Ο καρκίνος αποτελεί μια από τις μεγαλύτερες μάστιγες της σύγχρονης ζωής. Η ιστολογική εξέταση των νεοπλασμάτων (τόσο στις πρωτοπαθείς εστίες όσο και στις δευτεροπαθείς εναποθέσεις) αποκαλύπτει ότι οι όγκοι αποτελούν ένα ετερογενές σύνολο άμορφων και έμμορφων στοιχείων. Η νεοπλασματική μάζα εκτός από τα καρκινικά κύτταρα, περιλαμβάνει ποικίλα κύτταρα (ινοβλάστες, κύτταρα αγγείων, μακροφάγα, φλεγμονώδη κύτταρα, λιποκύτταρα) και στοιχεία της εξωκυτταρίου ουσίας (κολλαγόνο, ελαστικές ίνες, πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας) τα οποία στη μεγάλη πλειοψηφία τους προσελκύονται, άμεσα ή έμμεσα, από τα κακοήθη κύτταρα. Τα κύτταρα του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος δεν αποτελούν αδρανείς παρατηρητές της καρκινικής διεργασίας αλλά συμμετέχουν ενεργά σε αυτή καθώς αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό, καταστέλλουν την απόπτωση, ευνοούν την επιβίωση, διευκολύνουν τη μετανάστευση και εξασφαλίζουν την επαρκή θρέψη και οξυγόνωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Η μελέτη των ποικίλων αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται στο καρκινικό μικροπεριβάλλον ανάμεσα στα καρκινικά κύτταρα και τα στοιχεία του ξενιστή αποκαλύπτει καινούργιους θεραπευτικούς στόχους στην αντικαρκινική θεραπεία και βοηθάει στην κατανόηση του μηχανισμού των μεταστάσεων, δημιουργώντας την ελπίδα της αποτελεσματικότερης αντιμετώπισης του καρκίνου. Στην παρούσα εργασία γίνεται μια συνολική αναφορά της συμμετοχής όλων των στοιχείων του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος στη νεοπλασματική εξεργασία. Επίσης καταβάλλεται προσπάθεια να τονιστούν οι σύνθετες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα καρκινικά κύτταρα και το μικροπεριβάλλον. / Cancer is a devastating disease. Histologic examination of neoplasms (in the primary sites and their metastases as well) reveals that tumors are composed of a heterogeneous population of cells (fibroblast, vascular cells, macrophages, inflammatory cells, lipocytes) and extracellular matrix proteins (ECM) (collagen, elastin fibers, other ECM proteins). Recruitment of non-neoplastic tissue (stromal cells and ECM) to the tumor microenvironment is mostly mediated, directly or indirectly, by the malignant cells. Stromal cells are not quiescent bystanders of the neoplastic process. Instead they have an active role since they promote the proliferation, growth and migration of the tumor cells, inhibit their apoptosis and support tumor supply of oxygen and nourishment. In addition, stromal cells and ECM network protect cancer cells from the host defense. Research on the evolving crosstalk between the different cell types and ECM molecules within the tumor mass can disclose new therapeutic targets and help elucidate the pathogenetic mechanisms underlying metastasis, thus leading to a more effective anticancer therapy. This study discusses the potential role of the different stromal compartments in cancer initiation and progression and emphasizes the complex crosstalk between cancer cells and their microenvironment.

Η διπλωματική εργασία περιγράφει μια μέθοδο επίλυσης του προβλήματος προσδιορισμού των γεωμετρικών χαρακτηριστικών ανθρώπινων ερυθρών αιμοσφαιρίων από προσομοιωμένες εικόνες σκέδασης ΗΜ ακτινοβολίας He-Ne laser 632.8nm. Αρχικά παρουσιάζεται το ευθύ πρόβλημα σκέδασης ΗΜ ακτινοβολίας από ανθρώπινο ερυθρό αιμοσφαίριο και στη συνέχεια το αντίστροφο πρόβλημα επιλύεται με χρήση τεχνικών συμπίεσης εικόνας και τεχνητού νευρωνικού δικτύου ακτινικής συνάρτησης. Τέλος, αναπτύσσεται μια τεχνική εύρεσης των αναλογιών των ερυθρών αιμοσφαιρίων στις εικόνες σκέδασης. / This thesis describes a method of estimating the geometrical features of the human red blood cell, from a set of simulated light scattering images produced by a He-Ne laser beam at 632.8nm. The light scattering problem by a human RBC is presented and afterwards the inverse problem is solved using image compression techniques and a radial basis function neural network. Finally, a method of finding the ratio of RBCs in the scattering images is developed.

