L'activation des cellules B est connue pour s’accompagner de remodelages des gènes d’immunoglobulines qui permettent la maturation d'affinité des régions variables d'Ig par hypermutation somatique SHM et la commutation de classe CSR. Ces deux processus sont sous le contrôle de la région régulatrice 3’ (3’RR) du locus IgH. Pendant la CSR, le locus IgH subit des changements tridimensionnels mettant les régions switch ciblés par AID à proximité de la région 3’RR afin de faciliter la recombinaison. La sous-unité MED1 du complexe Médiateur favorise cette interaction à longue distance avec la 3’RR mais elle intervient aussi dans la transcription germinale qui précède la CSR afin de faciliter l’activité d’AID. Comme récemment démontré chez la souris, la région 3’RR peut aussi être ciblée par des recombinaison médiée par AID, mais contrairement à la CSR, ce type de recombinaison qui joint la région Sμ et la 3’RR et qui s’appelle recombinaison suicide du locus IgH ou LSR entraîne une délétion complète de l’ensemble des gènes constants conduisant à la mort des cellules B par la perte de l’expression du BCR. Nous montrons maintenant que la LSR médiée par AID se produit aussi dans les cellules B humaines activées avec les deux régions 3’RR (3’RR1 en aval de Cα1 et 3’RR2 en aval de Cα2) et qui peut toucher l’allèle fonctionnel mais elle peut aussi être biallélique marqué par une quasi-absence de ce type de recombinaison dans les plasmocytes de la moelle mais aussi dans les cellules B mémoires quiescents du sang et qui peut par contre être réinduite à haut niveau lorsque les cellules B mémoires sont réactivées. Toutes nos conditions de stimulation utilisées in-vitro induit la LSR, sans permettre de discerner comment se fait « le choix » entre la CSR et la LSR. Nos résultats montrent par contre que la sous-unité MED1 semble influencer la transcription de la 3’RR et la recombinaison LSR chez la souris. L’inactivation conditionnelle de MED1 influence l’accessibilité transcriptionnelle et donc les recombinaisons sans affecter les marques épigénétiques du locus IgH. Cette étude de MED1 a aussi révélé que l’ensemble des processus stimulés par l’IgH 3’RR sont « Médiateur-dépendants » (SHM, CSR sans distinction de la cis et la trans-CSR, expression augmentée du locus dans les plasmocytes…), comme semble l’être également le processus de choix des segments variables au cours des réarrangements VHDJH. / B-cell activation is accompanied by remodeling of immunoglobulin genes resulting in affinity maturation of Ig variable regions by somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR). These two processes are under the control of the 3' regulatory region (3’RR) of the IgH locus. During CSR, the IgH locus undergoes three dimensional changes bringing the AID-targeted switch regions near the 3'RR region to facilitate recombination. The MED1 subunit of the Mediator complex promotes this long-distance interaction with the 3'RR, but it is also implicated in germinal transcription preceding CSR in order to facilitate AID activity. As recently demonstrated in mice, the 3'RR region can also be targeted by AID-mediated recombination, but unlike CSR, this type of recombination joining the Sμ region and 3'RR (called Locus Suicide Recombination or LSR) results in a complete deletion of all the constant genes leading to B-cell death by loss of B Cell Receptor expression. We now show that AID-mediated LSR also occurs in activated human B cells with the two 3'RR (3'RR1downstream of Cα1 and 3'RR2 downstream of Cα2) and affects the functional allele. It can also be bi-allelic marked by the absence of this type of recombination in plasma cells of the bone marrow but also in quiescent blood memory B cells. LSR occurs at high level when the memory B cells are reactivated. All in-vitro stimulations induce LSR, without identifying conditions favoring either CSR and the LSR. Our results also show that the MED1 subunit appears to influence 3’ RR transcription and LSR in mice. Conditional inactivation of MED1 influences transcriptional accessibility and therefore recombination without affecting epigenetic markers of the IgH locus. This study also revealed that all the processes controlled by the 3'RR are "mediator -dependent" (SHM, CSR without distinction between Cis and Trans -CSR, increased expression of the IgH locus in the plasma cells ...), as well as the choice of varia ble segments during VDJH rearrangements

Le locus des chaînes lourdes d’immunoglobulines (IgH) subit trois processus de remaniements géniques durant la lymphopoïèse B. Ces événements induisent des cassures de l’ADN potentiellement oncogéniques, d’où la nécessité d’une régulation extrêmement stricte. Ceci est dû aux deux principaux éléments cis-régulateurs du locus IgH. L’enhancer 5’Eµ régule les recombinaisons VHDJH qui établissent un répertoire antigénique fonctionnel lors des phases précoces. La région régulatrice en 3’ (3’RR) est essentielle aux hypermutations somatiques (SHM) et à la recombinaison de classe (CSR) aux stades tardifs, modifiant respectivement, l’affinité et les fonctions effectrices de l’Ig. La plupart des lymphomes B matures portent les stigmates de translocations d’oncogènes au locus IgH. Le but de ma thèse a été de mieux comprendre les interactions transcriptionelles entre les enhancers Eµ et 3’RR et évaluer si le ciblage de cette dernière pourrait se révéler une approche thérapeutique potentielle. Nous avons démontré que la 3’RR est l’élément essentiel qui contrôle la transcription du locus IgH dans les lymphocytes B matures. Elle est dispensable lors des phases initiales (recombinaisons