- / -

Η χ-κωνοτοξίνη MrIA, που απομονώθηκε από το δηλητήριο του θαλάσσιου σαλιγκαριού-κώνου Conus Marmoreus, είναι ένα 13-αμινοξέων πεπτίδιο (Asn1-Gly2-Val3-Cys4-Cys5-Gly6-Tyr7-Lys8–Leu9-Cys10-His11-HyP12-Cys13-OH) με δύο δισουλφιδικούς δεσμούς μοτίβου Cys1-Cys4 και Cys2-Cys3. Η κωνοτοξίνη αυτή στοχεύει εκλεκτικά τον μεταφορέα την νορεπινεφρίνης (ΝΕΤ) και αποτελεί πιθανό φάρμακο ως αναλγητικό. Η φαρμακοφόρος ομάδα αποτελείται από τη γ-στροφή που σχηματίζεται από το βρόγχο μεταξύ των Cys στις θέσεις 5 και 10 και από τα ενδιάμεσα αμινοξέα αυτών. Το αμιδιωμένο C-τελικό παράγωγο στο οποίο έχει πραγματοποιηθεί αντικατάσταση της Asn1 με pGlu είναι σήμερα υποψήφιο φάρμακο κατά του νευροπαθητικού πόνου, με ονομασία Xen2174. Οι μελέτες που έχουν ασχοληθεί με τη Ν-τελική περιοχή του χ-MrIA έχουν δείξει πως η Val3, σε αντίθεση με τα δύο πρώτα αμινοξέα της αλληλουχίας, (Asn1, Gly2), παίζει σημαντικό δομικό ρόλο. Σκοπός της διατριβής αυτής είναι η σύγκριση συνθετικών μεθόδων παραλαβής του φυσικού πεπτιδίου χ-MrIA-ΝΗ2 καθώς και ο σχεδιασμός και η σύνθεση αναλόγων του με τροποποιήσεις στην Ν-τελική αλληλουχία. Επίσης συντέθηκε ένα ανάλογο με Ala στη θέση 6 και ένα ανάλογο στο οποίο οι Cys4 και Cys13 έχουν αντικατασταθεί από Glu4 και Lys13 αντίστοιχα Η σύνθεση των αναλόγων πραγματοποιήθηκε με την Fmoc/tBu μεθοδολογία επί στερεάς φάσεως, χρησιμοποιώντας ως στερεό υπόστρωμα την Sieber Amide ρητίνη ή την Rink Amide MBHA ρητίνη. Σαν αντιδραστήρια σύζευξης χρησιμοποιήθηκαν α) DIC/HOBt, β) TBTU/DIEA/HOBt, γ) ΗBTU/DIEA/HOBt, δ) HATU/DIEA. Η δημιουργία των δισουλφιδικών δεσμών έγινε σε δύο στάδια με οξείδωση με DMSO ή / και με οξείδωση με I2/AcOH Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν πως καλύτερες αποδόσεις και καθαρότερα προϊόντα επιτυγχάνονται όταν η επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας γίνεται σε υπόστρωμα Sieber Amide, οι συζεύξεις των αμινοξέων με τη χρήση ουρονικών παραγώγων και η οξείδωση με τη μέθοδο I2/AcOH. Η δομή επιλεκτικών αναλόγων μελετήθηκε με πειράματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). / The χ-conopeptide MrIA isolated from the venom of the cone snail Conus Marmoreus, is a 13-residue peptide with two disulfide bonds forming pairs Cys1-Cys4 and Cys2-Cys3. This conotoxin targets selectively the norepinephrine transporter (NET) and is a potent analgesic. The pharmacophore group consists of an inverse γ-turn formed by the first loop Cys2-Cys3 and the residues located between them. The amidated C-terminal derivative bearing the replacement of Asn1 by pGlu led to the potent drug against neuropathetic pain, Xen2174. However, not much is known about the N-terminal region of χ-MrIA. Studies have shown that Val3 has an important structural role, as opposed to the first two amino acids of the peptide sequence. The aim of this research is the design and synthesis of analogs of χ-MrIA-NH2 with substitutions at residues Asn1, Gly2, Val3, Gly6 as well as Cys4 and Cys13 of the peptide sequence and the comparison of these synthetic methods. These analogues were synthesized by solid peptide synthesis, using the Fmoc/tBu methodology. Sieber Amide resin and Rink Amide MBHA resin were used as solid support and a) DIC/HOBt, b) TBTU/DIEA/HOBt, c) TBTU/DIEA/HOBt, d) HATU/DIEA as coupling reagents. The formation of disulfide bonds was achieved in two steps by oxidation with DMSO and / or oxidation by iodine. We concluded that the preferred method for this peptide synthesis is Sieber Amide as solid support and uronic derivatives as coupling reagents, while for the formation of disulfide bonds, the oxidation with iodine. Some of these analogs are studied by NMR spectroscopy for structure determination.