Dans l’organisme, le fer assure le transport d’oxygène jusqu’à tous les organes, via l’hémoglobine des globules rouges. L’hepcidine, une hormone hépatique hyposidérémiante, contrôle le taux de fer sérique mis à disposition pour la synthèse de nouveaux globules rouges. La régulation de l’hepcidine implique un grand nombre de protéines, dont l’expression et l’activité répondent à la charge en fer de l’organisme. Récemment, la sérine protéase membranaire Matriptase-2 (MT2), synthétisée par le foie, a été identifiée comme actrice clé dans l’inhibition de la synthèse d’hepcidine. En effet, des mutations du gène Tmprss6 causent la synthèse de MT2 inactives, chez l’Homme et la souris, menant à une hyperhepcidinémie ; cet excès d’hormone génère une anémie de cause génétique, résistante à l’apport en fer (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Suite à des expériences in vitro, il a été proposé que MT2 inhibe l’expression de l’hepcidine en dégradant l’hémojuvéline (HJV), une protéine appartenant à la voie principale activant la synthèse de l’hormone ; le clivage d’HJV par MT2 bloquerait ainsi le signal passant par cette voie. Toutefois, des études in vivo ont montré que la protéine HJV exprimée par le foie diminue en absence de MT2. Le rôle de la protéase dans l’inhibition de l’hepcidine ne semble donc pas se limiter à l’interaction et au clivage de HJV par MT2. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de MT2 pour réguler l’homéostasie du fer, nous avons donc étudié son rôle in vivo, en absence de Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), l’activateur principal de la voie de régulation de l’hepcidine (double knock-out Bmp6 Tmprss6), et durant le développement embryonnaire et post-natal. L’analyse de ces modèles murins nous a ensuite incités à observer la conséquence d’une surexpression de MT2 in vivo et in vitro : l’excès d’activité catalytique dans ces conditions montre l’importance cruciale de réguler finement l’expression et l’activité des protéases. La synthèse de MT2 s’effectuant presque exclusivement au niveau des hépatocytes, nous avons finalement cherché à identifier les partenaires et cibles potentielles de MT2 dans ces cellules exclusivement, en isolant des hépatocytes primaires de souris WT pour les comparer à ceux de souris Tmprss6-/-, par transfection, mais également en utilisant différentes techniques de protéomique. Ces études ont permis de préciser l’importance de MT2 dans la régulation de l’hepcidine, mais aussi à quel point il est nécessaire de contrôler l’expression et l’activité catalytique de cette protéase, et donc que ses partenaires sont indispensables à sa fonction. / In the organism, iron takes care of oxygen transport until every organ, via haemoglobin of red blood cells. Hepcidin, a hepatic hyposideremic hormone, controls plasmatic iron levels at diposal for new erythroblasts synthesis. Hepcidin regulation implies a huge amount of proteins, whose activity and expression answer to iron body. Recently, membrane serine protease Matriptase-2 (MT2), synthetised by liver, has been identified as a key factor in hepcidin synthesis inhibition. Indeed, mutations of the Tmprss6 gene lead to synthesis of inactive MT2, in human and mouse, and result in hyperhepcidinemia: this excess of hormone generates an anemia of genetic cause, that resists to iron oral therapy (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Following in vitro experiments, it was suggested that MT2 inhibits hepcidin expression by degrading hemojuvelin (HJV), a protein part of the main signaling pathway positively regulating hepcidin synthesis; HJV cleavage by MT2 would then stop the signal. However, in vivo studies have shown that HJV expressed by the liver decreases in case of MT2 loss. The protease role in hepcidin inhibition seems to not be limited to HJV-MT2 interaction and cleavage. In order to better understand MT2 function in iron metabolism, we studied its role in vivo, when Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), the main activator of hepcidin regulatory pathway, is missing (double knock-out Bmp6 Tmprss6 mice), and during embryonic and postnatal development. Analysis of these mice models incited us to study the consequences of MT2 overexpression, in vivo and in vitro: excess of catalytic activity in these conditions show how crucial it is to tightly regulate proteases expression and activity. MT2 expression is almost exclusively restricted to hepatocytes; we then decided to identify its potential partners and targets in these cells, by isolating primary hepatocytes from WT mice, to compare them to Tmprss6-/- ones. These cells were transfected, and analysed by proteomic. These studies allowed us to precise MT2 importance in hepcidin regulation, but also how crucial it is to regulate expression and catalytic activity of this protease, and how its partners are essential for its role.

