No description available.

A artrite induzida por pristane (PIA) em camundongos AIRmax homozigotos para o alelo R e S do gene Slc11a1 foi usada para avaliar a influência do polimorfismo deste gene na resposta imune, mais especificamente na ativação de macrófagos peritoneais durante a PIA. Estudos anteriores mostraram que a presença do alelo S do gene Slc11a1 aumentou a incidência e a severidade da PIA em AIRmaxSS, sugerindo que este gene ou outro próximo esteja interagindo com o loci da inflamação para modular a PIA. O tratamento com pristane nos animais AIRmaxSS induziu infiltrado intenso composto por linfócitos, monócitos/macrófagos e neutrófilos. Macrófagos AIRmaxSS apresentaram perfis de expressão gênica e celular exacerbados durante a PIA, com expressão/produção elevada de H2O2, NO, IL-1b, IL-6, TNF-a e várias quimiocinas. Entretanto, o alelo R do gene Slc11a1 foi capaz de regular a intensidade de ativação do macrófago de forma mais eficiente que o alelo S e controlar desenvolvimento da artrite. Houve acometimento do rim, pulmão e timo durante a PIA. Nossos dados sugerem que o gene Slc11a1 modula a ativação dos macrófagos envolvidos na suscetibilidade a PIA e estas linhagens representam um modelo murino alternativo para o estudo da artrite reumatoide. / Pristane-induced arthritis (PIA) in AIRmax mice homozygous for Slc11a1 R and S allele was used in this study to characterize the role of Slc11a1 polymorphisms on immune response, more specifically in the activation of peritoneal macrophages during PIA. Previous reports showed the presence of S allele of Slc11a1 increased the incidence and severity PIA in AIRmaxSS, suggesting that this gene or another closed-linked gene interacts with inflammatory loci to modulate PIA. Pristane treatment induced intense infiltration of lymphocytes, monocytes/macrophages and neutrophils in AIRmaxSS animals. AIRmaxSS macrophages demonstrated exacerbated cellular and gene expression profiles during PIA, with higher expression/production of H2O2, NO, IL-1b, IL-6, TNF-a and chemokines. However, Slc11a1 R allele could be regulating macrophage activation intensity more efficiently than the S allele and control the development of arthritis. There was involvement of kidney, lung and thymus during PIA. Our data suggest that the Slc11a1 gene modulates macrophage activation involved in PIA susceptibility and these lines represent an alternative murine model of rheumatoid arthritis.

A artrite induzida por pristane (PIA) em camundongos AIRmax homozigotos para o alelo R e S do gene Slc11a1 foi usada para avaliar a influência do polimorfismo deste gene na resposta imune, mais especificamente na ativação de macrófagos peritoneais durante a PIA. Estudos anteriores mostraram que a presença do alelo S do gene Slc11a1 aumentou a incidência e a severidade da PIA em AIRmaxSS, sugerindo que este gene ou outro próximo esteja interagindo com o loci da inflamação para modular a PIA. O tratamento com pristane nos animais AIRmaxSS induziu infiltrado intenso composto por linfócitos, monócitos/macrófagos e neutrófilos. Macrófagos AIRmaxSS apresentaram perfis de expressão gênica e celular exacerbados durante a PIA, com expressão/produção elevada de H2O2, NO, IL-1b, IL-6, TNF-a e várias quimiocinas. Entretanto, o alelo R do gene Slc11a1 foi capaz de regular a intensidade de ativação do macrófago de forma mais eficiente que o alelo S e controlar desenvolvimento da artrite. Houve acometimento do rim, pulmão e timo durante a PIA. Nossos dados sugerem que o gene Slc11a1 modula a ativação dos macrófagos envolvidos na suscetibilidade a PIA e estas linhagens representam um modelo murino alternativo para o estudo da artrite reumatoide. / Pristane-induced arthritis (PIA) in AIRmax mice homozygous for Slc11a1 R and S allele was used in this study to characterize the role of Slc11a1 polymorphisms on immune response, more specifically in the activation of peritoneal macrophages during PIA. Previous reports showed the presence of S allele of Slc11a1 increased the incidence and severity PIA in AIRmaxSS, suggesting that this gene or another closed-linked gene interacts with inflammatory loci to modulate PIA. Pristane treatment induced intense infiltration of lymphocytes, monocytes/macrophages and neutrophils in AIRmaxSS animals. AIRmaxSS macrophages demonstrated exacerbated cellular and gene expression profiles during PIA, with higher expression/production of H2O2, NO, IL-1b, IL-6, TNF-a and chemokines. However, Slc11a1 R allele could be regulating macrophage activation intensity more efficiently than the S allele and control the development of arthritis. There was involvement of kidney, lung and thymus during PIA. Our data suggest that the Slc11a1 gene modulates macrophage activation involved in PIA susceptibility and these lines represent an alternative murine model of rheumatoid arthritis.

