Le muscle squelettique adulte est un tissu avec une grande plasticité étant donné qu’il adapte sa taille suite à la surcharge fonctionnelle et il régénère suite à une lésion. La base de cette plasticité est la myofibre et les cellules souches associées, les cellules satellites (CS). Suite aux stimuli, les CS sortent de la quiescence, elles s’activent, proliférent, s’engagent dans la voie myogénique et fusionnent entre elles ou bien avec la fibre pre-éxistante. Une partie des CS retourne à la quiescence afin de maintenir le « pool » de progéniteurs. Ce projet a pour objectif de mieux caractériser des voies de signalisation responsables des adaptations des CS au cours de la régénération et le l’hypertrophie compensatoire. Srf est un facteur de transcription, particulièrement exprimé dans les muscles. Les gènes cibles de Srf sont des gènes qui participent à la régulation de la prolifération cellulaire et des gènes codant des protéines sarcomériques du muscle ou bien des gènes ayant un rôle dans l’adhésion cellulaire, la migration et l’organisation du cytosquelette. Il a été montré que la perte de fonction de Srf dans la lignée de cellules musculaire C2C12 inhibe leur prolifération et leur différenciation et que Srf contrôle l’expression de MyoD qui est un gène de détermination myogénique. Aucune donnée n’est disponible à ce jour concernant la fonction de Srf dans les CS in vivo. Nous avons généré des souris dépourvues de Srf spécifiquement dans les CS adultes. Les CS ont été recruitées par l’hypertrophie et la régénération musculaire. En parallèle des études ex vivo ont été menées afin de préciser si les phénotypes observés sont cellule-autonomes et afin de disséquer les mécanismes sous-jacents. Nous montrons que la perte de Srf dans les CS affecte fortement les processus de régénération et d’hypertrophie suggérant un rôle de Srf dans le contrôle du destin cellulaire de CS. Nos études montrent que la perte le Srf dans les SC n’affecte pas leur prolifération et leur engagement dans la différenciation myogénique. Par contre, leur motilité et leur capacité de fusion sont fortement réduites. Afin d’identifier les effecteurs de Srf impliqués dans la motilité et le défaut de fusion des CS mutantes, nous avons réalisé des études transcriptomiques et identifié le set de gènes dont l’expression est altérée par la perte de Srf dans des conditions de prolifération et de différenciation. L’analyse des fonctions altérées nous a indiqué que la voie de signalisation du cytosquelette d’actine était perturbée. En effet les CS dépourvues de Srf expriment moins d’actine et présentent une organisation du cytosquelette d’actine perturbée. Des expériences de sauvetage utilisant un modèle de souris permettant la surexpression inductible d’actine alpha dans les CS dépourvues de Srf ont montré que la surexpression d’actine chez les mutants Srf était suffisante pour rétablir partiellement l’organisation du cytosquelette et améliorer les capacités de fusion des CS. De manière intéressante, seule la fusion hétérotypique (entre une cellule contrôle et une cellule mutante), et pas la fusion homotypique (entre deux cellules mutantes), est rétablie par l’expression de l’actine. In vivo, le rétablissement de la fusion hétérotypique restaure la croissance hypertrophique des muscles alors que l’altération de la régénération chez les mutants Srf n’est que faiblement améliorée par la surexpression de l’actine. Cette étude nous a permis d’avoir une vision d’ensemble et mécanistique de la contribution du facteur de transcription Srf dans la biologie des CS et de mettre en évidence l’importance structurale du maintien du cytosquelette d’actine pour la fusion des cellules musculaires. / The adult skeletal muscle is a high plastic tissue as it adapts its size upon overload and it is capable of regeneration upon muscle lesion. The skeletal muscle is composed of a specialized syncytium, the myofiber, which is the functional unit of the muscle and a small population of myogenic progenitors, residing adjacent to the myofibers, termed as satellite cells (SCs). SCs are the muscle-specific stem cells which endow the skeletal muscle with its remarkable capacity to repair and to maintain homeostasis during muscle turnover. In resting adult muscles, SCs are quiescent but they activate upon exposure