Les capacités de cicatrisation de la gencive en font un modèle de régénération tissulaire naturelle. Ces capacités sont liées en grande partie à l’activité des fibroblastes. Composante cellulaire principale du tissu conjonctif gingival, ils sont au cœur de la régulation des réponses inflammatoires et des processus de cicatrisation. Nous avons supposé que ce tissu pouvait contenir des cellules souches, pouvant expliquer en partie, ces capacités de réparation. Au cours de cette thèse, nous avons pu mettre en évidence la présence de cellules souches mésenchymateuses aux propriétés communes avec les cellules souches adultes dérivées des crêtes neurales. Ces cellules expriment des marqueurs spécifiques des cellules souches et des crêtes neurales. Par ailleurs, elles présentent des capacités d’auto-renouvellement et de multipotence. Elles sont, en effet, capables de se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la différenciation chondro/endochondrale. La culture des cellules, sous forme de sphères en suspension, a permis de mettre en évidence leurs capacités de différenciation en tissus cartilagineux et articulaires. Elles s’organisent spontanément en plusieurs types cellulaires différents, générant notamment des chondrocytes hypertrophiques et des synoviocytes selon leur localisation au sein des sphères et du milieu de culture utilisé. Le comportement de ces cellules soumises à ces conditions a permis de montrer leurs facultés à reproduire, in vitro, des processus proches de ceux retrouvés au cours du développement. Ces résultats permettent une meilleure compréhension des phénomènes de différenciation des cellules souches adultes, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour des applications en thérapie cellulaire articulaire et osseuse. / The healing capacity of the gingiva makes it a model of natural tissue regeneration. These capabilities are largely related to the fibroblast activity. They are the main cellular component of the gingival connective tissue and they regulate inflammatory responses and healing process. We hypothesized that this tissue could contain stem cells, which could explain, in part, these repair capabilities. In this thesis, we were able to demonstrate the presence of mesenchymal stem cells with properties shared with the neural crest-derived adult stem cells. These cells express specific markers of stem cells and neural crest. Moreover, they do have the capacity to self-renew and multipotency. They are, indeed, able to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteocytes. We have particularly focused on the chondro / endochondral differentiation. When cultivated as micromasses cultures in suspension, cells were able to differentiate into cartilage and joint tissues. They organize themselves spontaneously into several different cell types, including hypertrophic chondrocytes and synoviocytes depending on their location within the micromasses and the culture medium used. The behavior of these cells under these conditions has shown their ability to replicate in vitro, close to those found during the development process. These results allow a better understanding of adult stem cells differentiation, opening new perspectives for applications in joint and bone cell therapy.

PiT1/SLC20A1 a été identifiée pour la première fois comme récepteur rétroviral, puis de nombreuses autres études réalisées in vitro ont permis de révéler ces différentes fonctions. PiT1 est notamment un transporteur de phosphate-sodium dépendant. Par le biais de cette activité de transporteur de phosphate inorganique (Pi), PiT1 est impliqué dans plusieurs processus cellulaires comme la minéralisation osseuse, la calcification vasculaire (dans certaines pathologies), et la réabsorption rénale et intestinale de Pi. Dans notre laboratoire, afin de mieux caractériser les fonctions physiologiques de PiT1, un Knock Out (KO) total pour cette protéine a été généré. Les souris présentent un phénotype létal embryonnaire et une atteinte hépatique. Au vu de ces résultats, d’autres études, réalisées dans le laboratoire, ont mis en évidence l’implication de PiT1 dans la prolifération et l’apoptose cellulaire. Ces fonctions nouvellement décrites sont spécifiques