Plantas do gênero Alternanthera (Amaranthaceae) vêm sendo estudadas por suas propriedades antiparasitária, antibacteriana e antiviral. No Brasil a planta Alternanthera tenella Colla, objeto de nossa investigação, é utilizada na medicina popular por possuir atividade antiinflamatória. Considerando a importância do sistema imunológico em infecções e em doenças auto-imunes sistêmicas que apresentam intensa reação inflamatória, o objetivo do atual estudo foi investigar a ação imunomoduladora de extratos de A. tenella no sistema imune de camundongos BALB/c e sua atividade em modelo de artrite experimental induzida pelo óleo mineral pristane (2,6,10,14-tetrametilpentadecano) em camundongos AIRmax, obtidos por seleção genética para reação inflamatória aguda máxima. Extratos brutos orgânicos (etanólico e hexânico), aquosos, frações e flavonóides foram inoculados via intraperitoneal em camundongos BALB/c imunizados ou não com eritrócitos de carneiro (EC). Efeitos imunomoduladores e imunotóxicos foram avaliados através da determinação do peso corporal e dos órgãos linfóides, celularidade do baço e de ensaios funcionais como enumeração de células formadoras de placas (PFC, plaque forming cells), produção de anticorpos anti-EC e edema de pata induzido por carragenina. Posteriormente foram avaliados os efeitos dos extratos aquosos nas subpopulações de linfócitos esplênicos (CD3, CD4, CD8 e CD19), na expressão de marcadores de ativação de linfócitos (CD25, CD40, CD45RB e CD69) e na indução de apoptose nessas células. Os extratos avaliados não induziram alterações no peso dos animais e dos órgãos (baço, timo e fígado) após 4 e 14 dias. Animais imunizados com EC e tratados com o flavonóide 2-O--L-ramnopiranosilvitexina (15 mg/kg), isolado de extrato bruto etanólico (E) ou com o extrato aquoso extraído a frio (AF - 100 mg/kg) apresentaram aumento significativo (p<0,05) no número de PFC anti-EC em comparação aos controles. Os extratos E e AF induziram aumento no título de anticorpos circulantes anti-EC das classes IgG e IgM. Estes resultados sugerem atividade imunoestimulante. Ambos os extratos aquosos, AF e extraído a quente (AQ), apresentaram atividade antiinflamatória no edema de pata induzido por carragenina, principalmente AF que demonstrou efeito dose-dependente (50% e 61% de inibição do edema nas doses de 200 mg/kg e 400 mg/kg, respectivamente). Estes extratos em camundongos BALB/c normais não induziram apoptose, alterações nas subpopulações de linfócitos e não modificaram a expressão de marcadores de ativação em linfócitos T e B. Com base nestes resultados, o extrato AF foi selecionado para utilização nos experimentos em camundongos AIRmax, para investigação de suas possíveis atividades moduladora e/ou terapêutica na artrite induzida por pristane. Os animais que foram tratados com seis doses de 200 mg/kg do extrato AF antes das injeções do pristane (G1, n=15) apresentaram menor incidência de artrite em comparação ao grupo controle positivo, composto por animais que receberam apenas pristane (G4, n=15) (54,5% e 70%, respectivamente). A porcentagem de animais que apresentaram deformidade nas articulações, também foi menor no grupo G1 (18,2%) em comparação ao G4 (30%). Os animais que receberam apenas o extrato (G3, n=14) não apresentaram artrite. Adicionalmente, AF conferiu atividade protetora ao desenvolvimento de ascite, processo inflamatório que também pode ser induzido pelo óleo mineral. As taxas de incidência de ascite nos animais tratados previamente (G1) bem como nos animais tratados após (G2, n=16) as injeções de pristane foram menores do que a do grupo controle positivo (G1=18,2%, G2=6,7% e G4= 50%). Ressalta-se que os índices de sobrevivência nos grupos de animais que receberam o extrato foram superiores ao grupo controle positivo (G1= 86,7%; G2= 93,7%; G4= 60,0%). A taxa de sobrevivência do grupo G3 foi de 100% ao final do experimento. Esses efeitos moduladores do extrato no processo da artrite parecem não ser dependentes da modulação de marcadores de ativação de linfócitos T, nem de alterações nas subpopulações dessas células (CD4+, CD8+, T regulatórias). Tampouco dependeram da indução de apoptose nos linfócitos esplênicos, conforme avaliado pelas técnicas da anexina V e análise da fragmentação de DNA. Entretanto, aumentos na porcentagem de células B/CD69+ sugerem possível participação destas células no processo de modulação da doença. Analisados conjuntamente, os resultados apresentados sugerem que alguns dos produtos vegetais avaliados podem modular a função de linfócitos B, além de apresentarem