La formation de la jonction neuromusculaire des vertébrés (JNM), une synapse cholinergique périphérique entre les motoneurones et les fibres musculaires squelettiques repose sur la reconnaissance et l’apposition précise des motoneurones présynaptiques sur leurs cibles musculaires postsynaptiques. Les données de la littérature montrent que les morphogènes Wnt agissent comme des régulateurs clés de la formation de la JNM. Cependant, l'identité précise des Wnts, leur collaboration et les mécanismes moléculaires de la signalisation Wnt régissant la formation de la JNM restent encore incompris. A la JNM, la transduction du signal Wnt s’effectue par l'intermédiaire de l’interaction des Wnt soit avec le complexe formé par le récepteur tyrosine kinase MuSK et la lipoprotéine Lrp4 ou les récepteurs classiques Frizzled (Fzd). Dans cette thèse, nous avons étudié les mécanismes moléculaires de la formation de la JNM médiés par les Wnts. Nous avons montré que Wnt4 et Wn11 sont nécessaires pour l’étape indépendante du nerf de prepatterning musculaire, caractérisée par l’agrégation des récepteurs de l’acétylcholine (RACh) dans des domaines discrets de la surface du muscle où la future synapse va se former, via l'activation différentielle des voies canonique et polarité cellulaire planaire (PCP). De plus, Fzd3 et Vangl2, deux composantes essentielles de la voie PCP, sont accumulées à la JNM et sont impliquées distinctement dans la formation de la JNM, Fzd3 étant nécessaire à la croissance des axones moteurs alors que Vangl2 joue un rôle dans l’agrégation du RACh et la restriction de la croissance des axones moteurs une fois leur cible musculaire atteinte. Pour étudier le rôle fonctionnel de l'interaction Wnt/MuSK, nous avons généré une souris transgénique délétée du domaine de liaison de MuSK aux Wnts (CRD, domaine riche en cystéines). Nous avons démontré que l'absence du CRD de MuSK affecte la formation de la JNM dès l’étape deprepatterning jusqu’à la maintenance de la JNM chez l’adulte, aboutissant à un phénotype pathogène. De plus, nous avons montré que le lithium, un inhibiteur réversible de la glycogène synthase kinase-3 restaure les défauts de formation de la JNM chez les embryons mutants et pourrait constituer un nouveau réactif thérapeutique pour le traitement des maladies neuromusculaires liées à une déficience de la voie de signalisation Wnt/MuSK. / Formation of the vertebrate neuromuscular junction (NMJ), a peripheral cholinergic synapse between motoneurons and skeletal muscle fibers relies on the accurate recognition and apposition of presynaptic motoneurons on postsynaptic muscle target. Recently, a growing body of evidence indicates that Wnt morphogens act as key regulators of NMJ formation. Yet, the specific Wnts identity, their collaborative function and the downstream molecular mechanisms of Wnt signaling regulating NMJ formation still remain elusive. At the NMJ, Wnt ligands transduce their signal through interaction of either the receptor complex formed by the muscle specific tyrosine kinase MuSK and the low density lipoprotein (Lrp) Lrp4 or the classical frizzled receptors. In this thesis, we have investigated the molecular mechanisms of Wnt-induced NMJ formation. We found that both Wnt4 and Wn11 are required for the nerve-independent muscle prepatterning step, characterized by acetylcholine receptor (AChR) aggregation in discrete domains of the muscle surface where the synapse will form, via differential activation of either canonical and/or planar cell polarity (PCP) pathways. Moreover, Fzd3 and Vangl2, two core components of the PCP pathway, are accumulated at the developing NMJ and play distinct roles in NMJ formation, with Fz3 required for motor axon growth and Vangl2 involved in AChR clustering and motor axon growth restriction within the target field. To further study the functional role of Wnt/MuSK interaction, we generated a transgenic mice deleted from MuSK Wnt binding domain (CRD, cysteine rich domain). We demonstrated that the absence of MuSK CRD affected NMJ formation from the prepatterning step to NMJ maintenance in adult leading to a pathogenic phenotype. Moreover, we found that lithium, a reversible inhibitor of the glycogen synthase kinase-3 fully rescued NMJ defects in mutant embryos and therefore may constitutes a novel therapeutic reagent for the treatment of neuromuscular disorders linked to Wnt/MuSK signaling pathway deficiency.