to stimuli. The activated SCs (myoblasts) proliferate extensively and subsequently differentiate and fuse between them or pre-existing myofibers, a series of cellular events called myogenesis. In parallel to the myogenesis, a reserve population of SCs escapes the myogenic program and self-renews to replenish the SC pool. The current project aims to further characterize the signalling pathways involved in SC functions during muscle regeneration and compensatory hypertrophy (CH). Srf is a muscle-enriched transcription factor with Srf-target genes implicated in cell proliferation, differentiation (sarcomeric proteins), adhesion, migration and cellular cytoskeleton. Studies in C2C12 mouse myogenic cell line showed that Srf loss prevent the myoblast proliferation and differentiation by down-regulating the expression of the myogenic determinant MyoD gene. We used a genetic murine model for adult SC-specific Srf-loss in order to conduct in vivo and ex vivo studies for the Srf role in SCs. Compensatory hypertrophy and regeneration are the two means by which SCs were recruited. We show that loss of Srf in SCs affects the regeneration process and the CH suggesting the Srf role in the SC fate. Srf-depleted SCs display probably no defect in their proliferation and differentiation but reduced capacity in motility and fusion. Transcriptomic analysis revealed altered actin cytoskeleton and signalling. Srf-depleted SCs show reduced actin expression and altered actin cytoskeleton. Rescue of actin expression in Srf-depleted SCs partially restored the cytoskeleton organization and the fusion process. Interestingly by actin overexpression only the heterotypic/asymmetric fusion was established but not the homotypic/symmetric fusion. Therefore actin overexpression restored the hypertrophic growth in the CH (in vivo model of heterotypic fusion) but failed to do so in the regeneration (in vivo model of homotypic fusion). This study contributed to the in vivo investigation of the Srf mechanistic role in adult SCs and underlined the importance of actin cytoskeleton maintenance in the fusion of myogenic cells.

La trans-différenciation des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) vers un phénotype migratoire, prolifératif et sécrétoire joue un rôle clé dans la progression des lésions athéromateuses et l’hyperplasie intimale qui sous-tend la resténose post-angioplastie. Nos travaux suggèrent que la transition phénotypique des CMLV implique, chez le rat, la souris et l’Homme, l’expression de novo de l’Adénylyl Cyclase 8 (AC8), une enzyme catalysant la synthèse de l’AMP cyclique (AMPc) (Clément et al., 2006; Gueguen et al., 2010; Keuylian et al., 2012; résultats non publiés). Ce travail de thèse avait pour objectif d’appréhender le rôle de l’AC8 dans la trans-différenciation des CMLV en évaluant son impact sur la signalisation AMPc. L’étude des dynamiques de production du second messager avec le biosenseur T-Epac-VV montre que l’AC8 inhibe les hausses d’AMPc dans les CMLV trans-différenciées à l’Interleukine-1β. Cette fonction non canonique est assurée par de nouvelles isoformes d’AC8 que nous avons identifiées et clonées, les AC8E1 à 4, qui partagent une délétion des cinq premiers domaines transmembranaires. Des dosages de l’accumulation d’AMPc couplés à des expériences de co-immunoprécipitation et d’immunocytochimie révèlent que les AC8E exprimées de façon hétérologue dans des cellules HEK s’hétéro-dimérisent avec les AC en transit dans le réticulum, suppriment leur activité enzymatique et préviennent leur adressage à la membrane plasmique. L’induction des AC8E dans les CMLV trans-différenciées pourrait prévenir les effets vasculoprotecteurs de l’AMPc (Douglas et al., 2005; Katakami et al., 2010), favorisant ainsi l’acquisition et/ou le maintien du phénotype synthétique. / The phenotypic switch of vascular smooth muscle cells (VSMC) towards a migratory, proliferative and secretory state plays a key role in atherosclerotic plaque expansion and intimal hyperplasia leading to post-angioplasty restenosis. Our previous results suggest that the trans-differentiation of rat, mouse and human VSMC involves the de novo expression of the Adenylyl Cyclase 8 (AC8), an enzyme that catalyzes the synthesis of cyclic AMP (cAMP) (Clement et al., 2006; Gueguen et al., 