importante atividade antiinflamatória em edema de pata induzido por carragenina. Adicionalmente, o extrato AF apresentou ação moduladora na artrite induzida por pristane. Esses resultados fornecem subsídios para o entendimento das atividades biológicas da Alternanthera tenella e para a validação científica do seu uso popular / Antiparasitic, antibacterial and antiviral activities in plants of the Alternanthera genus (Amaranthaceae) have been studied. In Brasil, Alternanthera tenella Colla are used in popular medicine as an anti-inflammatory agent. Considering the importance of the immune system in infectious and systemic autoimmune diseases showing intense inflammatory reaction, the objective of this study was to investigate the immunomodulatory activity of A. tenella extracts in BALB/c mice. The plant extracts were also tested in a mineral pristane oil (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) induced arthritis model in AIRmax mice, genetically selected for maximal acute inflammatory reactions. Organic solvent crude extracts (ethanol and hexane), aqueous fractions and isolated flavonoids were intraperitoneally inoculated in BALB/c mice immunized or not with sheep red blood cells (SRBC). Immunomodulatory and immunotoxic effects were evaluated by determining body and lymphoid organ weights, splenic cellularity and through functional assays like plaque-forming cells (PFC), antibody anti-SRBC production and carrageenan-induced paw edema. The effects of aqueous extracts on splenic lymphocyte subtypes (CD3, CD4, CD8 and CD19) and apoptosis detection in these cells were further evaluated. The extracts tested did not induce changes in body and organ (spleen, thymus and liver) weights 4 and 14 days after administration. PFC numbers were significantly increased (p<0,05) in SRBC immunized animals treated with 15mg/kg 2-O--L-ramnopiranosilvitexina, a flavonoid isolated from the etanolic (E) crude extract or with the cold aqueous extract (CAE 100 mg/kg) when compared to the controls. The E and CAE extracts induced increased anti-SRBC IgG and IgM circulating antibody titers, suggesting immunostimulatory activity. Aqueous extracts, CAE and hot aqueous extract (HAE), had significant anti-inflammatory activity in the carrageenan paw edema, especially CAE, which showed a dose-related effect (50% and 61% edema inhibition in dosages of 200 mg/kg and 400 mg/kg, respectively). In normal BALB/c mice the extracts did not induce apoptosis or changes in lymphocyte subtypes and T and B activation markers. Based on these results, CAE was selected for tests of modulatory and /or therapeutic activity in a model of pristane induced arthritis in AIRmax mice. Animals (G1, n=15) treated with six doses of CAE (200 mg/kg) before pristane injections showed smaller arthritis incidence when compared to the control positive group receiving pristane only (G4, n=15) (54,4% and 70%, respectively). Percentage of animals showing joint deformities was smaller in G1 (18,2%) in comparison to G4 (30%). The animals receiving extract only (G3, n=14) did not show signs of arthritis. In addition, CAE showed protective activity against ascites development, an inflammatory process that may be induced by the mineral oil. The arthritis incidence index, both in CAE previously treated animals (G1) and in animals treated after pristane injections (G2, n=16), was smaller than in the positive control group (G1=18,2% and G2=6,7% x G4= 50%). It is noteworthy that extract- treated animals, in both groups, also had a higher survival index when compared to the positive control group (G1= 81,9% and G2= 90,8% x G4= 40,2%). The survival index in the G3 group was 100% up to the end of the experiments. The extract modulatory effects in arthritis do not seem to be dependent on the modulation of T lymphocyte activation markers, or on changes in T cells subtypes (CD4+, CD8+, regulatory T cells). Also, they did not depend on apoptosis induction in splenic lymphocytes as evaluated by annexin V and analysis of DNA degradation techniques. However, the percentage increase of B/CD69+ cells suggest their participation in the modulatory process. Together, the results suggest that some of the evaluated plant-derived products may modulate B lymphocyte functions, besides showing important anti-inflammatory activity in carrageenan paw edema. In addition, CAE showed modulatory action in pristane induced arthritis. These results contribute to the understanding of Alternanthera tenella biological activities and provide scientific validation to its popular use.