à PiT1 et indépendantes de sa fonction de transporteur de Pi.Les objectifs majeurs de mon travail de thèse ont consisté à mieux comprendre le rôle de PiT1 dans les mécanismes apoptotiques déclenchés par le TNF-α. Pour cela, j’ai étudié la cascade d’activation du TNF-α dans les cellules Hela exprimant de manière stable un shPiT1 ou un shScramble. En effet, mes résultats suggèrent que l’association de TRAF2 ; un élément clé de l’activation de la voie des MAPKs ; à PiT1 par le bisais de sa large boucle intracellulaire, permettrait la dissociation des kinases en amont de la voie des MAPKs, GCK (MAP4K) et MLK3 (MAP3K), induisant leur désactivation et ainsi la régulation négative de JNK. La désactivation de JNK induit à son tour à l’inhibition des caspases et donc la signalisation apoptotique. Par ailleurs, j’ai montré que la suractivation de JNK dans les cellules invalidées pour PiT1 corrèle avec la dissocition antérieur du complexe TRAF2-cellular Inhibitor of Apoptosis Proteins (cIAPs). Ainsi, le complexe pro-apoptotique formé de la caspase-8, la protéine FAS-Associated via Death Domaine (FADD) et du Receptor Interactinf Protein 1 (RIP1) était plus actif.Par ailleurs, la boucle PiT1 et la boucle PiT2 ; son homologue ; ont été échangées, permettant ainsi l’obtention des protéines chimères P2-BclP1 et P1-BclP2. Celles-ci représenteraient des outils intéressants pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires engagés dans cette voie apoptotique. Enfin, le rôle de PiT1 dans l’apoptose induite par le TNF-α étudié dans des modèles cellulaires a été confirmé dans deux modèles murins faisant ainsi et pour la première fois un lien entre PiT1 et une pathologie inflammatoire, l’hépatite fulminante. Ces résultats montrent que l’absence de PiT1 sensibilise le foie à l’apoptose; à l’appui d’autres résultats ; PiT1 pourrait être considéré comme une cible thérapeutique dans des pathologies inflammatoires et cancéreuses. / PiT1/SLC20A1 was identified for the first time as retroviral receptor then phosphate inorganic-dependent sodium transporter activity. Through this more a function of phosphate inorganic (Pi) transporter, PiT1 is involved in multiple cellular processes such as bone mineralization, vascular calcification, renal and intestinal reabsorption of Pi. In our laboratory, a total mice Knock Out (KO) for this gene encoding for PiT1 was generated to characterize its physiological functions. The embryonic mice PiT1 KO have a lethal phenotype through liver damage. We have previously found that additional transport-independent functions. PiT1 is involeved in proliferation and in the regulation of tumour necrosis factor (TNF)-induced apoptosis. Modulated cells was mediated by an increased activation of c-Jun N-terminal Kinase (JNK).The aim of my study was to define the role of PiT1 in apoptotic mechanisms of TNF-α signaling. For that, I have studied the regulation cascade of TNF-α pathway in Hela cells expressing shPiT1 or shScramble. My results suggest that intra-cytoplasmic loop domain of PiT1 was interact with TRAF2 ; a key element in the MAPK pathway activation. Furthermore, we also have shown that TNF-induced association of two JNK upstream kinases (Germinal Centre Kinase (GCK or MAP4K) and Mixed Lineage Kinase 3 (MLK3 or MAP3K) to PiT1 suggesting that PiT1 inducing their deactivation and thus down-regulation of JNK. Furthermore, we have shown that JNK increased signalling in PiT1-depleted cells correlates with the earlier dissociation of TRAF2 – cellular Inhibitor of Apoptosis Proteins (cIAPs) complexes. Thus, the apoptotic complex formed by caspase-8, Fas-Associated protein via Death Domain (FADD) and Receptor Interacting Protein 1 (RIP1) was more effectively activated. Moreover, PiT1 and PiT2 loops, were exchanged, thus allowing obtaining chimeric proteins BclP1-P2 and P1-BclP2. These proteins represent valuable tools to explore the mechanisms involved in the apoptotic pathway. Finally, we confirmed the relevance of these observations in vitro and showed that PiT1 gene conditional deletion in the liver of adult mice increases their sensitivity to fulminant hepatitis TNF-induced. These results are the first report of the involvement of PiT1 in a fatal pathology.