2010; Keuylian et al., 2012; unpublished results). The main goal of my PhD was to decipher the impact of AC8 expression on cAMP signaling in trans-differentiated VSMC. Using the FRET-based biosensor T-Epac-VV, we showed that the de novo expression of AC8 limits increases in cellular cAMP. This non-canonical function relies on a new family of AC8 isoforms that we have identified and cloned: the AC8E1 to 4. They share a common deletion of the first five transmembrane domains. The biochemical characterization of AC8E over-expressed in HEK cells allowed us to elucidate their functioning. cAMP accumulation assays, co-immunoprecipitation experiments and immunocytochemistry revealed that AC8E hetero-dimerize with functional AC during their maturation in the reticulum, suppress their enzymatic activity and prevent their traffic to the plasma membrane. Numerous studies have shown that increases in cAMP concentration within trans-differentiated VSMC antagonize pathological vascular remodeling (Douglas et al., 2005; Katakami et al., 2010). Thus, the induction of AC8E in trans-differentiated VSMC could prevent the vasculoprotective effects of cAMP and promote the acquisition of a synthetic phenotype.

J’ai étudié trois protéines qui participent à deux vois différentes de méchano-transduction qui est la conversion des stimuli physiques en un signal biochimique.Dans une culture cellulaire en 2D, lorsque les cardiomyocytes sont étirés, MLP est transloqué vers le noyau. Sans translocation, les cellules ne parviennent pas à répondre à la stimulation. Les patients porteurs de mutations dans MLP développent une cardiomyopathie comme les souris MLP knock-out (MLP-/-). Mon objectif a été d’élucider le rôle de MLP dans ces cardiomyopathies en surexprimant des mutations de MLP dans les cardiomyocytes isolés des souris MLP-/- néonataux. Dans les cultures 2D mais pas 3D, MLP n’était pas transloqué vers le noyau après l’étirement des cellules. Bien que je n’aie pas pu résoudre ce problème, j’ai mis au point les expériences nécessaires à la poursuite de ce projet.Nesprins s’intègrent dans un complexe transmembranaire de l’enveloppe nucléaire (EN), le LINC complexe, qui connecte le cytosquelette à l’intérieur du noyau. Les myoblastes isolés des patients porteurs des mutations de Nesprin ou de Lamin, qui est associé au LINC complexe, ont présenté des noyaux déformés ainsi que des anomalies de réponses méchanosensibles : Si cultivées sur supports mous, les cellules affichaient un niveau élevé de fibres musculaires stressées et d’adhésions focales. Le knock-down de FHOD, une cible en aval de ROCK et SRC, qui également étaient actives dans ces myoblastes, a réduit ce phénotype. Bien que l’on ait émis l’hypothèse que les mutations dans Nesprins et Lamins conduisent à une instabilité mécanique de l’EN, ces résultats indiquent que les voies de signalisation par l’EN sont perturbées aussi. / I studied three striated muscle proteins that are participating in two different pathways of mechanotransduction, which is the translation of a physical stimulus into a biochemical signal.When isolated cardiomyocytes are stretched in 2D, MLP shuttles to the nucleus. Without shuttling MLP, these cells fail to respond to the stretch stimulus. Human patients with MLP-mutations develop cardiomyopathies, as well as mice with a knock-out of MLP (MLP-/-). By expressing mutated MLP in neonatal cardiomyocytes of MLP-/- mice, I wanted to elucidate the role of mutant MLP. Surprisingly, MLP did shuttle after stretching of 2D but not 3D cell cultures. Although I could not solve this issue, I prepared the setup for subsequent experiments.Nesprins are part of the nuclear envelope (NE) spanning LINC complex, which connects the cytoskeleton with the nucleus. Myoblasts from patients with mutations in Nesprins or LINC-associated Lamins displayed deformed nuclei and had defects in mechanosensitive responses with an elevated level of stress fibers and focal adhesions on soft surfaces. This phenotype could be rescued by knock-down of formin FHOD1, a downstream target of ROCK and SRC, which also were highly active in the mutant cells. While mutations in Nesprins and Lamins are thought to lead to mechanical instability of the NE, these results indicate that signaling pathways through the NE are disturbed as well.