Plantas do gênero Alternanthera (Amaranthaceae) vêm sendo estudadas por suas propriedades antiparasitária, antibacteriana e antiviral. No Brasil a planta Alternanthera tenella Colla, objeto de nossa investigação, é utilizada na medicina popular por possuir atividade antiinflamatória. Considerando a importância do sistema imunológico em infecções e em doenças auto-imunes sistêmicas que apresentam intensa reação inflamatória, o objetivo do atual estudo foi investigar a ação imunomoduladora de extratos de A. tenella no sistema imune de camundongos BALB/c e sua atividade em modelo de artrite experimental induzida pelo óleo mineral pristane (2,6,10,14-tetrametilpentadecano) em camundongos AIRmax, obtidos por seleção genética para reação inflamatória aguda máxima. Extratos brutos orgânicos (etanólico e hexânico), aquosos, frações e flavonóides foram inoculados via intraperitoneal em camundongos BALB/c imunizados ou não com eritrócitos de carneiro (EC). Efeitos imunomoduladores e imunotóxicos foram avaliados através da determinação do peso corporal e dos órgãos linfóides, celularidade do baço e de ensaios funcionais como enumeração de células formadoras de placas (PFC, plaque forming cells), produção de anticorpos anti-EC e edema de pata induzido por carragenina. Posteriormente foram avaliados os efeitos dos extratos aquosos nas subpopulações de linfócitos esplênicos (CD3, CD4, CD8 e CD19), na expressão de marcadores de ativação de linfócitos (CD25, CD40, CD45RB e CD69) e na indução de apoptose nessas células. Os extratos avaliados não induziram alterações no peso dos animais e dos órgãos (baço, timo e fígado) após 4 e 14 dias. Animais imunizados com EC e tratados com o flavonóide 2-O--L-ramnopiranosilvitexina (15 mg/kg), isolado de extrato bruto etanólico (E) ou com o extrato aquoso extraído a frio (AF - 100 mg/kg) apresentaram aumento significativo (p<0,05) no número de PFC anti-EC em comparação aos controles. Os extratos E e AF induziram aumento no título de anticorpos circulantes anti-EC das classes IgG e IgM. Estes resultados sugerem atividade imunoestimulante. Ambos os extratos aquosos, AF e extraído a quente (AQ), apresentaram atividade antiinflamatória no edema de pata induzido por carragenina, principalmente AF que demonstrou efeito dose-dependente (50% e 61% de inibição do edema nas doses de 200 mg/kg e 400 mg/kg, respectivamente). Estes extratos em camundongos BALB/c normais não induziram apoptose, alterações nas subpopulações de linfócitos e não modificaram a expressão de marcadores de ativação em linfócitos T e B. Com base nestes resultados, o extrato AF foi selecionado para utilização nos experimentos em camundongos AIRmax, para investigação de suas possíveis atividades moduladora e/ou terapêutica na artrite induzida por pristane. Os animais que foram tratados com seis doses de 200 mg/kg do extrato AF antes das injeções do pristane (G1, n=15) apresentaram menor incidência de artrite em comparação ao grupo controle positivo, composto por animais que receberam apenas pristane (G4, n=15) (54,5% e 70%, respectivamente). A porcentagem de animais que apresentaram deformidade nas articulações, também foi menor no grupo G1 (18,2%) em comparação ao G4 (30%). Os animais que receberam apenas o extrato (G3, n=14) não apresentaram artrite. Adicionalmente, AF conferiu atividade protetora ao desenvolvimento de ascite, processo inflamatório que também pode ser induzido pelo óleo mineral. As taxas de incidência de ascite nos animais tratados previamente (G1) bem como nos animais tratados após (G2, n=16) as injeções de pristane foram menores do que a do grupo controle positivo (G1=18,2%, G2=6,7% e G4= 50%). Ressalta-se que os índices de sobrevivência nos grupos de animais que receberam o extrato foram superiores ao grupo controle positivo (G1= 86,7%; G2= 93,7%; G4= 60,0%). A taxa de sobrevivência do grupo G3 foi de 100% ao final do experimento. Esses efeitos moduladores do extrato no processo da artrite parecem não ser dependentes da modulação de marcadores de ativação de linfócitos T, nem de alterações nas subpopulações dessas células (CD4+, CD8+, T regulatórias). Tampouco dependeram da indução de apoptose nos linfócitos esplênicos, conforme avaliado pelas técnicas da anexina V e análise da fragmentação de DNA. Entretanto, aumentos na porcentagem de células B/CD69+ sugerem possível participação destas células no processo de modulação da doença. Analisados conjuntamente, os resultados apresentados sugerem que alguns dos produtos vegetais avaliados podem modular a função de linfócitos B, além de apresentarem importante atividade antiinflamatória em edema de pata induzido por carragenina. Adicionalmente, o extrato AF apresentou ação moduladora na artrite induzida por pristane. Esses resultados fornecem subsídios para o entendimento das atividades biológicas da Alternanthera tenella e para a validação científica do seu uso popular / Antiparasitic, antibacterial and antiviral activities in plants of the Alternanthera genus (Amaranthaceae) have been studied. In Brasil, Alternanthera tenella Colla are used in popular medicine as an anti-inflammatory