- / -

- / -

- / -

- / -

- / -

- / -

Το υδρόθειο (H2S) είναι ένα άχρωμο, εύφλεκτο αέριο με τη χαρακτηριστική οσμή του κλούβιου αυγού. Τα τελευταία χρόνια έχει αναγνωριστεί ο ρόλος του ως ένα σηματοδοτικό μόριο για το καρδιαγγειακό και το νευρικό σύστημα και είναι το τρίτο μέλος της οικογένειας των αέριων διαβιβαστών. Παράγεται ενδογενώς μέσω του μεταβολισμού της L-κυστεΐνης από δυο ένζυμα: τη β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (CBS) και τη γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CSE). Ένας τρίτος τρόπος σύνθεσης του H2S από L-κυστεΐνη που ανακαλύφθηκε πρόσφατα είναι μέσω της συνδυασμένης δράσης της σουλφοτρανσφεράσης του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού και της αμινοτρανσφεράσης της κυστεΐνης (3MST/CAT). Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε την εκλεκτικότητα των διαθέσιμων φαρμακολογικών αναστολέων της σύνθεσης του H2S που επιδρούν στα ένζυμα παραγωγής του, CBS και CSE. Για την υλοποίηση της μελέτης έγινε η έκφραση των ενζύμων CSE και CBS ως χιμαιρικές πρωτεΐνες με GST σε βακτήρια E.coli και ακολούθησε η απομόνωση αυτών με χρωματογραφία συγγένειας με τη χρήση στηλών που έχουν ακινητοποιημένη σε σεφαρόζη τη γλουταθειόνη. Έπειτα ελέγχθηκε η δραστικότητα των ανασυνδυασμένων ενζύμων με την μέθοδο του μπλε του μεθυλενίου και στη συνέχεια εξετάσθηκαν οι αναστολείς έναντι και των δυο ενζύμων CSE και CBS. Τα αποτελέσματα μας επιβεβαιώνουν την εκλεκτικότητα της προπαργυλογλυκίνης (PAG) και της β-κυανοαλανίνης (BCA) για το CSE. Από τη μελέτη μας βρέθηκε ότι η β-κυανοαλανίνη (BCA) είναι ισχυρότερος αναστολέας του CSE από την προπαργυλογλυκίνη (PAG) με IC50 14μΜ και 750μΜ, αντίστοιχα. Το αμινο-οξικό οξύ (ΑΟΑΑ) βρέθηκε ότι είναι πιο ισχυρός αναστολέας για το CSE (IC50 1,1μΜ) παρά για το CBS (IC50 8,5μΜ), παρόλο που θεωρητικά είναι εκλεκτικός αναστολέας του CBS. Μάλιστα είναι ισχυρότερος των PAG και BCA, για το CSE. Η τριφθοροαλανίνη και η υδροξυλαμίνη ανέστειλαν και τα δυο ένζυμα, με την τριφθοροαλανίνη να είναι πιο ισχυρός αναστολέας του CBS, ενώ η υδροξυλαμίνη του CSE. Στην παρούσα εργασία εξετάστηκαν επίσης κάποιες νέες ουσίες ως πιθανοί αναστολείς του CSE, οι οποίες δε φαίνεται να είχαν την ικανότητα να προκαλέσουν σημαντική αναστολή του ενζύμου αυτού. Συμπερασματικά, παρόλο που οι αναστολείς PAG και BCA εμφανίζουν εκλεκτικότητα ως προς το CSE έναντι του CBS, δεν υπάρχει, προς το παρόν, κανένας εκλεκτικός αναστολέας για το CBS. / Hydrogen sulphide (H2S) is a colorless, flammable gas with the characteristic smell of rotten eggs. H2S is now recognized as an important signalling molecule in the cardiovascular and nervous systems and is the third member of the gasotransmitter family. H2S is synthesized via two pyridoxal-5′-phosphate-dependent enzymes responsible for the metabolism of L-cysteine: cystathionine beta synthase (CBS) and cystathionine gamma lyase (CSE), as well as by a recently identified third pathway that catalyzes the production of H2S from L-cysteine via the combined action of 3-mercaptopyruvate sulphurtransferase and cysteine aminotransferase (3MST/CAT). In the present study we examined the selectivity of commonly used pharmacological inhibitors of H2S biosynthesis towards CSE and CBS. To address this question human CSE or CBS enzymes were expressed and purified from E. coli as fusion proteins with Glutathione-S-Transferase (GST). After purification the activity of the recombinant enzymes was tested using the methylene blue method. We found that β-cyanoalanine (BCA) was a more potent CSE inhibitor than propargylglycine (PAG) (IC50 14μΜ and 750μΜ, respectively), and that aminooxyacetic acid (AOAA) was even more potent than BCA and PAG towards CSE (IC50 1.1μΜ), although it is claimed to be a CBS-selective inhibitor; AOAA inhibited CBS with an IC50 8.5μΜ. Trifluoroalanine and hydroxylamine inhibited both enzymes with the former being a more potent inhibitor of CBS, while the later of CSE. We also examined some new synthesized substances as CSE inhibitors. In conclusion, although PAG and BCA exhibit selectivity in inhibiting CSE vs CBS, no selective CBS inhibitor is currently available.

- / -