Made available in DSpace on 2017-07-20T12:40:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosana M.pdf: 3183755 bytes, checksum: ceaa632c444d6daec2678d0f7fe428db (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / This thesis describes the use of self-assembled monolayers (SAM) for the development of biosensors based on horseradish peroxidase enzyme - HRP. In the first chapter, the enzyme was immobilized on self-assembled monolayers of thiolactic acid (Au-TLA) and mixed SAM composed of 11-mercaptoundecanoic acid (MUA) together with the TLA (SAMmix). The steps of construction and characterization of biosensors have been carried out by electrochemical techniques and morphological ones. The enzyme immobilization method on SAM which provided higher stability was by covalent bond. The Au/TLA/HRP biosensor was used for the determination of H2O2 by chronoamperometry, yielding a detection limit (DL) of 5.46 μmol L-1 and quantification (QL) of 18 μmol L-1. Despite the good results for the H2O2 detection presented by this biosensor, the device was stable for only 6 days. Therefore, in order to increase the stability of the biosensor, SAM containing both the mercaptoundecanoic acid molecule (MUA) and TLA was obtained, to the formation of SAMmix (Au/MUA:TLA). In this system, the electron transfer rate can be considerably affected because while the TLA enables an increase of SAMmix conductivity due to formation of “islands”, the MUA provides greater stability for HRP immobilization, although it partially blocks the surface. The biosensor Au-SAMmix-HRP prepared in the ratio 0.5: 1.0 MUA/TLA showed higher sensitivity compared to other modifications ratio, with an apparent Michaelis-Menten constant = 0.40 mmol L-1. This biosensor has been applied to the determination of hydroquinone (HQ) in the presence of a fixed amount of [H2O2] = 0.3 mmol L-1. By differential pulse voltammetry technique (DPV), the biosensor exhibited excellent electrocatalytic activity for HQ in the range 3-30 μmol L-1, with good sensitivity, DL = 1.26 μmol L-1 and QL = 4.23 μmol L -1. The SAMmix increased the stability of the biosensor for at least 15 days, which is more stable when compared to the biosensor Au/TLA/HRP. In the second chapter of this thesis, another strategy was used for immobilization of the HRP enzyme based on the formation of TLA monolayer on the top of gold nanoparticles (AuNPs) stabilized in the inorganic polymer, 3-n-propylpyridinium silsesquioxane chloride (SiPy+Cl-). The presence of AuNPs-SiPy+Cl- was confirmed by UV-Vis spectroscopy from the plasmon band at 521 nm. The AuNps showed good distribution with approximate size between 4-18 nm, evidenced by transmission electron microscopy (TEM) and by dynamic light scattering (DLS), with good stability (ζ = + 38.5 mV). The AuNPs were deposited on the glassy carbon electrode (GCE) and modified with the TLA for immobilization of HRP enzyme. The formation of this biosensor was confirmed by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and morphologically by field-effect scanning electron microscopy (SEM-FEG). The GCE/AuNPs/TLA/HRP biosensor was used for the detection of H2O2 with = 0.46 mmol L-1, which was similar to the Au-SAMmix-HRP biosensor. This biosensor has been applied to the determination of catechol (CT) in presence of [H2O2] = 0.03 mmol L-1. Using the DPV technique, the biosensor showed an excellent electrocatalytic activity for CT in the range 6-46 μmol L-1, with good sensitivity, DL = 0.852 μmol L-1 and QL = 2.84 μmol L -1. The stability of this device was approximately 25 days, being superior to other biosensors developed (TLA-HRP and SAMmix-HRP), which can be attributed to the three-dimensional immobilization of HRP molecules in this device. / Esta tese descreve a utilização das monocamadas auto-organizadas (SAM) para o desenvolvimento de biossensores