No description available.

No description available.

TBC1D1 and TBC1D4 are Rab-GTPase Activating Proteins (Rab-GAPs) expressed in insulin-responsive tissues. Both proteins are involved in mechanisms which regulate basal levels of glucose transport and have been identified as targets of insulin and AMP-dependant kinase (AMPK) signalling pathways, which regulate GLUT4 translocation to the plasma membrane in muscle. We have characterised the C2C12 muscle cell model retrovirally expressing HA-epitope tagged GLUT4 in order to investigate how distinct signalling pathways regulate GLUT4 trafficking. Insulin-stimulation and treatment with the AMPK-activator (AICAR) increased the levels of GLUT4 at the plasma membrane by two-fold in C2C12 myotubes. Insulin-stimulation and activation of AMPK mobilised GLUT4 in to the actively cycling pool. However, our data revealed that insulin-stimulation or AMPK activation resulted in distinct effects on GLUT4 trafficking parameters at steady-state. Insulin increased GLUT4 exocytosis (kex) of this cycling pool. Activation of AMPK inhibited GLUT4 internalisation (ken). The combined effect of insulin-stimulation and AMPK-activation was synergistic and led to increased GLUT4 cell surface levels above those obtained with either treatment alone. Insulin-stimulation and AMPK activation in combination resulted in a partially additive effect on the size of the actively recycling GLUT4 pool and further enhanced kex of this cycling pool. Kinetic studies were performed to measure the effect of TBC1D1 and TBC1D4 knockdown on GLUT4 trafficking in C2C12 myotubes. siRNA-mediated knockdown of TBC1D4 did not affect the basal levels of cell surface GLUT4. Knockdown of TBC1D1 increased cell surface levels of GLUT4 in basal and in insulin-stimulated C2C12 myotubes. The knockdown increased the release of GLUT4 in to the actively recycling pool. By contrast TBC1D1 knockdown did not change the levels of GLUT4 at the plasma membrane that occur in the presence of the AMPK-activator (AICAR). Our results support a model whereby TBC1D1 inactivation by signalling-dependant phosphorylation is required for GLUT4 translocation, but with insulin and AICAR having separate and distinguishable effects on the released GLUT4.

The fructose 1,6-bisphosphate type I aldolase from the thermophilic organism Thermoproteus tenax has been expressed and purified by heat treatment. The aldolase aldehyde substrate scope was investigated using electrospray mass spectrometry to detect the formation of any aldol products. Parameters affecting aldolase activity, including temperature, buffer pH and solvent additive were investigated. The synthesis of an aldehyde with an attached fluorescent reporter group was performed for potential use in the screening of mutant aldolases for aldol or Baylis-Hillman activity. The synthesis of 1-hydroxy-3-buten-2-one phosphate, an analogue of dihydroxyacetone phosphate, capable of participating in Baylis-Hillman reactions, was achieved in 5 steps from 3-buten-1-ol. This analogue was used in the investigation of the wild type aldolase and several mutant aldolases for Baylis-Hillman activity. X-ray crystallographic data was obtained for the wild type enzyme and the Trp144Leu mutant aldolase with 1-hydroxy-3-buten-2-one phosphate bound at their active sites. In the wild type aldolase, the substrate was found to bind in a similar manner to dihydroxyacetone phosphate, with the formation of a Schiff base with the Lys177 amino acid residue at the enzyme active site. In the Trp144Leu mutant aldolase, Lys177 has added in Michael fashion to the enone functionality of the bound substrate forming an enolate instead of forming a Schiff base. Both forms of the bound substrate are potentially capable of participating in Baylis-Hillman reactions. The enzymes have yet to be fully investigated for Baylis-Hillman activity.