La prééclampsie est une maladie humaine qui affecte 3-8 % des grossesses dans le monde, cliniquement définie par l’apparition de novo d’une hypertension et d’une protéinurie. La cause initiale de la maladie semble être liée à un défaut de vascularisation placentaire, ce qui entraine des cycles d'hypoxie – ré-oxygénation, une ischémie placentaire et la libération de débris placentaires dans la circulation maternelle. Ces derniers sont responsables d'une activation endothéliale généralisée, exacerbée par un état pro-coagulant et pro-inflammatoire. Pour mieux caractériser la réponse des cellules endothéliales aux facteurs plasmatiques présent dans la circulation maternelle des femmes prééclamptiques , nous avons choisi une approche à l’échelle du génome entier pour évaluer le profil d'expression génique (grâce à des puces d’expression) de la lignée de cellules endothéliales humaines de la veine ombilicale (HUVEC) cultivée avec du plasma prééclamptique, comparée au profil de cellules cultivées avec du plasma humain provenant de grossesses normales. Cette étude nous a permis d'identifier différents gènes modulés dont celui codant la protéine de dimérisation Jun 2 (JDP2, diminué près de trois fois) qui pourrait être responsable d'une partie des modifications transcriptomiques trouvées. De façon intéressante en effet, inhiber JDP2 par une approche de siRNA régule significativement à la baisse (entre autres) l'expression du VEGF, imitant ainsi les effets du plasma prééclamptique sur les HUVEC. Dans la dernière partie de mon projet, nous nous sommes particulièrement concentrés sur l'impact de l’inhibition de JDP2 sur des gènes induits par l'hypoxie. La tension partielle basse en oxygène modifie l'expression génique par l'intermédiaire de la stabilisation du facteur de transcription HIF- 1a. En fait, dans un état hypoxique, HIF- 1a échappe à la dégradation par le protéasome, il forme alors des hétérodimères avec ARNT (HIF- 1ß) et induit l'expression de gènes ayant un élément de réponse à l’hypoxie (HRE) dans leur promoteur. L'induction de l'expression du VEGF dans des conditions d’hypoxie constitue un des premiers modèles de l’effet de l’hypoxie sur l’expression génique et c’est également un des mieux caractérisés. Afin d'évaluer le rôle de JDP2 sur l'expression du VEGF, et plus généralement sur des gènes cible de l’hypoxie, nous avons cultivé des cellules HUVEC dans des conditions de normoxie et d’hypoxie. Les mêmes conditions ont été utilisées en association avec la transfection de siRNA contre JDP2. En conclusion, dans des conditions d’hypoxie, l’inhibition de JDP2 a un impact négatif sur l'expression du VEGF. De plus, JDP2 semble être un médiateur essentiel de l'expression génique induite par l'hypoxie, car il est nécessaire à une activité complète de promoteur contenant des HRE (démontré dans des essais luciférase). / Preeclamspia is a unique human disorder which affects 3-8% of pregnancies worldwide, clinically defined as the new onset of hypertension and proteinuria. The root cause of the disease seems to be linked to a defect of placental vascularization, which enhances cycles of hypoxia –reoxygenantion, placental ischemia and the release of placental debris into maternal circulation. The latter ones are responsible for a widespread endothelial activation, exacerbated pro-coagulable and pro-inflammatory state. To best characterize the response of endothelial cells to the plasma factors present in maternal circulation of preeclamptic women, we chose a genome –wide approach in order to evaluate the gene expression profile of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) line cultivated with preeclamptic plasma, compared to cells cultivated with human plasma coming from normal pregnancies. This study allows us to identify the gene Jun Dimerization Protein2 (JDP2) which could be responsible for part of transcriptomic modifications. Interestingly inhibiting JDP2 by the use of siRNA significantly down- regulates VEGF expression, thus mimicking the effects of preeclamptic plasma on HUVEC. In the last part of my project we focus specifically on the impact of JDP2 knock down on hypoxia- induced genes. Low oxygen tension modifies gene expression via the stabilization of the transcription factor HIF-1a. In fact under hypoxic condition, HIF-1a escapes from proteasomal degradation, it forms heterodimers with ARNT (HIF- 1ß) and induces the expression of genes having a Hypoxia Responsive Element (HRE) in their promoter. One of the first and best characterized models of the effect of hypoxia on gene expression is the induction of VEGF expression under hypoxic condition. In order to evaluate the contribution of JDP2 to VEGF expression, and more generally to hypoxia target genes, we cultivate HUVEC in normoxic and hypoxic condition. The same conditions were used in association with transfection of siRNA against JDP2. In conclusion, under hypoxic condition, JDP2 down- regulation has a negative impact on VEGF expression. Moreover, JDP2 seems to be an essential mediator of hypoxia –induced gene expression, since it is necessary for a full HRE promoter activity (demonstrated by Luciferase assays).

Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif spécialisé recouvrant les surfaces osseuses et assurant, avec d’autres tissus comme la membrane synoviale, le bon fonctionnement des articulations. Le cartilage est composé d'un type cellulaire, le chondrocyte, qui assure la synthèse et la dégradation d’une matrice extracellulaire essentielle à ses propriétés mécaniques. Les articulations, en conditions physiologique et pathologique, sont soumises à deux stress principaux agissant sur l’homéostasie du cartilage : le stress mécanique et le stress inflammatoire. Le premier objectif de ma thèse était d’étudier l’effet d’un stress mécanique de type étirement sur le profil d’expression des gènes dans des chondrocytes articulaires de lapin en culture primaire en utilisant une approche à grande échelle (micro‐arrays). Nous avons identifié 36 et 57 transcrits répertoriés dans le génome de lapin et dont les taux d’expression sont respectivement augmentés et diminués par un étirement équibiaxial cyclique (5%, 1Hz, 20h). Certains gènes sont connus pour leur implication dans l’inflammation, la mort cellulaire et la dégradation matricielle. Parmi eux, celui de la relaxine (RLN) était le gène le plus induit par l’étirement. La relaxine, hormone peptidique de la superfamille de l’insuline/relaxine, est connue pour son implication dans la reproduction et la grossesse. En revanche son rôle dans le cartilage articulaire restait à étudier. Le deuxième objectif de ma thèse était, par conséquent, de caractériser la fonction de la RLN dans le cartilage. Mes résultats de RT‐PCR quantitative montrent pour la première fois que la quantité des transcrits de la RLN est augmentée par le stress mécanique et le stress inflammatoire (traitement par l’interleukine‐1) dans des chondrocytes articulaires de lapin. De plus, la quantité des transcrits de la RLN est diminuée au cours de la dédifférenciation des chondrocytes. Dans un modèle de gonarthrose induite chez la souris par déstabilisation du ménisque médial, j’ai montré par immunofluorescence que la RLN est principalement présente au niveau des couches superficielles du cartilage de genou et que son expression diminue dans le cartilage arthrosique par rapport au cartilage normal. De plus, le traitement par de la RLN de chondrocytes de lapin augmente l’activité de la métalloprotéinase MMP‐9 impliquées dans la dégradation du cartilage. En conclusion, cette étude montre que la RLN est sensible aux stress mécanique et inflammatoire et la dédifférenciation des chondrocytes. Elle suggère que cette hormone pourrait moduler l’homéostasie du cartilage. La RLN est donc une cible potentielle d’intérêt dans les pathologies ostéoarticulaires. / The articular cartilage is a specialized conjunctive tissue covering bone surfaces. It ensures, together with other tissues like the synovial membrane, the right functioning of the articulations. The cartilage is formed of one cellular type, the chondrocyte, which is responsible for the synthesis and degradation of the extracellular matrix required for its mechanical properties. The joints, under physiological and pathological conditions, are subjected to two main types of stress that affect cartilage homeostasis: mechanical stress and inflammatory stress. The first objective of my PhD thesisis is to study the effect of stretching, one type of mechanical stress, on the gene expression profile in rabbit articular chondrocytes in culture using a large scale approach (micro‐arrays). 36 and 57 transcripts of the rabbit genome which are up‐regulated and down‐regulated by equibiaxial cyclic tensile stretching (5%, 1Hz, 20h) respectively were identified. Some of these genes are known for their implication in inflammation, cell death and matrix degradation. Among them, the relaxin (RLN) gene is the most induced by stretching. RLN is a peptide hormone that belongs to the insulin/relaxin superfamily. It is known for its implication in reproduction and pregnancy. However, the role of RLN in cartilage is still to be studied. The second objective of my PhD thesis is, consequently, to characterize the function of RLN in cartilage. My qRT‐PCR results show, for the first time, that the RLN transcript levels increase upon mechanical and inflammatory (interleukin ‐1treatment) stress in rabbit articular chondrocytes. Moreover, RLN transcript levels decrease during cell dedifferentiation. In a model of gonarthrosis induced in mice by destabilization of the medial meniscus, I showed by immunofluorescence that RLN is mainly present in the superficial layers of the knee cartilage and that its expression decreases in osteoarthritic cartilage as compared to normal cartilage. Furthermore, treatment of rabbit chondrocytes with RLN increases the activity of the metalloproteinase MMP‐9 involved in cartilage degradation. In conclusion, this study shows that RLN is sensitive to mechanical and inflammatory stress and to chondrocyte dedifferentiation. It also suggests that this hormone could modulate cartilage homeostasis. Therefore, RLN is a potential target in osteoarticular pathologies.