agent. Considering the importance of the immune system in infectious and systemic autoimmune diseases showing intense inflammatory reaction, the objective of this study was to investigate the immunomodulatory activity of A. tenella extracts in BALB/c mice. The plant extracts were also tested in a mineral pristane oil (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) induced arthritis model in AIRmax mice, genetically selected for maximal acute inflammatory reactions. Organic solvent crude extracts (ethanol and hexane), aqueous fractions and isolated flavonoids were intraperitoneally inoculated in BALB/c mice immunized or not with sheep red blood cells (SRBC). Immunomodulatory and immunotoxic effects were evaluated by determining body and lymphoid organ weights, splenic cellularity and through functional assays like plaque-forming cells (PFC), antibody anti-SRBC production and carrageenan-induced paw edema. The effects of aqueous extracts on splenic lymphocyte subtypes (CD3, CD4, CD8 and CD19) and apoptosis detection in these cells were further evaluated. The extracts tested did not induce changes in body and organ (spleen, thymus and liver) weights 4 and 14 days after administration. PFC numbers were significantly increased (p<0,05) in SRBC immunized animals treated with 15mg/kg 2-O--L-ramnopiranosilvitexina, a flavonoid isolated from the etanolic (E) crude extract or with the cold aqueous extract (CAE 100 mg/kg) when compared to the controls. The E and CAE extracts induced increased anti-SRBC IgG and IgM circulating antibody titers, suggesting immunostimulatory activity. Aqueous extracts, CAE and hot aqueous extract (HAE), had significant anti-inflammatory activity in the carrageenan paw edema, especially CAE, which showed a dose-related effect (50% and 61% edema inhibition in dosages of 200 mg/kg and 400 mg/kg, respectively). In normal BALB/c mice the extracts did not induce apoptosis or changes in lymphocyte subtypes and T and B activation markers. Based on these results, CAE was selected for tests of modulatory and /or therapeutic activity in a model of pristane induced arthritis in AIRmax mice. Animals (G1, n=15) treated with six doses of CAE (200 mg/kg) before pristane injections showed smaller arthritis incidence when compared to the control positive group receiving pristane only (G4, n=15) (54,4% and 70%, respectively). Percentage of animals showing joint deformities was smaller in G1 (18,2%) in comparison to G4 (30%). The animals receiving extract only (G3, n=14) did not show signs of arthritis. In addition, CAE showed protective activity against ascites development, an inflammatory process that may be induced by the mineral oil. The arthritis incidence index, both in CAE previously treated animals (G1) and in animals treated after pristane injections (G2, n=16), was smaller than in the positive control group (G1=18,2% and G2=6,7% x G4= 50%). It is noteworthy that extract- treated animals, in both groups, also had a higher survival index when compared to the positive control group (G1= 81,9% and G2= 90,8% x G4= 40,2%). The survival index in the G3 group was 100% up to the end of the experiments. The extract modulatory effects in arthritis do not seem to be dependent on the modulation of T lymphocyte activation markers, or on changes in T cells subtypes (CD4+, CD8+, regulatory T cells). Also, they did not depend on apoptosis induction in splenic lymphocytes as evaluated by annexin V and analysis of DNA degradation techniques. However, the percentage increase of B/CD69+ cells suggest their participation in the modulatory process. Together, the results suggest that some of the evaluated plant-derived products may modulate B lymphocyte functions, besides showing important anti-inflammatory activity in carrageenan paw edema. In addition, CAE showed modulatory action in pristane induced arthritis. These results contribute to the understanding of Alternanthera tenella biological activities and provide scientific validation to its popular use.

Introdução: O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune multissistêmica de etiologia complexa que envolve fatores ambientais, genéticos e hormonais. É caracterizada pela produção de autoanticorpos e mediadores inflamatórios, ativação e proliferação de células T autorreativas e perda da autotolerância imunológica. Em pacientes com LES, a expressão do receptor primário de ativação CD69 é aumentada e a de células T supressoras/reguladoras (Treg) CD4+CD25+FoxP3+ é reduzida. O CD69 é essencial para ativação de células T CD4 autorreativas enquanto que as células Treg são importantes na manutenção da autotolerância. Desta forma, células T tem um papel central na patogênese do LES, mas os mecanismos implicados na falência da autotolerância ainda não são elucidados, destacando a importância de estudos em modelos experimentais da doença, como o de LES-induzido por pristane. Objetivo: Quantificar células T CD4+CD69+ ativadas e Treg CD4+CD25+FoxP3+ no sangue, baço e LP de camundongos Balb/c LESinduzido por pristane no sentido de avaliar a falência de autotolerância neste modelo. Métodos: Analisamos 84 camundongos Balb/c fêmeas: 52 receberam por via intraperitoneal uma dose única de 0,5 ml de pristane e 32 a mesma dose de salina. Amostras de sangue, baço e LP dos camundongos eutanasiados foram coletadas 90, 120, 180 e 300 (T90, T120, T180 e T300) dias após a inoculação de pristane ou salina. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP), do LP (CMLP) e esplenócitos foram obtidos por lise das hemácias seguida de lavagens com RPMI medium 1640 e centrifugação, e posteriormente criopreservadas até a avaliação por citometria de fluxo usando o aparelho Guava EasyCyteTM HT (Millipore). Para esta etapa, as células foram descongeladas, lavadas com RPMI medium 1640 e incubadas com anticorpos monoclonais dirigidos contra CD3, CD4, CD25, CD28, CD69, CTLA-4, FoxP3, CD14 e Ly6C (BD PharmingenTM). Os resultados foram expressos como média ± DP e teste de Mann-Whitney foi utilizado para análises estatísticas, sendo p<0,05 considerado significante. Resultados: Comparados aos animais controles, animais com LES-induzido por pristane apresentaram aumento de células T CD4+CD69+ no sangue nos T90, T120 e T180 (p < 0,022, p=0,008 e p=0,010, respectivamente) e no baço no T120 (p=0,049), enquanto que, no LP, houve redução destas células nos T120, T180 e T300 (p=0,001, p=0,001 e p < 0,001, respectivamente). A porcentagem de células Treg CD4+CD25+FoxP3+ foi menor no sangue nos T90, T120 e T180 (p=0,018, p=0,012, p < 0,046, respectivamente), no baço, nos T120 e T180 (p=0,018 e p=0,013), e no LP nos T90 e T300 (p=0,008 e p=0,005). Conclusão: Aumento da expressão de células T CD4+CD69+ e redução da expressão de Treg CD4+CD25+FoxP3+ sugerem células T CD4 ativadas e perda da autotolerância periférica em camundongos com LES-induzido por pristane. Estas alterações são semelhantes às observadas no lúpus humano, de modo que demonstramos que este modelo também pode ser útil na avaliação de mecanismos de ativação celular, tolerância periférica desequilíbrio imune homeostático envolvidos no LES / Introduction: Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is multisystemic autoimmune disease with complex etiology that involves environmental, genetic and hormonal factors. Is characterized by auto-antibodies and inflammatory mediators production, autoreactive T cells activation and proliferation and loss of immunogenic autotolerance. In patients with SLE, expression of CD69 activation primary receptor is increased and the CD4+CD25+FoxP3+ suppressor/regulatory T cell (Treg) is reduced. CD69 is essential for activation of autoreactive CD4 T cells while Treg cells are important in autotolerance maintenance. In this way, T cells have a central role in the pathogenesis of SLE however, the mechanisms implied in the autotolerance failure are still not elucidated, highlighting the importance of studies in this disease\'s experimental models, such as pristane-induced SLE. Objective: Quantify activated CD4+CD69+ T cells and CD4+CD25+FoxP3+ Treg in blood, spleen and peritoneal lavage (PL) of Balb/c mice with pristane-induced SLE in order to evaluate autotolerance failure in this model. Methods: 84 female Balb/c mice were analyzed: 52 received a single intraperitoneal 0,5 ml dose of pristane and 32 the same dose of saline. Euthanized mice samples of blood, spleen and peritoneal lavage were collected 90, 120, 180 and 300 (T90, T120, T180 and T300) days after inoculation of pristane or saline. Mononuclear cells from peripheral blood (PBMC), PL (PLMC) and splenocytes were obtained by lysis of erythrocytes followed by washings with RPMI medium 1640 and centrifugation, subsequently criopreserved until evaluation by flow cytometry using the appliance GuavaEasyCyteTM HT (Millipore). For this step, cells were unfrozen, washed with RPMI medium 1640 and incubated with monoclonal antibodies against CD3, CD4, CD25, CD28, CD69, CTLA-4, FoxP3, CD14 and Ly6C (BD PharmingenTM). The results were expressed as mean ± SD and Mann-Whitney 11 test was used for statistical analysis, being considered significant p < 0,05. Results: Compared to control animals, SLE pristane-induced animals presented increase of CD4+CD69+ T cells in blood on T90, T120 and T180 (p=0.022, p=0.008 and p=0.010, respectively) and in spleen on T120 (p=0.049), while, in PL, there was reduction of these cells on T120, T180 and T300 (p=0.001, p=0.001 and p < 0.001, respectively). The porcentage of Treg CD4+CD25+FoxP3+ was smaller in blood on T90, T120 and T180 (p=0.018, p=0.012 and p < 0.046, respectively), in spleen on T120 and T180 (p=0.018 and p=0.013), and in PL on T90 and T300 (p=0.008 and p=0.005). Conclusion: Increase of CD4+CD69+ T cell and reduction of CD4+CD25+FoxP3+ Treg expression suggests activated T CD4 cells and loss of peripheral autotolerance in pristane-induced SLE mice. These alterations are similar to observed in human lupus, in order we showed that this model can also be useful in evaluating the mechanisms of cellular activation, peripheral tolerance and homeostatic immune imbalance involved in the LES