VHDJH), mais agit comme silencer sur l’expression des segments DJH. L’analyse de la lymphomagenèse dans trois modèles murins porteurs d’une insertion de Myc en trois points du locus IgH a montré des différences dans les cinétiques d’émergence des lymphomes, leurs phénotypes et index de prolifération. L’effet de la 3’RR sur l’oncogène est suffisant pour l’émergence de lymphomes B. Son absence ne semble pas être préjudiciable au développement de réactions inflammatoires/immunes. Son ciblage pourrait donc se révéler une approche thérapeutique intéressante pour diminuer son activité transcriptionelle sur l’oncogène transloqué. Un rôle potentiel des inhibiteurs des histones désacétylases est à l’étude. / The immunoglobulin heavy chain locus (IgH) undergoes several changes along B-cell differentiation. VHDJH recombinations during the early stages give the diversity of the antigenic repertoire. Somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR) during late stages allow affinity maturation and the acquisition of new effectors functions. These rearrangements are highly regulated and are under the control of the IgH locus cis-regulatory elements. The 5’ Eµ enhancer is important for VHDJH recombination. The 3’ regulatory region (3’ RR) is essential for both CSR and SHM. These events induce breaks into the IgH locus, making it a hotspot for oncogenic translocations. The aim of my thesis was to understand the transcriptional interactions between Eμ and 3'RR enhancers and to evaluate whether the targeting of the latter could be of a potential therapeutic approach. We have demonstrated that 3'RR is essential to control IgH transcription in mature B cells. It is dispensable during the initial stages of developement (VHDJH recombinations). At the pro-B cell stage, it has a silencer effect rather than a transcriptional one on the DJH segments expression. The analysis of lymphomagenesis in three mice models carrying an insertion of Myc in different locations at the IgH locus showed significant differences in lymphoma kinetics, phenotypes and proliferation index. 3'RR alone, as a major transcriptional activator of the IgH locus, is capable of leading to B-cell lymphomas. Its absence is not detrimental for the development of classical inflammatory/immune reactions. Its targeting may be of a potentially interesting therapeutic approach to decrease its transcriptional activity on the translocated oncogene. A potential role for histone deacetylase inhibitors is under study.

Durant l’ontogénie B, le locus des chaines lourdes d’immunoglobulines (IgH) subit trois processus de réarrangements géniques. Lors des phases précoces du développement B, indépendamment de la rencontre avec un antigène, les réarrangements VDJ permettent l’obtention d’un répertoire d’Ig fonctionnelles. Lors des phases tardives, l’hypermutationsomatique (SHM) permet l’augmentation de l’affinité de l’Ig pour son antigène tandis que larecombinaison isotypique (CSR) modifie ses fonctions effectrices. Ces évènements impliquent l’induction de lésions de l’ADN potentiellement oncogéniques, ce qui impose unerégulation très stricte. Cette régulation est assurée par divers éléments cis-régulateurs répartis tout au long du locus IgH, dont la région régulatrice en 3’ (3’RR). La 3’RR s’étend sur 30 kb et contient quatre activateurs transcriptionnels, les trois premiers formant une structure palindromique. Lors de ma thèse, j’ai utilisé plusieurs modèles murins porteurs de délétions de tout ou partie de la 3’RR pour étudier son rôle, ainsi que celui des différents éléments qui la compose lors des diverses étapes de l’ontogénie B. Nous avons pu déterminer comment la 3’RR régule précisément la CSR en ciblant spécifiquement la région switch acceptrice et caractériser le phénomène encore peu connu de CSR vers IgD. D’autre part, nous avons démontré l’importance de la 3’RR lors de la SHM et dans le développement des différentes sous populations lymphocytaires B. Enfin, la comparaison des résultats obtenus lors de l’analyse des différents modèles nous a permis de déterminer que la structure palindromique de la 3’RR est importante pour une SHM efficace, mais relativement dispensable lors de la CSR. / During B-cell development, the heavy chains locus (IgH) undergoes three genic rearrangement events. During the early stages, before encountering the antigen, VDJ rearrangements allow the generation of a functional Ig repertoire. During the late stages, somatic hypermutation (SHM) increases the affinity of the Ig for its antigen, while class switch recombination (CSR) modifies its effector functions. These events imply thegeneration of potentially oncogenic DNA lesions, and thus require a strict regulation. This regulation is assured by several cis-regulatory elements spread along the IgH locus, including the 3’ regulatory region (3’RR). The 3’RR extends on more than 30kb and contains four transcriptional enhancers, the first three displaying a palindromic conformation. During my PhD, I investigated several mouse models carrying deletion of part or totality of the 3’RR to investigate its role during B cell development. We demonstrated how she precisely regulates CSR by specifically targeting the acceptor switch region, and described the poorly known mechanism of CSR toward IgD. Otherwise, we have demonstrated its importance during SHM and in the correct development of the different B cell subpopulations. Finally, by comparing the results obtained during the analysis of the various mouse models, we have demonstrated that the palindromic structure of the 3’RR is required for optimal SHM, but not for CSR.