Le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) a été identifié en 1989. Vingt-cinq ans après, les mécanismes contrôlant sa fine expression, sont encore mal compris. Bien qu’environ 1980 mutations aient été découvertes, il reste des patients pour qui le génotype n’a pas été établi. Les éléments de régulation, décrits au sein du promoteur, ne peuvent à eux seuls expliquer cette complexe régulation tissu spécifique. Des éléments de régulation à distance, en cis ou en trans, sont certainement impliqués dans ce contrôle d’expression. L’objectif de ce projet est de mieux décrypter les mécanismes de régulation à distance du gène CFTR en identifiant des séquences régulatrices éloignées, mais pouvant, par des mécanismes de repliement, interagir spécifiquement avec celui-ci. Afin d’étudier ces contacts chromosomiques, nous avons, dans un premier temps, mis au point la technique de Capture de Conformation Chromosomique (3C). Suite à cette technique, nous sommes passés à une approche à plus grande échelle, la technique de Copie Conforme de 3C (5C), qui permet de mesurer des milliers d’interactions chromatiniennes en une analyse. L’organisation spatiale d’une région d’environ 790 kb recouvrant le gène CFTR, a été analysée dans des cultures primaires de cellules épithéliales nasales, exprimant le gène CFTR et des fibroblastes de peau, ne l’exprimant pas ou très peu. Les interactions entre les régions de ce locus et le promoteur CFTR ont été étudiées par séquençage nouvelle génération sur Ion PGM™. Nous avons comparé ces conformations chromatiniennes afin d’identifier des éléments de régulation spécifiques d’une expression de CFTR. Notre approche a été validée par l’identification de régions régulatrices précédemment décrites. De plus, nous avons mis en évidence de nouveaux contacts chromatiniens avec le promoteur CFTR. Ces régions semblent fortement impliquées dans la régulation de l’expression du gène CFTR. Grâce à la technique 3C et ses variantes, l’identification de nouvelles mutations à distance du gène pourraient expliquer des dérégulations de son expression. / The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene was identified in 1989. Twenty five years later, the regulatory mechanisms controlling its complex expression are still not fully understood. Although, almost 1980 mutations have been identified, many cases of cystic fibrosis or CFTR Related Disorders remain still of unknown origin. The promoter which binds transcription factors and drives some aspects of CFTR gene expression, cannot alone account for tissue specific control. This implicates other distal cis- or trans-acting elements in cell-type-specific regulation of CFTR expression. The aim of our project is to study long-range regulatory elements of the CFTR gene, which could interact specifically with the CFTR promoter by tri-dimensional folding mechanism. We first developed the Chromosome Conformation Captures (3C) approach to map these chromosomal contacts. Subsequently, we enhanced our analyses with a high-throughput adaptation of 3C: the 3C-Carbon Copy (5C) technology. This approach allows the analysis of millions chromatin interactions. Thus, we have analyzed the spatial organization of a ～790kb region, comprising the CFTR gene, in primary nasal epithelial cells, which express the gene, and primary skin fibroblasts, which do not express the gene. Interactions between this locus and the CFTR promoter have been analysed by next generation sequencing with the Ion PGM™. We have compared chromatin conformation in order to identify uncharacterized regulatory elements that act especially in CFTR-expressing cells. Our approach has been validated by the identification of previously characterized regulatory elements. Moreover, we identify novel chromatin contacts of the CFTR promoter with chromosomal regions, which could potentially be involved in CFTR gene expression regulation. Thanks to 3C and 3C-derivated analyses, we could identify new possible mutations far from the gene, which may lead to its dysfunction by modifying the chromatin conformation or regulatory elements.

De nombreux gènes impliqués dans la déficience intellectuelle (DI) restent encore à découvrir. Une des voies permettant l'identification de ces nouveaux gènes est la caractérisation de micro-réarrangements chromosomiques chez des patients atteints de DI. L'hybridation génomique comparative sur microréseau permet de détecter des déséquilibres génomiques de très petite taille touchant un ou quelques gènes. Les conséquences moléculaires de ces microdélétions ou microduplications sont différentes en fonction de la position du gène par rapport à leurs bornes. Nous avons ainsi montré l'implication du gène MBD5 dans le syndrome microdélétionnel 2q23.1 et la DI grâce à la caractérisation de trois délétions partielles, une duplication partielle et la première mutation non sens décrite dans ce gène. Nous avons également décrit chez des patients avec DI sévère un nouveau syndrome associé aux délétions de la région 4q21 et deux gènes candidats : PRKG2 et RASGEF1B. Ce syndrome est associé à un phénotype clinique reconnaissable, marqué surtout par un retard de croissance majeur et un retard