Introdução: O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune multissistêmica de etiologia complexa que envolve fatores ambientais, genéticos e hormonais. É caracterizada pela produção de autoanticorpos e mediadores inflamatórios, ativação e proliferação de células T autorreativas e perda da autotolerância imunológica. Em pacientes com LES, a expressão do receptor primário de ativação CD69 é aumentada e a de células T supressoras/reguladoras (Treg) CD4+CD25+FoxP3+ é reduzida. O CD69 é essencial para ativação de células T CD4 autorreativas enquanto que as células Treg são importantes na manutenção da autotolerância. Desta forma, células T tem um papel central na patogênese do LES, mas os mecanismos implicados na falência da autotolerância ainda não são elucidados, destacando a importância de estudos em modelos experimentais da doença, como o de LES-induzido por pristane. Objetivo: Quantificar células T CD4+CD69+ ativadas e Treg CD4+CD25+FoxP3+ no sangue, baço e LP de camundongos Balb/c LESinduzido por pristane no sentido de avaliar a falência de autotolerância neste modelo. Métodos: Analisamos 84 camundongos Balb/c fêmeas: 52 receberam por via intraperitoneal uma dose única de 0,5 ml de pristane e 32 a mesma dose de salina. Amostras de sangue, baço e LP dos camundongos eutanasiados foram coletadas 90, 120, 180 e 300 (T90, T120, T180 e T300) dias após a inoculação de pristane ou salina. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP), do LP (CMLP) e esplenócitos foram obtidos por lise das hemácias seguida de lavagens com RPMI medium 1640 e centrifugação, e posteriormente criopreservadas até a avaliação por citometria de fluxo usando o aparelho Guava EasyCyteTM HT (Millipore). Para esta etapa, as células foram descongeladas, lavadas com RPMI medium 1640 e incubadas com anticorpos monoclonais dirigidos contra CD3, CD4, CD25, CD28, CD69, CTLA-4, FoxP3, CD14 e Ly6C (BD PharmingenTM). Os resultados foram expressos como média ± DP e teste de Mann-Whitney foi utilizado para análises estatísticas, sendo p<0,05 considerado significante. Resultados: Comparados aos animais controles, animais com LES-induzido por pristane apresentaram aumento de células T CD4+CD69+ no sangue nos T90, T120 e T180 (p < 0,022, p=0,008 e p=0,010, respectivamente) e no baço no T120 (p=0,049), enquanto que, no LP, houve redução destas células nos T120, T180 e T300 (p=0,001, p=0,001 e p < 0,001, respectivamente). A porcentagem de células Treg CD4+CD25+FoxP3+ foi menor no sangue nos T90, T120 e T180 (p=0,018, p=0,012, p < 0,046, respectivamente), no baço, nos T120 e T180 (p=0,018 e p=0,013), e no LP nos T90 e T300 (p=0,008 e p=0,005). Conclusão: Aumento da expressão de células T CD4+CD69+ e redução da expressão de Treg CD4+CD25+FoxP3+ sugerem células T CD4 ativadas e perda da autotolerância periférica em camundongos com LES-induzido por pristane. Estas alterações são semelhantes às observadas no lúpus humano, de modo que demonstramos que este modelo também pode ser útil na avaliação de mecanismos de ativação celular, tolerância periférica desequilíbrio imune homeostático envolvidos no LES / Introduction: Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is multisystemic autoimmune disease with complex etiology that involves environmental, genetic and hormonal factors. Is characterized by auto-antibodies and inflammatory mediators production, autoreactive T cells activation and proliferation and loss of immunogenic autotolerance. In patients with SLE, expression of CD69 activation primary receptor is increased and the CD4+CD25+FoxP3+ suppressor/regulatory T cell (Treg) is reduced. CD69 is essential for activation of autoreactive CD4 T cells while Treg cells are important in autotolerance maintenance. In this way, T cells have a central role in the pathogenesis of SLE however, the mechanisms implied in the autotolerance failure are still not elucidated, highlighting the importance of studies in this disease\'s experimental models, such as pristane-induced SLE. Objective: Quantify activated CD4+CD69+ T cells and CD4+CD25+FoxP3+ Treg in blood, spleen and peritoneal lavage (PL) of Balb/c mice with pristane-induced SLE in order to evaluate autotolerance failure in this model. Methods: 84 female Balb/c mice were analyzed: 52 received a single intraperitoneal 0,5 ml dose of pristane and 32 the same dose of saline. Euthanized mice samples of blood, spleen and peritoneal lavage were collected 90, 120, 180 and 300 (T90, T120, T180 and T300) days after inoculation of pristane or saline. Mononuclear cells from peripheral blood (PBMC), PL (PLMC) and splenocytes were obtained by lysis of erythrocytes followed by washings with RPMI medium 1640 and centrifugation, subsequently criopreserved until evaluation by flow cytometry using the appliance GuavaEasyCyteTM HT (Millipore). For this step, cells were unfrozen, washed with RPMI medium 1640 and incubated with monoclonal antibodies against CD3, CD4, CD25, CD28, CD69, CTLA-4, FoxP3, CD14 and Ly6C (BD PharmingenTM). The results were expressed as mean ± SD and Mann-Whitney 11 test was used for statistical analysis, being considered significant p < 0,05. Results: Compared to control animals, SLE pristane-induced animals presented increase