Die Geschlechtsbestimmung bei Säugetieren erfolgt über gegensätzliche Netzwerke von ovariellen und testikulären Genen, die recht gut charakterisiert sind. Die epigenetischen Mechanismen, insbesondere diejenigen, die die 3D-Chromatinorganisation beeinflussen, sind jedoch größtenteils unbekannt. Ich habe die 3D-Chromatinlandschaft der Geschlechtsbestimmung in vivo untersucht, indem ich FACS-sortierte embryonale Mausgonadenpopulationen vor und nach der Geschlechtsbestimmung in beiden Geschlechtern analysierte. Dabei wurde eine begrenzte Variation in der dreidimensionalen Chromatindynamik beobachtet, insbesondere bei den Topologically Associating Domains (TADs). Konventionelle Hi-C-Analysemethoden sind hauptsächlich auf vordefinierte 3D-Strukturen ausgerichtet und könnten potenziell andere Veränderungen in der Chromatinorganisation übersehen, die für die Genregulation relevant sein könnten. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde METALoci eingesetzt - ein innovatives Werkzeug, das Hi-C- und ChIP-seq-Daten integriert und räumliche Autokorrelationsanalyse nutzt, um dreidimensionale Enhancer-Hubs im gesamten Genom zu identifizieren. METALoci zeigte eine deutliche Umverdrahtung von Chromatininteraktionen während der Geschlechtsbestimmung, die die regulatorischen Landschaften von Hunderten von Genen beeinflusste. Darüber hinaus führte die Vorhersagekraft von METALoci in Kombination mit funktionalen Validierungen an transgenen Mäusen zur Identifizierung eines neuen Fgf9-regulatorischen Hubs. Die Deletion dieses Hubs führte zu teilweisem Geschlechtsumkehr von männlich zu weiblich, mit einer Hochregulierung ovarieller spezifischer Marker und der Einleitung der Meiose. So erweist sich die räumliche Autokorrelationsanalyse als eine effektive Strategie zur Identifizierung von regulatorischen Netzwerken, die mit biologischen Prozessen verbunden sind, und zur anschließenden Charakterisierung der funktionalen Rolle des dreidimensionalen Genoms. / Mammalian sex is determined by opposing networks of ovarian and testicular genes that are relatively well characterized. Yet, the epigenetic mechanisms governing sex determi- nation, in particular those involving 3D chromatin organization, remain largely unknown. This gap of knowledge constrains our understanding of a fundamental process for species reproduction and perpetuation. Here, I explored the 3D chromatin landscape of sex deter- mination in vivo, by profiling FACS-sorted embryonic mouse gonadal populations, prior and after sex determination, in both sexes. Using conventional Hi-C analysis tools, limited variation in the 3D chromatin dynamics was observed, especially at the level of Topolog- ically Associating Domains (TADs). This contrasts with the broad transcriptional differ- ences occurring during sex determination. Yet, conventional Hi-C analysis methodologies are largely focused on predefined 3D structures, potentially overlooking other types of changes in chromatin organization that might be relevant for gene regulation. To ad- dress these limitations, METALoci was applied- an innovative tool that integrates Hi-C and ChIP-seq data and relies on spatial auto-correlation analysis to identify 3D enhancer hubs distributed throughout the genome. METALoci uncovered a prominent rewiring of chromatin interactions during sex determination, affecting the regulatory landscapes of hundreds of genes. Furthermore, METALoci ’s predictive capacity, in combination with functional validations in transgenic mice led to the identification of a novel Fgf9 regulatory hub, which deletion resulted in partial male-to-female sex reversal with the upregulation of ovarian-specific markers and the initiation of meiosis. Thus, spatial auto-correlation anal- ysis proves to be an effective strategy to identify regulatory networks linked to biological processes and to subsequently characterize the functional role of the 3D genome.

Die dreidimensionale Organisation des Chromatins verändert sich während der Zelldifferenzierung als Reaktion auf die Umgebung und ist bei Krankheiten oftmals verändert. Das Zusammenspiel zwischen Chromatinzustand, Chromatinorganisation und Genexpression ist insbesondere bei Neuronen nach wie vor nur geringfügig erforscht. In dieser Arbeit untersuchte ich die Organisation und den Zustand des Chromatins im Zusammenhang mit der Transkription in embryonalen Stammzellen (ESCs) und dopaminergen Neuronen (DNs) der Maus. Dazu habe ich die Organisation des Chromatins mittels Genome Architecture Mapping (GAM) bestimmt und zelltypspezifische Genexpressionsprofile zur Klassifizierungen von Promotoren, Enhancern und Super-Enhancern (SEs) erzeugt. Anschließend habe ich diese linearen Chromatinprofile mit den verschiedenen Stufen der Chromatinorganisation kombiniert und konnte so Unterschiede zwischen den 3D-Genomstrukturen von ESCs und DNs aufzeigen. Zudem konnte ich verstärkt Dreifach-Wechselwirkungen zwischen zelltypspezifischen SEs und/oder exprimierten Genen nachweisen, die bei DNs besonders oft neuronale Signalgene darstellen und oftmals bei neurologischen Störungen betroffen sind. Ich fand auch heraus, dass die Grenzen topologisch assoziierter Domänen (TADs) oft mit Genen zur zellulären Differenzierung zusammen fallen und zudem zelltyp-spezifische Eigenschaften aufweisen, was von Bedeutung für zukünftige funktionelle Untersuchungen solcher Grenzen sein dürfte. Schließlich konnte ich zeigen, dass Chromatinkompartimente zwischen ESCs und DNs in Abhängigkeit vom Chromatinzustands und der Chromatinexpression variieren und dass eine Gruppe transkriptionell aktiver DN Gene, die für die neuronale Aktivität wichtig sind, in B-Kompartimenten liegt. Mit diesen neuen Erkenntnissen erweitert meine Arbeit das Verständnis der Chromatinorganisation bei der Regulierung der Genexpression in Maus ESCs und DNs. / The three-dimensional organization of chromatin changes during cell differentiation, in response to the environment, and is often altered in disease. The interplay between chromatin state, chromatin organization and gene expression remains poorly understood, particularly in neurons. In this work, I examined the organization and state of chromatin associated with transcription in mouse embryonic stem cells (ESCs) and dopaminergic neurons (DNs). To do this, I determined the organization of chromatin using genome architecture mapping (GAM) and generated cell type-specific gene expression profiles to classify promoters, enhancers and super-enhancers (SEs). I then combined these linear chromatin profiles with the different levels of chromatin organization and was able to show differences between the 3D genome structures of ESCs and DNs. In addition, I was able to demonstrate increased triple interactions between cell type-specific SEs and/or expressed genes, which are often neuronal signalling genes in DNs and affected in neurological disorders. I also found that the boundaries of topologically associated domains (TADs) often coincide with cellular differentiation genes and also exhibit cell type-specific properties, which may be important for future functional studies of such boundaries. Finally, I was able to show that chromatin compartments between ESCs and DNs vary depending on chromatin state and chromatin expression, and that a group of transcriptionally active DN genes important for neuronal activity are located in B compartments. With these new findings, my work expands the understanding of chromatin organization in regulating gene expression in mouse ESCs and DNs.