Les protéoglycans (PGs) à héparane- (HS) et chondrol'tine-sulfate (CS) jouent un rôle essentiel dans la régulation de nombreux processus biologiques tels que la différenciation cellulaire, la signalisation, la prolifération et la morphogenèse. En effet, les PGs via leurs chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) agissent comme des récepteurs pour des facteurs de croissance, des enzymes et des protéines d'adhésion cellulaire, modulant ainsi leur biodisponibilité, la formation de gradient et leur activité. La synthèse des chaînes de CS et d'HS est initiée par le transfert d'un résidu xylose sur des sérines de la protéine "core" des PGs par les xylosyltransferases (XT), XT-I et XT-II. Ces enzymes catalysent une étape limitante régulant la biosynthèse des GAGs. En plus de la régulation par les XT, la synthèse des GAGs peut être régulée par la phosphorylation du xylose en position 2-0 par la kinase Fam20B. Il a été montré que la XT-I et la XT-II sont capables de restaurer la synthèse des PGs dans les cellules déficientes en activité xylosyltransférase, suggérant ainsi qu'elles sont fonctionnellement redondantes. Cependant, les rôles spécifiques de la XT­ I et de la XT-II et l'impact de leurs mutations génétiques sur la synthèse des CS et des HS ne sont pas connus. Au cours de cette thèse, nous avons montré que la XT-I initie la synthèse des PGs avec des chaînes de CS et d'HS de tailles plus longues que celle initiée par la XT-II et avons démontré que cela est lié à leurs localisations subcellulaires respectives. En outre, nous avons montré d'une part que les mutations génétiques de la XT-I réduisent fortement la capacité de l'enzyme à initier la synthèse des GAGs et d'autre part que deux mutations de la XT-II conduisent à la mislocalisation de l'enzyme et l'abrogation de sa capacité à initier la synthèse des chaînes de CS et d'HS. En outre, nous avons démontré en utilisant différentes lignées cellulaires et des mutants inactifs que la kinase Fam20B régule négativement le processus de synthèse des chaînes de GAGs et par conséquent que la phosphorylation du résidu xylose par Fam20B entraîne un blocage dans la polymérisation des chaînes de GAGs / Heparan- (HS) and chondroitin-sulfate (CS) proteoglycans (PGs) are essential regulators of many biological processes including cell differentiation, signalization, proliferation and morphogenesis. Indeed, PGs act through their glycosaminoglycan (GAG) chains as receptors for growth factors, enzymes and cell adhesion proteins, thereby modulating their bioavailability, gradient formation and biological activity. The assembly of HS and CS GAG chains is initiated by the transfer of xylose to serine residues of PG core protein by the xylosyltransferases (XT) enzymes, XT-I and XT-II. These enzymes catalyze a rate-limiting step in the biosynthesis pathway and therefore considered as a regulating factors in the GAG biosynthesis process. Beside the regulation by XT enzymes, GAG chain synthesis may also be regulated by phosphorylation of the xylose residue at 2-0 position by the kinase Fam20B. Ithas been shown that XT-I and XT-II are able to restore GAG-attached PG synthesis in xylosyltransferase-deficient cells, suggesting that they are functionally redundant. However, nothing is known of the specific roles of XT-I and XT-II ifany and of the impact of XT-I and XT-II mutations on the synthesis of CS- and HS-PG. Here, we showed that XT-I initiates PGs with large size CS- and HS-GAG chains compared to XT-II and demonstrated that this was linked to their subcellular localisation. In addition, we have addressed the question of whether genetic mutations of XT-I and XT-II associated with various diseases impact CS- and HS-PG synthesis and found that mutations in XT-I strongly reduced the capacity of the enzyme to initiate the synthesis of both CS and HS GAG chains. However, two mutations in XT-II abrogated the capacity of the enzyme to initiate CS and HS GAGs and led to the mislocalisation of the enzyme. Furthermore, we demonstrated using variouse cell lines and dead mutants that Fam20B negatively regulates GAG synthesis process and that phosphorylation of xylose residue by this kinase resulted in a blokage of the polymerisation procees of the GAG chain

Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d’ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d’acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l’aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d’association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d’un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d’entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d’intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d’une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales. / Artificial mini-proteins able to target catalytic sites of matrix metalloproteinases (MMPs) were designed using a functional motif grafting approach. The motif corresponded to the 4 N-terminal residues of TIMP-2, a broad-spectrum natural protein inhibitor of MMPs. Scaffolds able to reproduce the functional topology of this motif as described in the TIMP-2/MMP-14 complex were obtained by exhaustive screening of the Protein Data Bank (PDB) using the STAMPS software (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Ten artificial protein binders satisfying all topologic, steric and electrostatic criteria applied for selection were produced for experimental evaluation. These binders targeted catalytic sites of MMPs with affinities ranging from 450 nM and 590 μM prior to optimization. The crystal structures of two artificial binders in complex with the catalytic domain of MMP-12 showed that the intermolecular interactions established by the functional motif in these artificial binders corresponded to those found in the TIMP-2/MMP-14 complex, albeit with some differences in their geometry. Molecular dynamics simulations of the 10 binders in complex with MMP-14 suggested that these scaffolds could allow reproducing in part the native intermolecular interactions, but some differences in geometry and stability could contribute to the lower affinity of the artificial protein binders as compared to the natural one. Nevertheless, these results show that the in silico design method used can provide sets of starting protein binders targeting a specific binding site with a good rate of success. This approach could constitute the first step of an efficient hybrid computational-experimental protein binder design approach.