En cas de pertes de substances osseuses de grande étendue, la capacité naturelle de réparation du tissu osseux n’est pas suffisante et nécessite d’être assistée. La greffe d’os autologue constitue actuellement la référence. Cependant, cette thérapeutique présente tout de même des inconvénients qui ont entrainé le développement de substituts osseux. Mais, aucun matériau à ce jour ne peut remplacer totalement l’os autologue, en raison notamment de la difficulté à recréer un système vasculaire fonctionnel au niveau du site lésé. Depuis quelques années, les espoirs se tournent vers la création d’un substitut osseux prévascularisé afin de pallier la principale limite des alternatives actuelles : l’établissement d’un réseau vasculaire au sein de ce biomatériau. Notre projet vise à évaluer l’effet stimulateur d’un composé naturel, les principes actifs de la nacre solubles dans l’éthanol (appelé Ethanol Soluble Matrix, ESM), à la fois sur les capacités angiogéniques de cellules de la lignée endothéliale et sur la différenciation ostéogénique de cellules souches mésenchymateuses (CSM) avec comme objectif le développement d’un substitut osseux prévascularisé. Dans un premier temps, nous avons montré que l’ESM stimulait les capacités angiogéniques des cellules de la lignée endothéliale : cellules endothéliales matures (HUVECs, cellules endothéliales issues de la veine ombilicale humaine) et cellules progénitrices endothéliales (CPEs) issues de sang de cordon. L'ESM, utilisé à la concentration de 200µg/mL, a permis de dépasser les résultats obtenus (expression génique et test fonctionnel) avec le milieu de culture de référence des CPEs : l’EGM-2 (Endothelial Growth Medium). Nous avons ensuite mis en évidence que l’ESM exerçait un effet stimulateur également sur les CSMs en augmentant l’expression de marqueurs spécifiques des chondrocytes et des chondrocytes hypertrophiques, suggérant une orientation de ces cellules vers une ossification endochondrale. En parallèle de ces travaux, nous avons étudié l’effet paracrine des CSMs sur les cellules de la lignée endothéliale, HUVECs et CPEs. Les vésicules extracellulaires de taille nanométrique (nEVs) ont montré leur capacité à induire une stimulation in vitro de la formation de réseaux vasculaires et de l’expression de gènes endothéliaux. Ces résultats encourageants soulignent la faisabilité de l’utilisation de l’ESM en tant que stimulus à la fois de l’angiogenèse des CPEs et de l’ostéogenèse des CSMs. Ce stimulus pourrait être associé aux nEVs issues de CSMs et aux CPEs au sein d’une matrice tridimensionnelle pour développer un substitut osseux prévascularisé / In case of critical-sized defects, the bone tissue ability of natural healing is not sufficient and needs to be assisted. The autologous bone graft is currently the gold standard. However, this solution has drawbacks that have led to the development of bone substitutes. Nowadays, no substitute is able to supply autogenous bone, due to the difficulties to mimic the vascular system. In recent years, the hopes are focusing on the creation of a prevascularized bone substitute to overcome the main limitation of current alternatives: the creation of a functional vascular network inside the substitute. Our project aims to evaluate the stimulating effect of a natural compound, the nacre extracts called Ethanol Soluble Matrix (ESM), both on the angiogenic abilities of endothelial cell lineage and on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) to develop a pre-vascularized bone substitute. First, we showed that ESM stimulates the angiogenic potential of two types of endothelial cells: mature endothelial cells (HUVECs, human umbilical vein endothelial cells) and endothelial progenitor cells (EPCs) from cord blood. The ESM, used at the concentration of 200µg/mL, exceeded results obtained with the reference culture medium of EPCs: the EGM-2 (Endothelial Growth Medium). Then, we demonstrated that ESM also exerted a stimulating effect on MSC by increasing the expression of chondrocyte and hypertrophic chondrocyte specific markers, suggesting an orientation of these cells towards endochondral ossification. In line with this work, we studied the paracrine effect of MSCs on endothelial cell lineage, HUVECs and EPCs. Nanoscale extracellular vesicles (nEVs) have been shown to induce an in vitro stimulation of the vascular network formation and of the endothelial gene expression. These encouraging results highlight the feasibility of using ESM as a stimulus for both angiogenesis of EPCs and osteogenesis of MSCs. This stimulus could be associated with MSC-derived nEVs and EPCs within a three-dimensional matrix to develop a pre-vascularized bone substitute