psychomoteur sévère prédominant sur le langage. Par ailleurs nous avons étudié chez des garçons avec DI, deux duplications situées en Xq24q25 affectant le gène GRIA3. La première touche partiellement le gène, la seconde est situé en amont du gène et est responsable d'un effet de position. Pour finir nous avons étudié une famille consanguine dans laquelle ségrége une duplication 8p22 touchant partiellement le gène TUSC3 impliqué dans la DI de transmission autosomique récessive / A lot of intellectual disability (ID) genes have to be discovered. One of the approaches to identify new ID genes is to characterize chromosomal aberrations in affected patients. Array-CGH (Comparative Genomic Hybridization) made it possible to detect small CNV (Copy Number Variations) affecting only one or a few genes. Molecular outcomes of these microdeletions and microduplications are different depending on the position of the gene relative to the breakpoints. We have thus shown the involvement of MBD5 gene in the 2q23.1 microdeletion syndrome and in ID with the characterization of three partial deletions, a partial duplication and the first nonsense mutation described in this gene. We have also described in patients with severe ID a new syndrome associated with 4q21 deletions involving two candidate genes: PRKG2 and RASGEF1B. This syndrome is associated with a recognizable clinical phenotype with marked growth restriction, severe psychomotor delay and absent or severely delayed speech. In addition, we have studied two Xq24q25 duplications affecting GRIA3 gene in boys with ID. The first one affects partially the gene, the second one is located upstream of the gene and is responsible for a position effect. Finally we have studied a consanguineous family with a 8p22 duplication affecting partially TUSC3 gene which is involved in autosomal recessive ID

La dérégulation de la signalisation Wnt est impliquée dans les anomalies du développement et dans la pathogenèse de nombreuses maladies, y compris l'arthrose. Au cours de ce travail, nous avons étudié l'effet de Wnt-3a sur l’ADAMTS-4 dans les explants de cartilage et les chondrocytes primaires humains. Nous avons observé que Wnt-3a régule négativement l'expression de cette agrecanase et avons démontré que cette inhibition est médiée par Frizzled-8 via l’activation de la voie canonique et inhibition de l'activité de NFκB. En outre, nous avons montré que Wnt-3a est capable de s’opposer à l'induction de l’expression de l’ADAMTS-4 par l'IL-1ß, indiquant que la voie Wnt/ß-caténine peut jouer un rôle protecteur dans l'arthrose. D'autre part, la signalisation non canonique de Wnt induit une perte de la stabilité phénotypique des chondrocytes articulaires qui représente un événement précoce dans l'arthrose, cependant les mécanismes impliqués restent à élucider. Au cours de ce travail, nous avons identifié la cascade Wnt/CaMKII/B-raf/ERK1/2 comme voie de signalisation non-canonique modulant le phénotype chondrocytaire et avons montré que le syndécane4 est un composant essentiel. Nous avons démontré qu’en réponse à Wnt-3a, Frizzled-6 active la voie ERK1/2 en induisant la fixation de la kinase CaMKIIα au syndécane4 et celle de B-Raf à DVL-2 conduisant à l'activation de B-Raf. Dans une boucle de rétrocontrôle, Wnt-3a inhibe l’expression du syndécane4. Ce travail révèle le rôle du syndécane4 dans la régulation du phénotype chondrocytaire et met en évidence de nouvelles cibles qui peuvent avoir un potentiel thérapeutique contre l'arthrose / Dysregulation of Wnt signaling has been implicated in developmental defects and in the pathogenesis of many diseases, including osteoarthritis. Here, we studied the effect of Wnt-3a on ADAMTS-4 in human cartilage explants and primary chondrocytes and found that Wnt-3a negatively regulates the expression of this aggrecanase. We demonstrated that Wnt-3a inhibition of ADAMTS-4 expression is mediated by Frizzled-8 through activation of the canonical Wnt/ß-catenin pathway leading to inhibition of NFκB activity and down-regulation of ADAMTS-4. Furthermore, we showed that Wnt-3a is able to counteract the induction of ADAMTS-4 by IL-1ß, therefore indicating that Wnt/ß-catenin pathway may play a protective role in osteoarthritis. On the other hand, Non-canonical Wnt signaling induces loss of phenotypic stability of articular chondrocytes which represents an early event in osteoarthritis, but the underlying mechanisms are poorly understood. In this thesis, we identify Wnt/CaMKII/B-raf/ERK1/2 cascade as non-canonical signaling pathway that modulates chondrocyte phenotype and revealed that syndecan4 is an essential component of this pathway. We show that in response to Wnt-3a, Fz-6 activates non-canonical signaling by triggering the docking of CaMKIIα to syndecan4 and that of B-raf to DVL-2 leading to the activation of B-raf that transduces signals to ERK1/2 MAPK. In a feedback loop, non-canonical Wnt down-regulates the expression of syndecan4 to negatively regulate the signaling. Our finding uncovers a previously unanticipated role of syndecan4 as a regulator of chondrocyte differentiation. This study also provides new targets which may have therapeutic potential in osteoarthritis