Cofilin is a well-studied actin binding and regulatory protein that functions to control the dynamic status of the cytoskeleton. Recent evidence also impl icates cofilin in the regulation of mitochondrial function during response to exogenous and intracellular stress. Here we provide evidence that cofilin regulates mitochondrial function via a post-transcriptional mechanism to facilitate an increase in respiratory capacity as well as a concomitant multi-drug resistance response in the budding yeast S. cerevisiae. Changes to the surface cbarge of cofilin that do not interfere with its actin regulatory functions lead to an increase in respiratory function and the upregulation of a battery of ABC transporters leading to multi-drug resistance. Moreover, there is evidence that the overall alterations in cellular function includes metabolic and stress signalling through the activation of MAPK components. We hypothesise tbat cofilinlmitochondrial interactions form part of a novel bio-sensing system. which connects the cytoskeleton and mitochondrial function to environmental change.

Eukaryotic cells use a range of mechanisms to ensure that a full complement of each organelle is maintained during cell division. In S.cerevisiae cells, the maintenance of peroxisomes requires the growth, division and accurate segregation of existing peroxisomes. Alternatively, peroxisomes can be formed de novo from the ER. However, this process only occurs when the inheritance of peroxisomes is abolished.

Genetic variation is the raw material upon which natural selection acts to spread advantageous phenotypic traits throughout populations. Studies in the yeast Saccharomyces cerevisiae have begun to uncover the extent of genetic variation within yeast populations, but the fitness effects of this variation are still poorly understood. Furthermore, the interplay between genotype, envkonment and fitness only recently begun to be explored at the molecular level. The aun of this thesis is to explore this complex relationship.

No description available.

No description available.

Certain yeasts can grow at low pH in the presence of the highest levels of weak organic acid preservatives permitted in foods, leading to spoilage of many manufactured products. This study sought to gain further understanding into the weak acid mechanisms of the yeast Saccharomyces cerevisiae, to help identify novel routes to inhibit the growth of this yeast. Weak acids are thought to act by reducing intracellular pH (pHi), thus disrupting cellular homeostasis. To definitively link pHi to weak acid inhibition, a new fluorescent in-vivo pHi method was developed (Chapter 3) to study the effects of this stress on pHi and growth. The inhibitory action of sorbic acid was found to cause disruption of pHi, necessitating induction of an energy-consuming response to rebalance homeostasis. The latter in turn reduced the available free energy for growth and division. To determine other key factors involved in yeast weak acid resistance, the proteome of cells under sorbate stress was investigated using high-resolution two-dimensional gels (Chapter 4). This identified eight cytosolic proteins that were up-regulated. However, contrary to hypothesis, phenotypic evaluation of the knock out deletion mutants of the identified proteins revealed that none were hypersensitive to sorbate. To gain further insight into these results, the two genetically almost identical strains used in the above proteomic and phenotypic studies were compared. Results showed that the strain used for the proteomic study (Chapter 4) was far more sorbate sensitive than the other used for the physiological measurements (Chapter 3). Since the only major difference was that the former was a tryptophan auxotroph and the latter a tryptophan phototroph, it was investigated in Chapter 5 whether this increased weak acid sensitivity was due to the auxotrophic requirement for tryptophan (i.e. the strain was trp-). High levels of exogenous tryptophan suppressed this enhanced sensitivity of trp- cells (Chapter 5). It is apparent therefore that increased weak acid sensitivity arises because the acids strongly inhibit the uptake of the aromatic acids from the medium, rendering trp- cells extremely sensitive to their requirement to catalyse this uptake. This identification of this trp- effect has implications for the choice of strains used for future weak acid studies. It has allowed us to reassess the findings of previous studies, where gene functions have been assigned based upon studies using trp- strains.