Durant l’ontogénie B, le locus des chaînes lourdes d’immunoglobulines (IgH) subit trois processus majeurs de réarrangements géniques. Lors de la phase précoce du développement B, indépendamment de la rencontre avec un antigène (Ag), les recombinaisons VHDJH donnent le répertoire diversifié des Ig fonctionnelles. Durant la phase tardive, suite à une activation par l’Ag, l’hypermutation somatique (SHM) permet l’augmentation de l’affinité de l’Ig à son Ag et la recombinaison isotypique (CSR) va modifier ses fonctions effectrices. Tous ces processus sont strictement régulés par différents éléments cis-régulateurs repartis tout au long du locus IgH. La région régulatrice en 3’ (3’RR) en est un. Elle s’étend sur environ 30 Kb et est constituée de quatre activateurs transcriptionnels, dont les trois premiers forment une structure palindromique. La 3’RR contrôle, chez le lymphocyte B-2 (LB-2), la transcription du locus IgH, le devenir de la cellule B, la SHM et la CSR mais elle n’a aucun effet sur les recombinaisons VHDJH et la diversité du répertoire antigénique. Les LB-1 représentent un petit pourcentage des LB totaux. Ils diffèrent des LB-2 par leur origine, développement, fonctions, marqueurs de surface et distribution tissulaire. Les LB-1 maintiennent l'homéostasie dans l'organisme et sont la source principale des Ig naturelles (NIgM et NIgA) au cours des premières phases d'une réponse immunitaire. Lors de ma thèse, nous avons étudié le rôle de la 3’RR sur le développement des LB-1. D’une façon identique aux LB-2, la 3’RR contrôle la transcription du locus IgH, le devenir des cellules B et la SHM dans les LB-1. A l’inverse des LB-2, la 3’RR joue un rôle indirect sur la diversité du répertoire antigénique dans les LB-1 et n’a aucun effet sur la CSR vers IgA. Ces résultats mettent en évidence, pour la première fois, la contribution de la 3'RR dans le développement d’une population cellulaire B à l’interface entre l’immunité innée et acquise. Ils renforcent nos connaissances sur le rôle des éléments cis-régulateurs du locus IgH dans le développement de ces deux immunités. / During B-cell development, the immunoglobulin heavy chain locus (IgH) undergoes three major genic rearrangements. During the early stages, before encountering the antigen (Ag), VHDJH rearrangements allow the generation of the Ig repertoire. During the late stages, after encountering the Ag, somatic hypermutation (SHM) increases the affinity of the Ig for its Ag, while class switch recombination (CSR) modifies its effector functions. All these genetic events are strictly regulated by cis-regulatory elements spread along the IgH locus, including the 3’ regulatory region (3’RR). The 3’RR extends over more than 30kb and contains four transcriptional enhancers, the first three displaying a palindromic conformation. The 3'RR controls B2 B-cell IgH transcription, cell fate, SHM and CSR but not repertoire diversity. B1 B-cells represent a small percentage of total B-cells differing from B2 B-cells by several points such as precursors, development, functions, surface markers and tissue distribution. B1 B-cells act at the steady state to maintain homeostasis and during the earliest phases of an immune response by secreting natural Ig (NIgM and NIgA). During my PhD, we investigated the role of the 3'RR on B1 B-cells. Similarly to B2 B-cells, the 3'RR controls IgH transcription, cell fate and SHM in B1 B-cells. In contrast to B2 B-cells, 3'RR deletion indirectly affects B1 B-cell repertoire diversity and has no effect on their CSR towards IgA. These results highlight, for the first time, the contribution of the 3'RR in the development of a B-cell population at the interface between innate and acquired immunity. Moreover, these results strengthen our knowledge of the role of the cis-regulatory elements of the IgH locus in the development of these two immune responses.