enzimáticos a base da enzima horseradish peroxidase – HRP. No primeiro capítulo, diferentes biossensores foram desenvolvidos utilizando a SAM de ácido tioláctico (Au/TLA) e também a SAM mista composta por ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA) juntamente com o TLA (SAMmista). As etapas de construção e caracterização dos biossensores foram realizadas pelas técnicas eletroquímicas e também morfológicas. O método de imobilização da enzima sobre a SAM que proporcionou maior estabilidade foi pela ligação covalente. O biossensor Au/TLA/HRP foi utilizado para a detecção do H2O2 por cronoamperometria, obtendo-se um limite de detecção (LD) de 5,46 μmol L-1 e de quantificação (LQ) de 18 μmol L-1. Apesar dos bons resultados na detecção do H2O2 apresentados por este biossensor, o dispositivo foi estável por apenas 6 dias. Portanto, no intuito de aumentar a estabilidade do biossensor utilizou a molécula de ácido mercaptoundecanóico (MUA) juntamente com TLA, para a formação da SAMmista (Au/MUA:TLA). Neste sistema, a velocidade de transferência eletrônica é sensivelmente afetada, pois enquanto o TLA possibilita o aumento da condutividade da SAMmista devido a formação de “ilhas”, o MUA confere maior estabilidade à monocamada para a imobilização da enzima HRP, apesar de bloquear parcialmente a superfície. O biossensor Au/SAMmista/HRP preparado na razão 0,5:1,0 MUA:TLA apresentou a melhor sensibilidade em comparação as outras modificações, com uma constante de Michaelis-Menten aparente, = 0,40 mmol L-1. Este biossensor foi aplicado na detecção da hidroquinona (HQ) na presença de uma quantidade fixa de [H2O2] = 0,3 mmol L-1. Pela técnica de voltametria de pulso diferencial (VPD), o biossensor exibiu uma excelente atividade eletrocatalítica para HQ na faixa de 3 a 30 μmol L-1, com boa sensibilidade, LD = 1,26 μmol L-1 e o LQ = 4,23 μmol L-1. A SAMmista aumentou a estabilidade do biossensor para 15 dias, sendo este mais estável quando comparado ao biossensor Au/TLA/HRP. No segundo capítulo da tese, outra estratégia para a imobilização da enzima HRP sobre o TLA foi realizada a partir de nanopartículas de ouro (AuNps) estabilizadas no cloreto de 3-n-propilpiridínio silsesquioxano (SiPy+Cl-). A presença das AuNps-SiPy+Cl- foi confirmada pela Espectroscopia UV-Vis a partir da banda plasmon em 521 nm, as quais apresentaram boa distribuição com tamanho aproximado entre 4 a 18 nm, constatado pela microscopia eletrônica de transmissão (MET) e por espalhamento dinâmico de luz (DLS), apresentando boa estabilidade (ζ = + 38,5 mV). As AuNps foram incorporadas sobre o eletrodo de carbono vítreo (ECV) e modificadas com o TLA para imobilização da enzima HRP. A formação deste biossensor foi comprovada pela espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) e morfologicamente pela microscopia de varredura de efeito de campo (MEV-FEG). O biossensor ECV/AuNps/TLA/HRP foi utilizado na detecção do H2O2 com = 0,43 mmol L-1, sendo próxima ao biossensor Au-SAMmista-HRP. Este biossensor foi aplicado na detecção do catecol (CT) na presença de [H2O2] = 0,03 mmol L-1. Pela técnica de VPD, o biossensor exibiu uma excelente atividade eletrocatalítica para CT na faixa de 6 a 46 μmol L-1, com boa sensibilidade, LD = 0,852 μmol L-1 e o LQ = 2,84 μmol L-1. A estabilidade deste dispositivo é de 25 dias, sendo superior aos outros biossensores desenvolvidos (TLA/HRP e SAMmista/HRP) devido a imobilização ocorrer tridimensionalmente aumentando a quantidade de moléculas da TLA e HRP no dispositivo.