Στην παρούσα ερευνητική εργασία μελετήθηκε η επίδραση της φύσης της πηγής άνθρακα και του διαλυμένου οξυγόνου στο διμορφισμό της ζύμης Yarrowia lipolytica. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά υποστρώματα, ένα υδρόφιλο (γλυκόζη) και ένα υδρόφοβο (ελαιόλαδο) και δύο διαφορετικοί ρυθμοί ανάδευσης (180 και 50 rpm) της καλλιέργειας για την εξασφάλιση διαφορετικών ποσοτήτων διαλυμένου οξυγόνου. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109, η καλλιέργεια του οποίου έγινε σε κωνικές φιάλες με ημι-συνθετικό θρεπτικό υλικό, περιοριστικό σε άζωτο, pH 6±0,5 και θερμοκρασία 28±1 oC, σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο. Κατά τη διάρκεια της αύξησης του μικροοργανισμού και ανά τακτά χρονικά διαστήματα γινόταν καταμέτρηση της περιεκτικότητας της καλλιέργειας σε κύτταρα, παρατήρηση της μορφολογίας τους στο οπτικό μικροσκόπιο και υπολογισμός του ειδικού ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου σε αυτή. Η πειραματική διαδικασία ολοκληρώθηκε με τη λήψη εικόνων των διαφορετικών μορφών της Y. lipolytica από το Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης. Το φαινόμενο του διμορφισμού, δηλαδή η ικανότητα του μικροοργανισμού να αναπτύσσεται είτε ως μεμονωμένα κύτταρα ζύμης είτε ως μυκήλιο, παρατηρήθηκε και με τη γλυκόζη και με το ελαιόλαδο ως πηγή άνθρακα, αλλά μόνο σε χαμηλό ρυθμό ανάδευσης της καλλιέργειας, όπου οι συνθήκες ήταν πρακτικά αναερόβιες. Η μορφολογία της Y. lipolytica ήταν παρόμοια και επί των δύο υποστρωμάτων, με τον αριθμό των ψευδομυκηλίων και αληθών μυκηλίων να είναι μεγαλύτερος στην περίπτωση του ελαιόλαδου. Γενικά, ο διμορφισμός ελέγχεται από το συνδυασμό διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων, εκ των οποίων το διαλυμένο οξυγόνο φαίνεται να έχει ισχυρότερη επίδραση από αυτή της φύσης της πηγής άνθρακα, όπως συνάγεται από την παρούσα μελέτη. / In this MSc thesis, the effect of the nature of the carbon source and the concentration of dissolved oxygen on the dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica, was studied. For this purpose, a hydrophilic (glucose) and a hydrophobic (olive oil) substrate were used as well as two different shaking speeds (180 and 50 rpm) of the cultivation. Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109 strain was cultivated in conical flasks, using semi-synthetic, nitrogen limited medium, at pH 6±0.5 and a temperature of 28±1 oC, in a shaking incubator. During growth cycle and at regular intervals, cell count, observation in an optical microscope and calculation of the specific oxygen uptake rate, were performed. Scanning Electron Microscopy (SEM) was also used to provide pictures of the different morphological forms of Y. lipolytica. Dimorphism, which refers to the ability of this microorganism to develop distinct cellular forms (yeast-like cells, mycelium), was observed in both glucose- and olive oil-based cultures but only at a low shaking speed, where practically anaerobic conditions prevailed. The morphology of Y. lipolytica was similar upon both substrates whereas more and larger true mycelia and pseudomycelia were noticed in the case of olive oil carbon source. Generally, dimorphism is influenced by the interplay of a variety of environmental stimuli, from which dissolved oxygen seems to have a stronger effect than the carbon source nature, as it is indicated in the present study.

Genome-wide studies in Saccharomyces cerevisiae have revealed that the majority of the genome is transcribed on both strands, producing both coding and non-coding RNAs (ncRNAs). Initially, these ncRNAs were regarded as spurious transcripts but some have since been shown to have important roles as transcriptional regulators. Very little is understood about how ncRNAs are initiated, terminated and processed or how this influences their function. To address these questions, the expression, stability, and subcellular localization of the ncRNAs at the endogenous GAL locus was analysed. This revealed a complex interleaved transcript map, challenging the conventional view of a transcription unit (TU) flanked by 5’ sequences or promoters (P) that initiate transcription and 3’ regions, known as terminators (T), which control events such as transcript cleavage, polyadenylation, export and transcription termination. By creating conventional (PGAL-T) or unconventional (PGAL-P) hybrid TUs at the GAL locus, in which a promoter or terminator is positioned downstream of a galactose-inducible promoter, this work shows that both promoters and terminators are able to initiate antisense transcription to yield stable antisense transcripts. The data suggest that terminators contribute to efficient but variable expression from the promoter. An unconventional P-P TU, lacking a terminator, is transcribed on both strands but the sense transcript remains at low levels, through the repressive action of antisense transcription, and is retained in the nucleus. In contrast, the conventional P-T bi-directional TUs are plastic, with the Rrp6 component of the nuclear exosome and TATA-like sequences in the 3’ UTR determining whether the predominant transcript is antisense or sense. By relieving the repressive action of antisense transcription, this allows high levels of sense transcript to accumulate in the cytoplasm, contributing to gene expression, supporting a novel mode of gene regulation involving components of RNA quality control pathways acting through the 3’ region of genes.