Οι κυκλοδεξτρίνες είναι κυκλικοί ολιγοσακχαρίτες αποτελούμενοι από μόρια α-D-γλυκοπυρανόζης που συνδέονται με α-1-4 γλυκοζιτικούς δεσμούς και παράγονται από το άμυλο. Διαφέρουν μεταξύ τους από τον αριθμό των μονάδων γλυκοπυρανόζης της δομής τους. Οι κυκλοδεξτρίνες διακρίνονται σε δύο ομάδες: τις φυσικές και τις τροποποιημένες. Οι πιο κοινές φυσικές κυκλοδεξτρίνες είναι οι α-κυκλοδεξτρίνη, β-κυκλοδεξτρίνη και γ-κυκλοδεξτρίνη, που αποτελούνται από 6, 7 και 8 μονάδες γλυκοπυρανόζης, αντίστοιχα. Επίσης, οι τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες εμφανίζουν σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τις φυσικές. Η δομή των κυκλοδεξτρινών προσομοιάζει το σχήμα κόλουρου κώνου με μια υδρόφιλη εξωτερική επιφάνεια και μια λιπόφιλη εσωτερική κοιλότητα. Η υδρόφιλη εξωτερική επιφάνεια εξασφαλίζει καλή υδατοδιαλυτότητα για το μόριο της κυκλοδεξτρίνης, ενώ η υδρόφοβη εσωτερική κοιλότητα δημιουργεί το κατάλληλο περιβάλλον για τον εγκλωβισμό ολόκληρου του μορίου μιας βιοδραστικής ένωσης ή τμήματος αυτού. Οι κυκλοδεξτρίνες μπορούν να αλληλεπιδράσουν με μόρια κατάλληλου μεγέθους για το σχηματισμό συμπλόκων έγκλεισης. Ο σχηματισμός των συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών με τις βιοδραστικές ενώσεις συχνά έχει ως αποτέλεσμα τη τροποποίηση των φυσικών και χημικών ιδιοτήτων του εγκλωβιζόμενου μορίου. Η συμπλοκοποίηση των κυκλοδεξτρινών έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την αύξηση της διαλυτότητας, του ρυθμού διαλυτοποίησης, της χημικής σταθερότητας και βιοδιαθεσιμότητας ελάχιστα διαλυτών και αδιάλυτων βιοδραστικών ενώσεων. Επίσης, οι κυκλοδεξτρίνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μείωση ή κάλυψη ανεπιθύμητων οσμών και δυσάρεστων γεύσεων, την αντιμετώπιση των προβλημάτων ασυμβατότητας μεταξύ των βιοδραστικών ουσιών και μεταξύ των βιοδραστικών ουσιών και των εκδόχων και για τη κάλυψη των παρενεργειών των φαρμάκων. Η ιτρακοναζόλη είναι μία τριαζόλη με αντιμυκητιασική δράση ευρέως φάσματος, η οποία είναι πρακτικά αδιάλυτη στο νερό σε φυσιολογικές συνθήκες και περισσότερο διαλυτή σε πολύ όξινες συνθήκες, με αποτέλεσμα να παρουσιάζει πολύ μικρή βιοδιαθεσιμότητα μετά από του στόματος χορήγηση. Η ιτρακοναζόλη είναι μία ασθενής βάση με πολύ μικρή υδατοδιαλυτότητα. Η υδατοδιαλυτότητα της ιτρακοναζόλης σε ουδέτερο pH είναι ~ 1 ng/ml και σε pH 1 είναι ~ 4μg/ml. Οι κυκλοδεξτρίνες που μελετήθηκαν στη παρούσα εργασία είναι οι : υδροξυπρόπυλο-β-CD (ΗP-β-CD), μέθυλο-β-CD (Με-β-CD), υδροξυαίθυλο-β-CD (HE-β-CD) και υδροξυπρόπυλο-γ-CD (ΗP-γ-CD). Στόχοι της παρούσας εργαστηριακής άσκησης είναι:  ο προσδιορισμός της επίδρασης των παραπάνων κυκλοδεξτρινών στην διαλυτότητα της ιτρακοναζόλης σε όξινα υδατικά διαλύματα  ο χαρακτηρισμός των στερεών συμπλόκων της ιτρακοναζόλης με τις προς εξέταση κυκλοδεξτρίνες που παρασκευάσθηκαν με διαφορετικές τεχνικές. / Cyclodextrins are cyclic (α-1,4)-linked oligosaccharides of α-D-glucopyranose derived from starch. They differ from one another by the number of glucopyranose units in the structure. Cyclodextrins can be classified in two groups: natural and modified. The most common natural cyclodextrins are α-cyclodextrin, β–cyclodextrin andι γ-cyclodextrin which consist of six, seven and eight glucopyranose units respectively. Also, modified cyclodextrins offer significant advantages in comparison with natural cyclodextrins. The cyclodextrin structure provides a molecule shaped like a segment of a hollow cone with an exterior hydrophilic surface and interior hydrophobic cavity. The hydrophilic surface generates good water solubility for the cyclodextrin and the hydrophobic cavity provides a favorable environment in which the entire or part of the drug molecule is fitted. Cyclodextrins can interact with appropriately sized molecules to result in the formation of inclusion compounds. Inclusion complex formation between cyclodextrins and drugs often modifies the physical and chemical properties of the guest molecules. Cyclodextrin complexation has been successfully used to improve solubility, dissolution rate, chemical stability and bioavailability of sparingly soluble or insoluble drugs. Also, cyclodextrins can be used to reduce or eliminate unpleasant smell or tastes of drugs, prevent drug-drug or drug-additive interactions and reduce or prevent drug side effects. Itraconazole is an orally broad-spectrum triazole antifungal agent, which is practically insoluble in water at physiological conditions and more soluble only in extremely acidic media, leading to poor oral biovailability. ITZ is a very poorly water soluble, weak base. The aqueous solubility is estimated at ~ 1ng/ml at neutral pH and ~ 4μg/ml at pH = 1. [2] The chemical structure of ITZ is shown in Figure 1. The cyclodextrins tested in this work were : Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HP-β-CD), Methyl-β-Cyclodextrin (Me-β-CD), Hydroxyethyl-β-Cyclodextrin (He-β-CD) and Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin (HP-γ-CD). The aims of this work are:  to evaluate the influence of above cyclodextrins on the solubility of ITZ at acified aqueous solutions  to characterize the solid complexes formed between cyclodextrins and ITZ prepared by different techniques.