of CD4+CD69+ T cells in blood on T90, T120 and T180 (p=0.022, p=0.008 and p=0.010, respectively) and in spleen on T120 (p=0.049), while, in PL, there was reduction of these cells on T120, T180 and T300 (p=0.001, p=0.001 and p < 0.001, respectively). The porcentage of Treg CD4+CD25+FoxP3+ was smaller in blood on T90, T120 and T180 (p=0.018, p=0.012 and p < 0.046, respectively), in spleen on T120 and T180 (p=0.018 and p=0.013), and in PL on T90 and T300 (p=0.008 and p=0.005). Conclusion: Increase of CD4+CD69+ T cell and reduction of CD4+CD25+FoxP3+ Treg expression suggests activated T CD4 cells and loss of peripheral autotolerance in pristane-induced SLE mice. These alterations are similar to observed in human lupus, in order we showed that this model can also be useful in evaluating the mechanisms of cellular activation, peripheral tolerance and homeostatic immune imbalance involved in the LES

La maturation lymphocytaire B est sous le contrôle des éléments cis-régulateurs des gènes d’Ig. Les quatre activateurs transcriptionnels (hs3a, hs1,2, hs3b et hs4) de la région régulatrice en 3’ du locus IgH (3’RR) murin sont les éléments clés pour les hypermutations somatiques (SHM) et les recombinaisons isotypiques (CSR). La 3’RR stimule aussi la transcription d’Ig au stade mature du développement B. La 3’RR, en association avec un oncogène, est un dérégulateur puissant conduisant au développement de lymphomes B. Actuellement rien n’est connu sur le rôle de la 3’RR lors de réactions immunes et/ou inflammatoires normales. Durant ma thèse, nous avons étudié l’impact de la délétion de la 3’RR sur le développement d’une réaction inflammatoire en réponse au pristane chez les souris BALB/c. Ces études nous ont permis de montrer que l’absence de la 3’RR ne perturbe pas l’apparition d’une réaction inflammatoire (cinétique de l’ascite, volume, cellularité, recrutement en cellules inflammatoires et leur capacité à produire des cytokines inflammatoires et anti-inflammatoires). Ceci suggère la présence de lymphocytes B physiologiquement aptes à induire/propager/maintenir une réaction inflammatoire et immune robuste et efficiente en absence d’une 3’RR fonctionnelle. Après avoir étudié le rôle de la délétion de la 3’RR dans un contexte inflammatoire, nous avons analysé son rôle dans un contexte de lymphomagenèse. Pour cela nous avons mis l’absence de la 3’RR dans un fond génétique murin apte à développer des lymphomes B matures (souris Igλ-Myc). On observe un changement important dans le phénotype des lymphomes B en absence de la 3’RR avec un plus grand nombre de lymphomes B immatures, une baisse du nombre de lymphomes B matures CD43+ et une augmentation de lymphomes B CD5+. Le rôle de la 3’RR dans la survenue de mutations aux stades B matures durant la SHM et la CSR est suggéré pour expliquer ces résultats. En conclusion, le ciblage pharmacologique de la 3’RR pour bloquer son effet pro-oncogènique transcriptionnel sur un oncogène transloqué au locus IgH pourrait se révéler une approche prometteuse pour le traitement de certains lymphomes B matures humains. / B-cell maturation is under the control of the cis-regulatory elements of Ig genes. The four transcripional enhancers (hs3a, hs1,2, hs3b and hs4) of the mouse IgH 3’ regulatory region (3’RR) are the key elements for somatic hypermutation (SHM) and class-switch recombination (CSR). The 3'RR also stimulates Ig transcription during the mature B-cell stage. When associated with an oncogene, the 3’RR is a potent deregulator leading to B-cell lymphomas. Currently nothing is known about its role in the development of immune and inflammatory reactions. During my thesis, we have studied the impact of the 3’RR deletion on the development of inflammatory reactions in response to pristane in BALB/c mice. These studies have allowed us to show that the lack of the 3'RR does not disturb the development of an efficient inflammatory reaction in response to pristane (kinetics of appearance of ascites, volume, cellularity, recruitment of inflammatory cells and their capacity to produce inflammatory and anti-inflammatory cytokines). This suggests the presence of B-cells physiologically capable to induce/spread/maintain a robust and efficient inflammatory immune response. After studying the role of the deletion of the 3'RR in an inflammatory context we have investigated the role of the 3’RR in a lymphomagenesis. For this we brought the 3’RR deficiency in a genetic background able to develop mature B-cell lymphomas (Igλ-Myc mice). While wt mice develop mature and immature B-cell lymphomas, 3’RR-deficient mice exhibit a strong preference for immature lymphomas. Furthermore 3’RR-deficiency leads to a lowered frequency of CD43+ activated B-cell lymphomas and to an increased frequency of CD5+ B-cell lymphomas. CSR and SHM are abrogated in 3’RR-deficient mice lowering the probability of oncogenic mutations during these stages. Pharmacological targeting of 3'RR to block its transcriptional pro-oncogenic effect on translocated oncogene into IgH locus might be a promising approach for the treatment of some mature human B-cell lymphomas.