Τα TPRs (Tetratricopeptide Repeats) είναι πρωτεϊνικά μοτίβα επαναλήψεων με μήκος πεπτιδικής αλυσίδας 34 αμινοξικών κατάλοιπων. Περισσότερα από 10000 TPRs έχουν εντοπι-στεί έως σήμερα σε διάφορες πρωτεϊνες, από τα αρχαιοβακτήρια έως τον άνθρωπο. Τα TPRs συμμετέχουν σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Δομικά, κάθε TPR παρουσιάζει τη διαμόρφωση έλικα-στροφή-έλικα σε σχήμα φουρκέτας ενώ διαδοχικά πακεταρισμένα TPRs σχηματίζουν στο χώρο δεξιόστροφη υπερέλικα, στην οποία διακρίνονται μία κυρτή και μία κοίλη επιφάνεια. Το σύμπλοκο πρωτεϊνών Ssn6-Tup1 είναι ένας γενικός συγκαταστολέας της μεταγραφής στη ζύμη. Ομόλογα σύμπλοκα έχουν επίσης βρεθεί σε πολλούς οργανισμούς. Η πρωτεϊνη Ssn6 περιέχει δέκα διαδοχικά TPRs. Η αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών πραγματοποιείται μέσω των τριών πρώτων TPRs της Ssn6 και του Ν-τελικού τμήματος (αμινοξικά κατάλοιπα: 1-72) της Tup1. Σε προηγούμενη εργασία της η ερευνητική μας ομάδα έδειξε με πειράματα μεταλλαξιγένεσης και με δομική μοντελοποίηση, ότι η δομική ακεραιότητα του TPR 1 και η σωστή τοποθέτησή του σε σχέση με το TPR 2 είναι κρίσιμες για τη δέσμευση της Tup1. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε για πρώτη φορά η δομική σταθερότητα του τμήμα-τος της πρωτεϊνης Ssn6 που αλληλεπιδρά με την Tup1, και η σημασία που έχει για την αλληλε-πίδραση το Ν-τελικό άκρο της Ssn6, το οποίο περιλαμβάνει μία εκτεταμένη περιοχή πολυγλου-ταμίνης. Για τη μελέτη εφαρμόστηκαν χαρτογράφηση της πρωτεϊνης Ssn6 με περιορισμένη πρωτεόλυση καθώς και βιοχημικός χαρακτηρισμός και φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού σε επιλεγμένα τμήματα των πρωτεϊνών Ssn6 και Tup1 και στα σύμπλοκά τους. Επιπρόσθετα πραγματοποιήθηκαν, in silico, σύγκριση των TPRs της Ssn6 με άλλα γνωστά TPRs, προβλέψεις της δομικής αστάθειας των TPRs και προσομοίωση μοριακής δυναμικής στο δομικό μοντέλο των TPRs 1-3. Ο συνδυασμός των παραπάνω έδειξε πως όταν απουσίαζει η Tup1 τα TPRs 1 και 2 της Ssn6 βρίσκονται μερικώς αδίπλωτα. Ειδικά η έλικα Β του TPR1 φαίνεται ότι είναι ιδιαίτερα ευκίνητη και ότι εκθέτει μία έντονα υδρόφοβη επιφάνεια στο περιβάλλον μέσo του μορίου. Αντίθετα, όταν τα ίδια τμήματα της Ssn6 συμμετέχουν σε σύμπλοκα με την Tup1 παρουσιά-ζουν την αναμενόμενη δευτεροταγή διαμόρφωση δομικού τμήματος TPR. Παράλληλα, υπάρ-χουν ισχυρές ενδείξεις ότι η μετάβαση από την κατάσταση του τυχαίου σπειράματος προς τη διαμόρφωση α-έλικας συνοδεύεται από τη διευθέτηση των α-ελίκων σε δεμάτια. Τέλος, η παρουσία του Ν-τελικού άκρου της Ssn6 εμποδίζει τη συσσωμάτωση του τμήματος που αποτε-λείται από τα TPRs 1-4 όταν απουσιάζει η Tup1. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα της εργασίας προτείνεται ότι η Ssn6 ανήκει στις φυσικές μερικώς αδίπλωτες πρωτεϊνες. Η έλλειψη δομικής διαμόρφωσης και η δομική ευκαμψία στο TPR1 της πρωτεΐνης εξυπηρετεί την αναγνώριση της πρωτεϊνης Tup1. Ο σχηματισμός συμπλόκου με την πρωτεΐνη Tup1 οδηγεί σε δίπλωμα τα TPRs 1 και 2, σε αντιστοιχία με το μοντέλο συζευγμένου διπλώματος και σύνδεσης του προσδέματος που έχει παρατηρηθεί σε άλλες πρωτεϊνες. Ο σχηματισμός του συμπλόκου πραγματοποιείται με υδρόφοβες αλληλεπι-δράσεις μεταξύ των δύο πρωτεϊνών και από την πλευρά της Ssn6 συμμετέχει κατά κύριο λόγο η κυρτή επιφάνεια της TPR-υπερέλικας. Τα δύο τελευταία συμπεράσματα αναδεικνύουν ένα νέο μηχανισμό TPR-αλληλεπιδρά-σεων, ο οποίος δεν είχε αναγνωριστεί έως τώρα στα TPR-πρωτεϊνικά σύμπλοκα. / The tetratrico peptide repeat (TPR) is a 34 amino acid protein motif. Over 10000 TPRs have been identified in several species from archeobacteria to human. TPRs are protein-protein interaction mediators. Each TPR adopts a helix-turn-helix conformation in the form of α hairpin. Tandem TPRs stack together producing a right handed curved superhelix, with a convex and a concave surface. The Ssn6-Tup1 protein complex is a general transcriptional co-repressor in yeast. Homologous complexes have been identified in many organisms. The Ssn6 protein contains 10 tandem TPRs. TPRs 1-3 interact with the N-terminus (aa: 1-72) of Tup1 to form the complex. Using 3D-modeling and mutagenesis data, our group has previously shown that the structural integrity of TPR 1 and its correct positioning relatively to TPR 2 are crucial for Tup1 binding. In the present study we investigate the structural stability of the Tup1-binding domain of Ssn6 and the importance of the Ssn6 N-terminus, which contains a polyglutamine sequence. For the purpose of the study we used limited proteolysis mapping of Ssn6 and biochemical characterization and circular dichroism spectroscopy of specific Ssn6 and Tup1 segments and their complexes, followed by order/disorder predictions and molecular dynamics simulations. Our data suggest that TPRs 1 and 2 of Ssn6 are partially unfolded with the helix B of TPR 1 being highly dynamic, exposing an apolar surface to the solvent. However, TPRs 1-3 seem to adopt the TPR-typically expected secondary structure when the Ssn6 segment is in association with Tup1. In addition there are strong evidence that a conformational change occurs upon complex formation, consisting of acquisition of a-helical structure with simultaneous stabilization of coiled coil configuration. The presence of the Ssn6 N-terminus prevents the aggregation of the TPR 1-4 segment in the absence of Tup1. According to the above we propose that: Ssn6 is a member of the partially unfolded proteins group. The lack of typical conformation and the structural flexibility of TPR 1 serve the Tup1 recognition and binding. Complex formation followed by TPR 1 and 2 folding is consistent with the coupled folding to binding mechanism, reported on other binding proteins. The Ssn6-Tup1 complex formation is driven by hydrophobic interactions, in which mainly the convex surface of the TPR-superhelix takes part. The later two points reveal a novel interaction mechanism of the TPR motives.

Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε εφαρμογή της Στερικής Μονοφασικής Χρωματογραφίας Χρωματογραφίας βαρυτικού Πεδίου (Μ.Χ.Β.Π.), στη μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας και του pH, στην καταλυτική δραστικότητα εμπορικών στελεχών ζύμης Saccharomyces Cerevisiae. Η τεχνική αυτή είναι απλή, αλλά ευρέως διαδεδομένη τα τελευταία χρόνια, κυρίως για τον προσδιορισμό μεγέθους διαφόρων μορίων και σωματιδίων. Σε αντίθεση με την κλασική χρωματογραφία, στην οποία είναι απαραίτητη η ύπαρξη στατικής φάσης για να επιτευχθεί ο διαχωρισμός των σωματιδίων, στην μονοφασική χρωματογραφία ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με την εφαρμογή κάποιου εξωτερικού πεδίου, που στην προκειμένη περίπτωση είναι το βαρυτικό πεδίο. Η τεχνική αυτή έχει μεγάλο εύρος εφαρμογών, όπως στο διαχωρισμό κολλοειδών σωματιδίων, σωματιδίων αμύλου, κυττάρων ζυμών, καθώς και στην ανάλυση ουσιών με περιβαλλοντικό και φαρμακευτικό ενδιαφέρον. Στην κανονική Μ.Χ.Π όσο μεγαλύτερη μάζα έχουν τα σωματίδια, τόσο πιο αργά θα εκλούονται από την στήλη. Μετά όμως από ένα κρίσιμο όριο η ισορροπία αυτή αντιστρέφεται και τα μεγαλύτερα σωματίδια εκλούονται πρώτα. Σε αυτό το σημείο αρχίζει η εφαρμογή της στερικής Μ.Χ.Β.Π. Ανάλογα με το είδος των κυττάρων που θέλουμε να διαχωρίσουμε καθορίζεται και το εξωτερικό πεδίο που θα εφαρμόσουμε. Με αποτέλεσμα να προκύπτουν και τα διαφορετικά ήδη της μονοφασικής χρωματογραφίας. Στην παρούσα εργασία η Μ.Χ.Β.Π χρησιμοποιήθηκε για την μελέτη και τον χαρακτηρισμό κυττάρων ζύμης, αλλά και για τη συγκριτική μελέτη πάνω στον χρόνο ζύμωσης αλλά και τρόπο ανάπτυξης τους σε θρεπτικά διαλύματα διαφορετικών θερμοκρασιών και pH. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη Zymaflore F-10 και Zymaflore X-5 της ζύμης Saccharomyces cerevisiae. Οι θερμοκρασίες οι οποίες μελετήθηκαν είναι οι 15οC, 20οC, 25 οC και 30 οC , ενώ οι τιμές pH είναι 3,0 , 4,0 , 5,0 και 6,0. Με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα κύτταρα Zymaflore X-5 παρουσιάζουν μικρότερους χρόνους ζύμωσης σε όλες τις τιμές pH και θερμοκρασίας, σε σχέση με τα κύτταρα Zymaflore F-10. Επίσης, βρέθηκε ότι το βέλτιστο pH και για τα δύο στελέχη είναι το pH 5,0, το οποίο είναι και το pH του θρεπτικού, ενώ η βέλτιστη θερμοκρασία ζύμωσης είναι αυτή των 30 οC / In this study the analytical technique of Gravitational Field- Flow Fractionation (Gr-FFF), which is a type of Field Flow Fractionation ( F.F.F. ), was used for the study of the influence of the temperature and pH on the catalytic activity of varying commercial yeast strains of Saccharomyces Cerevisiae. It is a relatively new, simple, low cost and high accuracy technique, which allows the separation of samples according to their size. The F.F.F. technique has been applied for the separation and characterization of colloids, such as yeast cells, proteins, starch granules, polymers, etc. In F.F.F. the separation take place by applying an external field. According to the type of external field which is used for the separation, the different types of the F.F.F. are result. The Gg.F.F.F. separates the particles based on their mass. When the separation takes part in particles of the same chemical composition, which have the same density, the separation is based to their size. In normal F.F.F. the bigger particles take more time to elute, although under a critical size the separation overbalanced and bigger particles do not react to the external force, so they eluted first from the column. This type of F.F.F. is called steric F.F.F, and is the type of FFF we used in the present study The aim of this study was the separation, categorize and the distinction of the phases of yeast cells, during the alcoholic fermentation at different pH and temperature values. The yeast we study, were the Zymaflore F-10 and Zymaflore X-5, two different parts of Saccharomyces Cerevisiae yeast. The pH scale was 3,0 , 4,0, 5,0 and 6,0 and the temperatures were 15οC, 20οC, 25 οC and 30 οC. From the experimental results we concluded that Zymaflore X-5 cells, have the ability to complete the fermentation process, in smaller time periods at all pH and temperature values compared with Zymaflore F-10 cells. Also, we concluded that the optimum pH value for both strains is pH 5,0 , which is the pH of the medium, while the optimum fermentation temperature is 30 ° C