Les ions Ca2+ responsables de la contraction musculaire sont extrudés du réticulum sarcoplasmique (RS) via le récepteur de la ryanodine de type 1 (RyR1). Des mutations du gène de RyR1 sont responsables chez l’homme de l’hyperthermie maligne (HM) et de la myopathie à cores centraux (MCC). Nous avons caractérisé les altérations de l’efflux calcique du RS dues à de telles mutations dans la fibre musculaire de souris par électrophysiologie et imagerie confocale. L’expression des formes Y523S, R615C et R2163H de RyR1, associées à l’HM, provoque une hypersensibilité de l’efflux vis-à-vis du potentiel membranaire alors que les formes I4897T et G4896V associées à la MCC provoquent une réduction chronique de l’efflux sans modification de densité des RyR1 s ainsi que des protéines Cav1.1 et SERCA1. L’expression de la forme R4892W associée à la MCC ne modifie pas l’efflux calcique suggérant une plus faible pénétrance fonctionnelle de cette forme. Dans tous les cas, aucune indication de changement du contenu en calcium RS n’a été observée. Les résultats suggèrent que les modifications pathologiques de l’efflux calcique sont la conséquence directe de l’altération de fonction des canaux. Le deuxième objectif du travail s’est intéressé au rôle de certains phosphoinositides (PtdInsPs) dans la régulation de l’efflux calcique du RS. La surexpression de la PtdInsPs-phosphatase Mtm 1 n’a aucun effet sur l’efflux calcique alors que l’application intracellulaire de ses deux principaux substrats inhibe l’efflux, suggérant que leur accumulation dans les fibres musculaires déficientes en Mtm1 pourrait contribuer aux altérations pathologiques associées du couplage excitation-contraction / Ca2+ ions that trigger muscle contraction are released from the sarcoplasmic reticulum (SR) through the type 1 ryanodine receptor (RyR1) channel. Mutations of the gene encoding RyR1 are responsible for malignant hyperthermia (MH) and central core disease (CCD) in human. We characterized the alterations of SR Ca2+ release due to such mutations in mouse fibers using electrophysiology and confocal imaging. Expression of each of the MH-associated Y523S, R615C and R2163H mutant forms of RyR1 increases the sensitivity of Ca2+ release to membrane potential whereas forms I4897T and G4896V that are associated to CCD provoke a chronic depression of Ca2+ release with no concurrent alteration of RyR1, Cav1.1 and SERCA1 density. Expression of the CDD-associated R4892W form of RyR1 has no effect on Ca2+ release suggesting a weaker functional penetrance of this mutant form. In all cases we found no indication for a change in SR calcium content. Results suggest that pathological changes in Ca2+ release are the direct consequence of the functional alteration of the channels. The second goal of this work focused on the role of certain phosphoinositides (PtdInsPs) in the control of SR Ca2+ release. Over-expression of the PtdInsPs-phosphatase Mtm 1 does not affect Ca2+ release whereas intracellular application of its two main substrates inhibits Ca2+ release, suggesting that accumulation of these molecules in Mtm 1-deficient fibers could contribute to the associated alterations of excitation-contraction coupling