Submitted by Clebson Anjos (clebson.leandro54@gmail.com) on 2016-03-30T17:14:42Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2235188 bytes, checksum: a2603a546030491976e0045d622aff17 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-30T17:14:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2235188 bytes, checksum: a2603a546030491976e0045d622aff17 (MD5) Previous issue date: 2013-11-11 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke (Fabaceae) is a typical tree of Caatinga, popularly known as “jurema-branca”, “jurema-malícia-da-serra”, “carcará” and “calumbi” and is popularly used as heling agent and antiinflamatory. From its aerial parts was isolated the flavonoid 4’,5,7-triidroxi-3,6-dimetoxiflavona (FGAL) that, in previous studies, inhibited both CCh- and histamine-induced phasic contractions on guinea pig ileum. Thus, the aim of this work was to characterize its relaxant mechanism of action. Isotonic and isometric contractions were recorded to determine and compare the relative efficacy and potency. The myocites viability was measured by the MTT assay, and the cytosolic Ca2+ levels by the analysis of fluorescence of fluo-4. The flavonoid relaxed the ileum pre-contracted with KCl 40 mM (EC50 = 2.6 ± 0.5 x 10-6 M) or CCh 10-5 M (EC50 = 1.8 ± 0.4 x 10-6 M), being more potent when the ileum was pre-contracted with histamine 10-6 M (EC50 = 1.9 ± 0.4 x 10-7 M). In addition, the flavonoid righward shifted the cumulative concentration-response curves of histamine in a non-parallel manner, with maximum effect (Emax) reduction, presenting a profile of non-competitive pseudoirreversible antagonism. To verify if FGAL would inhibit the Ca2+ influx through the voltage-sensitive Ca2+ channels (CaV), cumulative concentration-response curves of CaCl2 in depolarizing medium (70 mM KCl) nominally without Ca2+ were obtained in both the absence (control) and presence of different concentrations of FGAL. The flavonoid righward shifted the CaCl2 contraction curves in a non-parallel manner, with Emax reduction. Moreover, FGAL relaxed the pre-contracted ileum with S-(-)-Bay K8644 (3 x 10-7 M), a CaV1 agonist, but with lower potency than with KCl or histamine, indicating an indirect blockade of these channels. Then, in order to verify whether FGAL would be positivelly modulating the K+ channels to, indirectally, block the CaV1, it was employed CsCl, a non-selective K+ channels blocker. The relaxant potency of FGAL was attenauted in the presence of CsCl (EC50 = 1.1 ± 0.3 x 10-6 M) suggesting the involvement of these channels on this relaxant effect. In contrast, the relaxant potency of FGAL was not modified in the presence of apamin, SKCa blocker (EC50 = 1.6 ± 0.3 x 10-7 M), or TEA+ 1 mM, BKCa blocker (EC50 = 2.0 ± 1.0 x 10-7 M), discarding the participation of these subtypes of K+ channels. However, in the presence of 4-AP, KV blocker (EC50 = 1.8 ± 0.2 x 10-6 M), and glibenclamide, KATP blocker (EC50 = 1.5 ± 0.5 x 10-6 M), the relaxant potency of FGAL was attenuated about 10 and 8 times, respectively, confirming that FGAL positivelly modulates these subtypes of K+ channels to relax the guinea pig ileum. In the cellular experiments, the viability of intestinal myocytes was not altered in the presence of FGAL (10-4 M). Furthermore, the fluorescence intensity emmited by fluo-4 of myocytes stimulated with histamine was attenuated by FGAL as a result of [Ca2+]c reduction. Therefore, the relaxant mechanism of action of FGAL on guinea pig ileum involves the positive modulation of KV and KATP, which, indirectly, reduces the Ca2+ influx through CaV1, leading to the reduction of the cytosolic levels of this ion. / Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke (Fabaceae) é uma árvore típica da Caatinga, conhecida popularmente como “jurema-branca”, “jurema-malícia-da-serra”, “carcará” e “calumbi” e é popularmente utilizada como cicatrizante e anti-inflamatório. De suas partes aéreas foi isolado o flavonoide 4’,5,7-triidroxi-3,6-dimetoxiflavona (FGAL) que, em estudos anteriores, inibiu as contrações fásicas induzidas por carbacol (CCh) ou por histamina em íleo de cobaia. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar seu mecanismo de ação relaxante. As contrações isotônicas e isométricas foram monitoradas para determinar e comparar a eficácia e a potência relativas. A viabilidade dos miócitos do íleo foi medida utilizando o ensaio de MTT, e os níveis de Ca2+ citosólicos por meio da análise de fluorescência do fluo-4. FGAL relaxou o íleo pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50 = 2,6 ± 0,5 x 10-6 M) ou com 10-5 M de CCh (CE50 = 1,8 ± 0,4 x 10-6 M), sendo mais potente quando o íleo foi pré-contraído com 10-6 M de histamina (CE50 = 1,9 ± 0,4 x 10-7 M). Além disso, o flavonoide deslocou para a direita as curvas concentração-resposta da histamina, de maneira não paralela com redução do efeito máximo (Emax), apresentando um perfil de antagonismo não competitivo pseudoirreversível. Para verificar se FGAL inibiria o influxo de Ca2+ pelos canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV), foram obtidas curvas concentração-resposta cumulativas ao CaCl2 em meio despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+ na ausência (controle) e na presença de diferentes concentrações de FGAL. O flavonoide deslocou as curvas de contração do CaCl2 para a direita de maneira não paralela com redução do seu Emax. Além disso, FGAL relaxou o íleo pré-contraído com 3 x 10-7 M de S-(-)-Bay K8644, agonista dos CaV1, porém com menor potência do que com KCl ou histamina, indicando um bloqueio indireto desses canais. Assim, para verificar se FGAL modularia positivamente os canais de K+ para, indiretamente, bloquear os CaV1, utilizou-se o CsCl, bloqueador não seletivo dos canais de K+. FGAL teve sua potência relaxante atenuada na presença desse bloqueador (CE50 = 1,1 ± 0,3 x 10-6 M), sugerindo a participação desses canais no seu efeito relaxante. Diferentemente, a potência relaxante de FGAL não foi alterada na presença de apamina, bloqueador dos SKCa (CE50 = 1,6 ± 0,3 x 10-7 M), ou de TEA+ 1 mM, bloqueador dos BKCa (CE50 = 2,0 ± 1,0 x 10-7 M), descartando-se a participação desses subtipos de canais de K+. No entanto, na presença de 4-AP, bloqueador dos KV (CE50 = 1,8 ± 0,2 x 10-6 M), e de glibenclamida, bloqueador dos KATP (CE50 = 1,5 ± 0,5 x 10-6 M), a potência relaxante de FGAL foi atenuada cerca de 10 e 8 vezes, respectivamente, confirmando que FGAL modula positivamente esses subtipos de canais de K+ para relaxar o íleo de cobaia. Nos experimentos celulares, a viabilidade dos miócitos intestinais não foi alterada na presença de FGAL (10-4 M). Além disso, a intensidade de fluorescência emitida pelo fluo-4 complexado ao Ca2+ dos miócitos estimulados com histamina foi atenuada por FGAL, indicando que o flavonoide reduz a [Ca2+]c. Assim, o mecanismo de ação relaxante de FGAL em íleo de cobaia envolve a modulação positiva dos KV e dos KATP, o que, indiretamente, reduz o influxo de Ca2+ pelos CaV1, levando à redução dos níveis citosólicos desse íon.