various tissues is harmful for nucleic acids, proteins and lipids. Thus, the search for mechanisms that act in the removal of ROS is of fundamental importance. The objectives of this present work were to purify a 2-Cys peroxiredoxins from cowpea leaves, named Vu-2-cys-prx, and characterize some of its biochemical, physiological and molecular properties. Vu-2-cys-prx is an antioxidant enzyme which acts by reducing H 2 O 2 and alkyl hydroperoxides producing water and alcohol, respectively. Vu-2-cys-prx was purified by ammonium sulfate fractionation (30-60%) followed by affinity and ion exchange chromatography on chitin and Resource Q, in that order. Purified Vu-2-cys- prx was able to reduce hydroperoxides using NADPH and DTT reducing power with the aid of thioredoxin. Vu-2-cys-prx presented as a 44 kDa/46 kDa protein as determined by SDS-PAGE and size exclusion chromatography on Superose 12 column, respectively. Under reducing conditions, Vu-2-cys-prx appeared as a 22 kDa protein, indicating that the 44/46 kDa protein is a homodimer linked intermolecularly by disulfide bonds. Vu-2- cys-prx has a pI of 4.7, but by two-dimensional electrophoresis, with and without DTT, it focused as several protein spots indicating different oxidation states. The NH 2 -terminal sequence of Vu-2-cys-prx showed 96% similarity with the peroxiredoxins of Phaseolus vulgaris and Populus tricocarpa and 94% similarity with those of Vigna radiata , Pisum sativum , Ricinus cummunis and Nicitiana tabacum . In addition, Vu-2-cys-prx has a highly conserved cystein residue at position 52 (Cys 52 ). Analysis by ESI-Q-TOF MS/MS showed a molecular mass of 28.622 kDa and pI of 5.18. The circular dichroism spectrum and deconvolution at pH 7.0 showed that the secondary structure of Vu-2-cys-prx is composed of 7.6% α -helix, 39% β -sheet, 22.1% β -turn and 31% random coil. Vu-2-cis- prx was heat stable, with a protein melting point (Tm) of 74 ÂC, optimal activity at pH 7.0, and structural and functional changes under pH 3.0 and 9.0. Vu-2-cis-prx did not inhibit the spore germination of the phytopathogenic fungus Colletrotrichum gloeosporioides , but prevented DNA plamidial degradation by reactive oxygen species (H 2 O 2 ).The transcripts of Vu-2-cys-prx were highly expressed in roots, stems and leaves and the sequence of its corresponding gene showed 100% homology with the cowpea ESTs FG931548.1 and FG883990.1. The predicted amino acid sequence showed 2 conserved cystein residues, and several peptide domains typical of the 2-cys-prx subfamily members. Molecular modeling showed that the redox-active cystein, named peroxidatic cystein, is in a narrow solvent-accessible pocket formed by a loop-helix motif. Cys 52 was located in the first turn of the helix surrounded by Pro 45 , Thr 49 and Arg 128 that are conserved in all 2-cys-peroxiredoxins. Moreover, modeling showed that Vu-2-cys-prx could form oligomers under different oxidative states. In summary, this study describes, for the first time, the purification and characterization of a 2-cys- peroxiredoxin (Vu-2-cys-prx) from cowpea leaves that, similarly to other members of this family, may play a pivotal role in the protection of plant chloroplasts from photo- oxidative stress and thus damage to the photosynthetic apparatus. / O feijÃo-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walpers] à uma das culturas de grande importÃncia para a regiÃo Nordeste, pois representa um dos constituintes bÃsicos da dieta de sua populaÃÃo. Embora a produÃÃo venha aumentando anualmente no paÃs, a cultura enfrenta diversos tipos de estresses de natureza biÃtica e abiÃtica. Durante condiÃÃes de estresses, espÃcies reativas de oxigÃnio (ROS) sÃo produzidas acima da condiÃÃo fisiolÃgica, como consequÃncia de alteraÃÃes do metabolismo. O acÃmulo de ROS, em vÃrios tecidos, à nocivo para Ãcidos nuclÃicos, proteÃnas e lipÃdeos. Sendo assim, a busca de mecanismos que atuem na remoÃÃo e controle da produÃÃo dessas espÃcies reativas à de fundamental importÃncia. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar, nos seus aspectos bioquÃmicos, fisiolÃgicos e moleculares, uma enzima antioxidante de folhas de feijÃo-de-corda, denominada de 2-cis-peroxirredoxina, que atua reduzindo o perÃxido de hidrogÃnio (H2O2) e hidroperÃxidos de alquil, produzindo Ãgua ou Ãlcool, respectivamente. A 2-cis-peroxirredoxina purificada de folha de V. unguiculata, nomeada de Vu-2-cis-prx, foi obtida por fracionamento com sulfato de amÃnio (30-60%), cromatografia de afinidade em matriz de quitina e cromatografia de troca iÃnica em Resource Q. A Vu-2-cis-prx foi capaz de reduzir hidroperÃxidos usando o poder redutor do NADPH e do DTT com auxÃlio do sistema tioredoxina. Apresentou massa molecular de, aproximadamente, 44 kDa/46 kDa, determinada por SDS-PAGE e cromatografia de exclusÃo molecular em coluna Superose 12, respectivamente. Jà em condiÃÃes redutoras, apresentou massa molecular de 22 kDa, indicativo de se tratar de uma proteÃna homodimÃrica, formada pelo estabelecimento de pontes dissulfeto intermoleculares. A Vu-2-cis-Prx apresentou pI de cerca de 4,7 e a anÃlise por eletroforese bidimensional, com e sem DTT, revelou que a Vu-2-cis-Prx foi focalizada em vÃrios spots protÃicos, indicando diferentes estados de oxidaÃÃo. Sua sequÃncia N-terminal revelou haver similaridade de 96% com a peroxirredoxina de Phaseolus vulgaris e de Populus tricocarpa, e de 94% com aquelas de Vigna radiata, Pisum sativum, Ricinus cummunis e Nicitiana tabacum, alÃm de um resÃduo de cisteÃna altamente conservado na posiÃÃo 52 (Cys52). AnÃlises por ESI-Q-TOF MS/MS demonstrou massa molecular e pI de 28,622 kDa/5,18, respectivamente. O espectro de dicroÃsmo circular e desconvoluÃÃo em pH 7,0 revelaram que a estrutura secundÃria à composta de 7,6% de ?-hÃlice, 39% de folha-?, 22,1% de volta-?, e 31% de padrÃo nÃo ordenado. A Vu-2-cis-Prx se comportou estÃvel ao calor e apresentou temperatura de desnaturaÃÃo (Tm) de 74 ÂC. Apresentou, ainda, Ãtimo de atividade em pH 7.0 e mudanÃas estruturais e funcionais em pH 3 e 9. Vu-2-cis-Prx nÃo foi capaz de apresentar atividade antifÃngica contra Colletrotrichum gloeosporioides, contudo foi capaz de prevenir a degradaÃÃo de DNA plamidial por ROS (H2O2). Os transcritos de Vu-2-cis-Prx foram altamente expressos em raÃzes, caules e folhas e a sequÃncia de seu gene demonstrou 100% de homologia com os ESTs FG931548.1 e FG883990.1 de feijÃo-de-corda, depositados no NCBI. A sequÃncia putativa de aminoÃcidos revelou 2 resÃduos de cisteÃna conservados e diversos domÃnios tÃpicos de membros da subfamÃlia de 2-cis-peroxirredoxinas. Modelagem molecular da Vu-2-cis-Prx revelou que o resÃduo de cisteÃna que participa do sÃtio-redox, denominada de cisteÃna peroxidÃsica, està em um bolso no qual o solvente tem acesso, sendo formado por um motivo âloop-hÃliceâ. A Cys52 foi localizada na primeira volta da hÃlice rodeada pelos aminoÃcidos Pro45, Thr49 e Arg128, que sÃo conservados em todas as 2-cis-peroxirredoxinas. AlÃm disso, a Vu-2-cis-Prx se mostrou capaz de formar oligÃmeros com diferentes estados de oxidaÃÃo. Em suma, foi descrito aqui, pela primeira vez, a purificaÃÃo e caracterizaÃÃo de uma 2-cis-peroxirredoxina de feijÃo-de-corda que, semelhantemente a outros membros desta famÃlia, deve desempenhar papel crucial na protecÃÃo dos cloroplastos de plantas contra o estresse foto-oxidativo prevenindo, assim, danos ao aparato fotossÃntÃtico.