This thesis describes investigations into the use of electrochemical oxidation as a method for the activation of glycosyl donors, and in particular the application of this technique to the selective activation of one electrochemically active glycoside over another. The synthesis of twenty eight electrochemically active monosaccharide donors, including thio-, seleno- and O-glycosides with varying protecting group patterns and anomeric substituents is described, together with the synthesis of three electrochemically active monosaccharides with the potential to act as both glycosyl donors and glycosyl acceptors. The electrochemical analysis of these monosaccharides is reported and gives a detailed insight into the effect of various factors on the oxidation potentials of the monosaccharide donors and allows some general conclusions to be drawn. In addition the analysis of six monosaccharides by cyclic voltammetry at scan rates of up to 25 000 Vs^-1 allows their homogenous kinetics to be outrun and formal oxidation potentials obtained. Investigations into selective electrochemical glycosylations are reported, and the applicability of the analytical electrochemical studies to synthetic electrochemical reactions is demonstrated. Selective glycosylations are possible with selenoglycoside donors and either thio- or O-glycoside acceptors to give disaccharides. However the selective activation of selenoglycosides over thioglycosides is shown to be complicated by some underlying pathway for indiscriminate activation of both donor and acceptor. In contrast the use of an O-glycoside donor experiences no such problems. More detailed work on the underlying problems experienced with the thioglycoside acceptor was conducted, and the results are reported here. Investigations into electrochemical activation of the disaccharides are discussed, and the thioglycoside is shown to be easily activated to give a trisaccharide. At the time of writing this is believed to be the only electrochemically mediated trisaccharide synthesis reported in the literature. The O-glycoside however is shown to be inactive under the electrochemical oxidation conditions employed.

Les glycannes, présents chez tous les êtres vivants forment une des grandes classes de biomolécules. À l’interface de la chimie organique et de la biologie, la chemobiologie a permis des avancées considérables comme le marquage métabolique des glycannes. Cette stratégie consiste en l’usage d’un monosaccharide modifié qui pourra entrer dans la cellule et emprunter ses voies métaboliques. Après incorporation, le rapporteur chimique est détecté de manière spécifique grâce à des réactions de ligation bioorthogonale entre le groupement incorporé et une sonde portant un groupement complémentaire. Cette thèse a pour but l’étude des acides sialiques selon deux axes : (i) le développement d’une stratégie originale de marquage, utilisant de manière complémentaire deux monosaccharides modifiés, apportant de nouvelles informations sur les modes d’entrée de l’acide sialique exogène, mais aussi de son précurseur, la N-acétylmannosamine. (ii) l’introduction de manière exogène, d’acides sialiques modifiés mais cette fois avec des enzymes (sialyltransférases) qui tranfèrent l’acide sialique préalablement activé sur des glycoprotéines solubles ou membranaires. À l’aide de suivis in situ par RMN 31P, une méthode versatile, simple et robuste a été développée pour la production d’acides sialiques activés utilisables immédiatement par des sialyltransférases recombinantes. Ces outils ont été appliqués à l’étude et à la caractérisation de différentes enzymes. Au-delà du développement d’outils, ces travaux de thèse ont permis l’application de nouvelles méthodes et stratégies à l’étude de mécanismes cellulaires, de réactions enzymatiques ou encore de déficiences de glycosylation. / Glycans are essential biomolecules found in every living system. The recent advent of chemical biology paved the way for great advances in glycobiology such as metabolic glycan engineering (MGE). This strategy consists in the use of a modified monosaccharide, the chemical reporter, which can enter the cell and hijack the metabolic pathway. Upon incorporation, the introduced chemical reporter detection is achieved in a specific manner through bioorthogonal ligation. The present work aims to study sialic acids, which are often found at the outermost position of glycan chains:(i) we developed an original MGE-based strategy, using two different chemical reporters, each one being an analog of products from different steps of the biosynthetic pathway. This sequential bioorthogonal dual strategy (SBDS) has provided new insights in the entry mechanisms of both sialic acid and its precursor N-acetylmannosamine. (ii) we introduced chemically modified sialic acids, but, this time in an exo-enzymatic way, with specific glycosyltransferases (sialyltransferases) onto soluble glycoproteins or living cells. Before being transferred, sialic acids need to be activated as CMP-sialic acids which are very unstable and prone to decomposition. 31P NMR was used to optimize the production of ready-to-use CMP-sialic acids providing a versatile, simple and reproducible procedure. Natural and/or unnatural CMP-sialic acids have then proven to be great tools for the study and characterization of different enzymes. More than just a tool-box, this work describes some direct applications of our chemical tools to unravel cellular pathways, enzymatic reactions, or even biosynthesis defects.