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RAFAELA D OLIVEIRA.pdf: 2756499 bytes, checksum: e1e60d222b6dbe62066658f22ea4de0b (MD5) Previous issue date: 2014-08-22 / In this work, starch-stabilized silver nanoparticles (AgNPs-Am) were synthesized by reduction of AgNO3 using the NaBH4. The temperature and concentration of reagents of the synthesis were optimized. The formation of AgNPs-Am was monitored by UV-Vis spectroscopy and dynamic light scattering (DLS). The optimum conditions found for the AgNPs-Am synthesis were starch 0.6 % (w/v), 3.6 x 10-3 mol L-1 NaBH4, 0.9 x 10-3 mol L-1 AgNO3 and synthesis in bath ice. The average size of the AgNPs-Am was between 21 and 77 nm. Transmission electron microscopy (TEM) confirmed the AgNPs-Am formation inside and outside of the starch chains, however the smaller sizes were referred to the NPs stabilized by starch. Measurements of Potential zeta indicated stability of the particles, confirmed by DLS monitoring that demonstrated low agglomeration of NPs in a period of 115 days. For the characterization of AgNPs-Am it was also used infrared spectroscopic (FTIR) and X-ray diffraction (XRD). The AgNPs-Am were applied as polyanion for the construction of films by Layer-by-Layer technique (LbL), alternating with polycation 3-n-propylpyridinium-silsesquioxane (SiPy+Cl-). In order to obtain the films, pH and immersion time of the polyelectrolytes were optimized, as well as the concentration of SiPy+Cl-, monitoring the deposition by UV-Vis. The optimum parameters were immersion time 240 seconds, 2 mg/mL SiPy+Cl- pH 6.5 and AgNPs-Am pH 9.0. Atomic force microscopy (AFM) images showed that film thickness increases linearly and the roughness decrease with the bilayers number. FTIR spectra and Raman confirmed the interaction between the polyelectrolytes in the assembly of LbL films. The LbL films with architecture (SiPy+Cl-/AgNPs-Am)n (n = bilayers number) were applied as modified electrodes for iodine detection, using differential pulse voltammetry (DPV). It was verified that interaction of the components in the LbL films improved the current intensity. The film (SiPy+Cl-/AgNPs-Am)n (n=5) showed better current response in phosphate buffered saline (PBS) 0.1 mol L-1 pH 7.0. The instrumental parameters Epulse, and tpulse were optimized by 23 factorial design. It was verified a significant effect for third order interaction for the intensity of iodine redox peak currents, so the instrumentals parameters were evaluated together. The results of optimization were tpulse = 0.05 s, = 40 mV/s e Epulse = 50 mV. Accordingly, the modified electrode obtained a linear response for iodine concentrations ranging from 4.34 x 10-5 to 3.47 x 10-4 mol L-1 (R=0,9936) and from 4.40 x 10-4 to 4.24 x 10-3 mol L-1 (R=0,9938). It was obtained limit of detection (LOD) 5.56 x 10-6 and 1.51 x 10-5 mol L-1 and for limit of quantification (LOQ) 1.85 x 10-5 and 5.04 x 10-5 mol L-1, respectively. The AgNPs-Am synthesized in this work also acted as colorimetric sensor for iodine, with three regions of linearity. Two analytical curves were obtained for iodine concentration range from 2.40 x 10-7 to 9.50 x 10-7 mol L-1 and from 2.40 x 10-6 mol L-1 to 1.60 x 10-5 mol L-1. It was obtained a LOD of 1.71 x 10-8 and 1.06 x 10-6 mol L-1 and LOQ of 5.69 x 10-8 to 3.55 x 10-6 mol L-1, respectively for each range. Color variations obtained in these concentrations correspond to interaction between iodine and silver, which were monitored by UV-Vis band showed in 410 nm. At concentrations above 5.50 x 10-5 mol L-1 there is the appearance of blue color, absorbance in 600 nm, corresponding to the interaction between starch and iodine. It was also obtained a linear relationship for iodine concentration from 5.50 x 10-5 mol L-1 to 9.50 x 10-5 mol L-1. For this concentration range, LOD and LOQ were respectively 1.37 x 10-6 and 4.58 x 10-6 mol L-1. The results presented confirm the potential use of AgNPs-Am for iodine detection, both for the modification of electrodes for electrochemical determination as a colorimetric sensor. / Neste trabalho foram sintetizadas nanopartículas de prata estabilizadas em amido (AgNPs-Am). A síntese foi realizada por redução do sal AgNO3 utilizando o NaBH4. A temperatura de síntese e concentração dos reagentes foram otimizadas, a formação das AgNPs-Am foi monitorada por espectroscopia na região do UV-Vis e medidas de espalhamento dinâmico da luz (DLS). As condições ótimas encontradas para síntese de AgNPs-Am foram amido 0,6 % (m/v), 3,6.10-3 mol.L-1 de NaBH4, 0,9.10-3 mol.L-1 de AgNO3 e síntese em banho de gelo. O tamanho médio das AgNPs-Am foi entre 21 e 77 nm. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) confirmaram que houve formação das AgNPs no interior e fora das cadeias de amido, sendo os menores tamanhos referentes às NPs estabilizadas pelo amido. Medidas de Potencial zeta indicaram estabilidade das NPs, confirmada por acompanhamento DLS que demonstrou baixa aglomeração em um período de 115 dias. Para caracterização das AgNPs-Am utilizou-se também espectroscopia na região do infravermelho (FTIR) e difração de raios X (XRD). As AgNPs-Am foram utilizadas como poliânion para construção de filmes pela técnica Layer-by-Layer (LbL), alternando com policátion 3-n-propilpiridínio-silsesquioxano (SiPy+Cl-). Para construção dos filmes, pH e tempo de imersão dos polieletrólitos foram otimizados, assim como concentração de SiPy+Cl-, monitorando a deposição por UV-Vis. Os parâmetros ótimos foram tempo de imersão 240 segundos, solução de 2 mg/mL de SiPy+Cl- pH 6,5 e AgNPs-Am pH 9,0. Imagens de microscopia de força atômica (AFM) mostram que a espessura dos filmes aumenta linearmente e a rugosidade decresce com o número de bicamadas. Espectros FTIR e Raman confirmaram a interação entre os polieletrólitos na montagem dos filmes. Os filmes LbL com configuração (SiPy+Cl-/AgNPs-Am)n (n = número de bicamadas) foram aplicados como eletrodos modificados para detecção de iodo, utilizando-se voltametria de pulso diferencial (VPD). Verificou-se que a interação dos componentes no filme LbL melhorou a intensidade de corrente. O filme (SiPy+Cl-/AgNPs-Am)n (n=5) apresentou melhor resposta de corrente em eletrólito suporte tampão fosfato salino (PBS) 0,1 mol.L-1 pH 7,0. Os parâmetros instrumentais Epulso, e tpulso foram otimizados por planejamento fatorial 23. Verificou-se efeito significativo para interação de terceira ordem para intensidade de corrente do pico de redução do iodo, portanto os parâmetros instrumentais foram avaliados em conjunto. Os resultados da otimização foram tpulso = 0,05 s, = 40 mV/s e Epulso = 50 mV. Nestas condições, o eletrodo modificado obteve resposta linear para concentrações de iodo que variam de 4,34.10-5 a 3,47.10-4 mol.L-1 (R=0,9936) e de 4,40.10-4 a 4,24.10-3 mol.L-1 (R=0,9938). Respectivamente, obteve-se limite de detecção 5,56.10-6 e 1,51.10-5 mol.L-1 e para o limite de quantificação 1,85.10-5 e 5,04.10-5 mol.L-1. As AgNPs-Am sintetizadas neste trabalho também atuaram como sensor colorimétrico de iodo, com três regiões de linearidade. Duas curvas analíticas foram construídas para concentrações de iodo de 2,40.10-7 a 9,50.10-7 mol.L-1 e de 2,40.10-6 mol.L-1 a 1,60.10-5 mol.L-1. Obteve-se LD de 1,71.10-8 e 1,06.10-6 mol.L-1 e LQ de 5,69.10-8 e 3,55.10-6 mol.L-1, respectivamente para cada intervalo. As variações de cores obtidas nestas concentrações correspondem a interação entre o iodo e a prata, as quais foram acompanhadas pela banda UV-Vis apresentada em 410 nm. Em concentrações acima de 5,50.10-5 mol.L-1 observa-se o aparecimento de coloração azul, absorbância em 600 nm, correspondente a interação entre amido e iodo. Obteve-se linearidade para concentrações de 5,50.10-5 mol.L-1 a 9,50.10-5 mol.L-1. Para este intervalo de concentração, os LD e LQ são respectivamente 1,37.10-6 e 4,58.10-6 mol.L-1. Os resultados apresentados confirmam a potencialidade do uso das AgNPs-Am para detecção de iodo, tanto na modificação de eletrodos para determinação eletroquímica, quanto o uso como sensor colorimétrico.