La maturation lymphocytaire B est sous le contrôle des éléments cis-régulateurs des gènes d’Ig. Les quatre activateurs transcriptionnels (hs3a, hs1,2, hs3b et hs4) de la région régulatrice en 3’ du locus IgH (3’RR) murin sont les éléments clés pour les hypermutations somatiques (SHM) et les recombinaisons isotypiques (CSR). La 3’RR stimule aussi la transcription d’Ig au stade mature du développement B. La 3’RR, en association avec un oncogène, est un dérégulateur puissant conduisant au développement de lymphomes B. Actuellement rien n’est connu sur le rôle de la 3’RR lors de réactions immunes et/ou inflammatoires normales. Durant ma thèse, nous avons étudié l’impact de la délétion de la 3’RR sur le développement d’une réaction inflammatoire en réponse au pristane chez les souris BALB/c. Ces études nous ont permis de montrer que l’absence de la 3’RR ne perturbe pas l’apparition d’une réaction inflammatoire (cinétique de l’ascite, volume, cellularité, recrutement en cellules inflammatoires et leur capacité à produire des cytokines inflammatoires et anti-inflammatoires). Ceci suggère la présence de lymphocytes B physiologiquement aptes à induire/propager/maintenir une réaction inflammatoire et immune robuste et efficiente en absence d’une 3’RR fonctionnelle. Après avoir étudié le rôle de la délétion de la 3’RR dans un contexte inflammatoire, nous avons analysé son rôle dans un contexte de lymphomagenèse. Pour cela nous avons mis l’absence de la 3’RR dans un fond génétique murin apte à développer des lymphomes B matures (souris Igλ-Myc). On observe un changement important dans le phénotype des lymphomes B en absence de la 3’RR avec un plus grand nombre de lymphomes B immatures, une baisse du nombre de lymphomes B matures CD43+ et une augmentation de lymphomes B CD5+. Le rôle de la 3’RR dans la survenue de mutations aux stades B matures durant la SHM et la CSR est suggéré pour expliquer ces résultats. En conclusion, le ciblage pharmacologique de la 3’RR pour bloquer son effet pro-oncogènique transcriptionnel sur un oncogène transloqué au locus IgH pourrait se révéler une approche prometteuse pour le traitement de certains lymphomes B matures humains. / B-cell maturation is under the control of the cis-regulatory elements of Ig genes. The four transcripional enhancers (hs3a, hs1,2, hs3b and hs4) of the mouse IgH 3’ regulatory region (3’RR) are the key elements for somatic hypermutation (SHM) and class-switch recombination (CSR). The 3'RR also stimulates Ig transcription during the mature B-cell stage. When associated with an oncogene, the 3’RR is a potent deregulator leading to B-cell lymphomas. Currently nothing is known about its role in the development of immune and inflammatory reactions. During my thesis, we have studied the impact of the 3’RR deletion on the development of inflammatory reactions in response to pristane in BALB/c mice. These studies have allowed us to show that the lack of the 3'RR does not disturb the development of an efficient inflammatory reaction in response to pristane (kinetics of appearance of ascites, volume, cellularity, recruitment of inflammatory cells and their capacity to produce inflammatory and anti-inflammatory cytokines). This suggests the presence of B-cells physiologically capable to induce/spread/maintain a robust and efficient inflammatory immune response. After studying the role of the deletion of the 3'RR in an inflammatory context we have investigated the role of the 3’RR in a lymphomagenesis. For this we brought the 3’RR deficiency in a genetic background able to develop mature B-cell lymphomas (Igλ-Myc mice). While wt mice develop mature and immature B-cell lymphomas, 3’RR-deficient mice exhibit a strong preference for immature lymphomas. Furthermore 3’RR-deficiency leads to a lowered frequency of CD43+ activated B-cell lymphomas and to an increased frequency of CD5+ B-cell lymphomas. CSR and SHM are abrogated in 3’RR-deficient mice lowering the probability of oncogenic mutations during these stages. Pharmacological targeting of 3'RR to block its transcriptional pro-oncogenic effect on translocated oncogene into IgH locus might be a promising approach for the treatment of some mature human B-cell lymphomas.