No description available.

Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε μελέτη του πολυμορφισμού της ινσουλίνης μέσω της κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πολυάριθμα πειράματα κρυστάλλωσης της ινσουλίνης υπό διαφορετικές συνθήκες (pH, οργανικοί προσδέτες). Οι κρύσταλλοι που προέκυψαν χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα περίθλασης ακτίνων-Χ τα οποία πραγματοποιήθηκαν στο Ευρωπαϊκό σύγχροτρον, ESRF, της Γαλλίας και στο Ελβετικό σύγχροτρον, SLS. Η τεχνική που ακολουθήθηκε για τα πειράματα περίθλασης ήταν αυτή του powder diffraction, η οποία τα τελευταία χρόνια έχει αναδειχθεί σε ένα σημαντικό εργαλείο χαρακτηρισμού των πρωτεϊνικών πολυκρυσταλλικών ιζημάτων. Από τη μελέτη αυτή, προέκυψαν διάφορα πολύμορφα της ινσουλίνης που χαρακτηρίζονται από διαφορετικές συμμετρίες, ενώ πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός κάθε κρυσταλλικής φάσης στο επίπεδο της μοναδιαίας κυψελίδας. Ενδιαφέρον αποτελεί ο εντοπισμός δύο νέων κρυσταλλικών φάσεων της ινσουλίνης, μονοκλινούς συμμετρίας, οι οποίες ενδέχεται να είναι υψηλής φαρμακευτικής σημασίας. / In this thesis the polymorphism of insulin via X-ray powder crystallography has been carried out. For this purpose numerous experiments of insulin crystallization have been performed under different conditions (pH, organic ligands). The resulting crystals were employed in X-ray diffraction experiments, which took place at the European synchrotron, ESRF, in France and at the Swiss synchrotron, SLS. The technique employed for the X- Ray diffraction experiments, was the powder diffraction method, which has been proven to be an important tool for the determination of polycrystalline protein precipitants during the last decade. From this study, a number of insulin polymorphs were identified in different crystal systems and furthermore, each crystalline phase was determined at the level of unit cell symmetry and dimensions. An interesting point occurs from the characterization of two novel insulin phases, belonging to monoclinic symmetry, which are potentially associated with high pharmaceutical importance.

Στην παρούσα διπλωματική παρουσιάζεται η εξομοίωση της μεθόδου για την μη επεμβατική μέτρηση της γλυκόζης στο αίμα. Η καρδιά της μεθόδου είναι ο μικροεπεξεργαστής της Texas Instruments Msp430f169, τον οποίο και προγραμματίσαμε σε γλώσσα C. Η φυσική αρχή λειτουργίας που στηριχθήκαμε είναι ο νόμος απορρόφησης του φωτός του Beer - Lambert. Το αναλογικό σήμα το μετατρέψαμε σε ψηφιακό με τη χρήση του ADC12 μετατροπέα, το οποίο είναι περιφερειακό στοιχείο του μικροεπεξεργαστή. / This thesis presents the simulation method for non-invasive measurement of blood glucose. The heart of this method is its microprocessor, Texas Instruments Msp430f169, which was programmed in language C. The physical principle of operation supported is the law of light absorption of the Beer - Lambert. The analog signal is converted to digital, using the ADC12 converter, which is a regional component of the microprocessor.