The new field of ‘omics’ has spawned the development of metaproteomics, an approach that has the ability to identify and decipher the metabolic functions of a proteome derived from a microbial community that is largely uncultivable. With the development and availabilities of high throughput proteomics, high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (MS) has been leading the field for metaproteomics. MS-based metaproteomics has been successful in its’ investigations of complex microbial communities from soils to the human body. Like the environment, the human body is host to a multitude of microorganisms that reside within the skin, oral cavity, vagina, and gastrointestinal tract, referred to as the human microbiome. The human microbiome is made up of trillions of bacteria that outnumber human genes by several orders of magnitude. These microbes are essential for human survival with a significant dependence on the microbes to encode and carryout metabolic functions that humans have not evolved on their own. Recently, metaproteomics has emerged as the primary technology to understand the metabolic functional signature of the human microbiome. Using a newly developed integrated approach that combines metagenomics and metaproteomics, we attempted to address the following questions: i) do humans share a core functional microbiome and ii) how do microbial communities change in response to disease. This resulted in a comprehensive identification and characterization of the metaproteome from two healthy human gut microbiomes. These analyses have resulted in an extended application to characterize how Crohn’s disease affects the functional signature of the microbiota. Contrary to measuring highly complex and representative gut metaproteomes is a less complex, controlled human-derived microbial community present in the gut of gnotobiotic mice. This human gut model system enhanced the capability to directly monitor fundamental interactions between two dominant phyla, Bacteroides and Firmicutes, in gut microbiomes colonized with two or more phylotypes. These analyses revealed membership abundance and functional differences between phylotypes when present in either a binary or 12-member consortia. This dissertation aims to characterize host microbial interactions and develop MS-based methods that can provide a better understanding of the human gut microbiota composition and function using both approaches.

Alors que le protéome de l'ovocyte isolé, aux stades VG et MII a déjà été étudié, celui du follicule en croissance n'a jamais été décrit.Dans cette étude, nous avons cherché à identifier, comparer et caractériser les profils protéiques de follicules ovariens de souris à trois stades de leur développement in vitro distincts morphologiquement : follicules secondaires en début de culture - stade initial (IS), follicules avec une rupture complète de la membrane de Slavjanski (RMS) et follicules avec une cavité similaire à l'antrum (FA).Après un préfractionnement par IEF et une analyse LC-MS/MS en deux configurations (1D et 2D), 1403 protéines ont pu être identifiées dans le follicule ovarien de souris. 43,4 % (609) des protéines identifiées étaient communes aux trois stades et d'autres ont été identifiées uniquement à un stade : 71 au stade IS, 182 au stade RMS et 193 au stade FA. De plus, on a identifié 365 protéines qui n'avaient pas été décrites antérieurement dans le protéome de l'ovocyte ce qui pourrais indiquer qu'elles sont exprimées dans les cellules somatiques du follicule. Des analyses qualitatives et quantitatives complémentaires ont démontré une surreprésentation pour 44 fonctions biologiques par rapport aux fonctions biologiques des gènes constituant le génome de Mus musculus et mis en évidence des différences d'expression et d'abondance des protéines liées au cycle cellulaire, à la fixation des ions de calcium et à la glycolyse selon le stade de développement. Ces résultats représentent un point de départ pour beaucoup d'autres études de caractérisation moléculaire du développement folliculaire. / Until now only the proteome of isolated oocyte from fully grown follicle were described with the aim of oocyte maturation characterization. However the ability of oocyte to mature is acquired during its development within the follicle. Thus in this study we proposed a protein identification and characterization of whole mice ovarian follicle at three morphological stages during in vitro development: early secondary stage, described as initial stage (IS), follicles with a complete Slavjanski membrane rupture (RMS) and follicles with an antrum like cavity formation (FA). Using an IEF pre fractionation before protein digestion and two configurations of LC-MS/MS analysis (1D and 2D), 1403 proteins were successfully identified in the murine ovarian follicle. From those, 43.4 % (609) were commonly identified in the three stages and some were identified only at one single stage: 71 at IS stage, 182 at RMS stage and 193 at FA stage. Compared to the proteomes of isolated oocyte previously described, 365 proteins were only identified in our samples indicating that those ones were probably expressed in the somatic cells of the follicle. Additional qualitative and quantitative analysis highlighted 44 biological processes over represented in our samples when compared to Mus musculus gene database and different expressions and protein abundance implicated in cell cycle, calcium ion binding and glycolysis, throughout in vitro follicle development. This report represents so far the most complete catalogue of follicle proteins and could be an important milestone in the proteomic study of the follicle metabolism throughout in vitro development.

Alors que le protéome de l'ovocyte isolé, aux stades VG et MII a déjà été étudié, celui du follicule en croissance n'a jamais été décrit.Dans cette étude, nous avons cherché à identifier, comparer et caractériser les profils protéiques de follicules ovariens de souris à trois stades de leur développement in vitro distincts morphologiquement : follicules secondaires en début de culture - stade initial (IS), follicules avec une rupture complète de la membrane de Slavjanski (RMS) et follicules avec une cavité similaire à l'antrum (FA).Après un préfractionnement par IEF et une analyse LC-MS/MS en deux configurations (1D et 2D), 1403 protéines ont pu être identifiées dans le follicule ovarien de souris. 43,4 % (609) des protéines identifiées étaient communes aux trois stades et d'autres ont été identifiées uniquement à un stade : 71 au stade IS, 182 au stade RMS et 193 au stade FA. De plus, on a identifié 365 protéines qui n'avaient pas été décrites antérieurement dans le protéome de l'ovocyte ce qui pourrais indiquer qu'elles sont exprimées dans les cellules somatiques du follicule. Des analyses qualitatives et quantitatives complémentaires ont démontré une surreprésentation pour 44 fonctions biologiques par rapport aux fonctions biologiques des gènes constituant le génome de Mus musculus et mis en évidence des différences d'expression et d'abondance des protéines liées au cycle cellulaire, à la fixation des ions de calcium et à la glycolyse selon le stade de développement. Ces résultats représentent un point de départ pour beaucoup d'autres études de caractérisation moléculaire du développement folliculaire.

No / Here we report the identification and approximate quantification of cytochrome P450 (CYP) proteins in human liver microsomes as determined by nano-LC-MS/MS with application of the exponentially modified protein abundance index (emPAI) algorithm during database searching. Protocols based on 1D-gel protein separation and 2D-LC peptide separation gave comparable results. In total, 18 CYP isoforms were unambiguously identified based on unique peptide matches. Further, we have determined the absolute quantity of two CYP enzymes (2E1 and 1A2) in human liver microsomes using stable-isotope dilution mass spectrometry, where microsomal proteins were separated by 1D-gel electrophoresis, digested with trypsin in the presence of either a CYP2E1- or 1A2-specific stable-isotope labeled tryptic peptide and analyzed by LC-MS/MS. Using multiple reaction monitoring (MRM) for the isotope-labeled tryptic peptides and their natural unlabeled analogues quantification could be performed over the range of 0.1-1.5 pmol on column. Liver microsomes from four individuals were analyzed for CYP2E1 giving values of 88-200 pmol/mg microsomal protein. The CYP1A2 content of microsomes from a further three individuals ranged from 165 to 263 pmol/mg microsomal protein. Although, in this proof-of-concept study for CYP quantification, the two CYP isoforms were quantified from different samples, there are no practical reasons to prevent multiplexing the method to allow the quantification of multiple CYP isoforms in a single sample.