SILVA, F. D. A. Caracterização bioquímica e molecular de uma 2-cis-peroxirredoxina de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walpers]. 2011. 104 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-03-12T11:33:18Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_fdasilva.pdf: 2610057 bytes, checksum: 7d820816e20ddbbc55e76ef2b7175733 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-29T20:48:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_fdasilva.pdf: 2610057 bytes, checksum: 7d820816e20ddbbc55e76ef2b7175733 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-29T20:48:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_fdasilva.pdf: 2610057 bytes, checksum: 7d820816e20ddbbc55e76ef2b7175733 (MD5) Previous issue date: 2011 / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walpers] é uma das culturas de grande importância para a região Nordeste, pois representa um dos constituintes básicos da dieta de sua população. Embora a produção venha aumentando anualmente no país, a cultura enfrenta diversos tipos de estresses de natureza biótica e abiótica. Durante condições de estresses, espécies reativas de oxigênio (ROS) são produzidas acima da condição fisiológica, como consequência de alterações do metabolismo. O acúmulo de ROS, em vários tecidos, é nocivo para ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos. Sendo assim, a busca de mecanismos que atuem na remoção e controle da produção dessas espécies reativas é de fundamental importância. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar, nos seus aspectos bioquímicos, fisiológicos e moleculares, uma enzima antioxidante de folhas de feijão-de-corda, denominada de 2-cis-peroxirredoxina, que atua reduzindo o peróxido de hidrogênio (H2O2) e hidroperóxidos de alquil, produzindo água ou álcool, respectivamente. A 2-cis-peroxirredoxina purificada de folha de V. unguiculata, nomeada de Vu-2-cis-prx, foi obtida por fracionamento com sulfato de amônio (30-60%), cromatografia de afinidade em matriz de quitina e cromatografia de troca iônica em Resource Q. A Vu-2-cis-prx foi capaz de reduzir hidroperóxidos usando o poder redutor do NADPH e do DTT com auxílio do sistema tioredoxina. Apresentou massa molecular de, aproximadamente, 44 kDa/46 kDa, determinada por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão molecular em coluna Superose 12, respectivamente. Já em condições redutoras, apresentou massa molecular de 22 kDa, indicativo de se tratar de uma proteína homodimérica, formada pelo estabelecimento de pontes dissulfeto intermoleculares. A Vu-2-cis-Prx apresentou pI de cerca de 4,7 e a análise por eletroforese bidimensional, com e sem DTT, revelou que a Vu-2-cis-Prx foi focalizada em vários spots protéicos, indicando diferentes estados de oxidação. Sua sequência N-terminal revelou haver similaridade de 96% com a peroxirredoxina de Phaseolus vulgaris e de Populus tricocarpa, e de 94% com aquelas de Vigna radiata, Pisum sativum, Ricinus cummunis e Nicitiana tabacum, além de um resíduo de cisteína altamente conservado na posição 52 (Cys52). Análises por ESI-Q-TOF MS/MS demonstrou massa molecular e pI de 28,622 kDa/5,18, respectivamente. O espectro de dicroísmo circular e desconvolução em pH 7,0 revelaram que a estrutura secundária é composta de 7,6% de ?-hélice, 39% de folha-?, 22,1% de volta-?, e 31% de padrão não ordenado. A Vu-2-cis-Prx se comportou estável ao calor e apresentou temperatura de desnaturação (Tm) de 74 °C. Apresentou, ainda, ótimo de atividade em pH 7.0 e mudanças estruturais e funcionais em pH 3 e 9. Vu-2-cis-Prx não foi capaz de apresentar atividade antifúngica contra Colletrotrichum gloeosporioides, contudo foi capaz de prevenir a degradação de DNA plamidial por ROS (H2O2). Os transcritos de Vu-2-cis-Prx foram altamente expressos em raízes, caules e folhas e a sequência de seu gene demonstrou 100% de homologia com os ESTs FG931548.1 e FG883990.1 de feijão-de-corda, depositados no NCBI. A sequência putativa de aminoácidos revelou 2 resíduos de cisteína conservados e diversos domínios típicos de membros da subfamília de 2-cis-peroxirredoxinas. Modelagem molecular da Vu-2-cis-Prx revelou que o resíduo de cisteína que participa do sítio-redox, denominada de cisteína peroxidásica, está em um bolso no qual o solvente tem acesso, sendo formado por um motivo “loop-hélice”. A Cys52 foi localizada na primeira volta da hélice rodeada pelos aminoácidos Pro45, Thr49 e Arg128, que são conservados em todas as 2-cis-peroxirredoxinas. Além disso, a Vu-2-cis-Prx se mostrou capaz de formar oligômeros com diferentes estados de oxidação. Em suma, foi descrito aqui, pela primeira vez, a purificação e caracterização de uma 2-cis-peroxirredoxina de feijão-de-corda que, semelhantemente a outros membros desta família, deve desempenhar papel crucial na protecção dos cloroplastos de plantas contra o estresse foto-oxidativo prevenindo, assim, danos ao aparato fotossíntético.