La protéine cellulaire BST2/Tetherin est un médiateur de l’immunité innée qui exerce son activité antivirale contre la dissémination de nombreux virus enveloppés. Ce facteur de restriction retient physiquement les virus néoformés à la surface cellulaire de la cellule infectée, empêchant ainsi le relâchement des virions du VIH-1. La protéine Vpu du VIH-1 est l’un des acteurs viraux capable de contrer cette restriction : elle diminue le niveau d’expression de BST2/Tetherin présent au site de bourgeonnement viral et restaure ainsi une production virale efficace. A ce jour, les mécanismes exacts par lesquels Vpu contre cette barrière cellulaire ne sont pas bien caractérisés. Des études récentes ont montré que HRS et Rab7A, deux protéines contrôlant la voie endo/lysosomale tardive sont impliquées dans le mécanisme déployé par Vpu pour contrer la restriction imposée par BST2. De manière intéressante, ces protéines sont également requises pour l’achèvement des étapes finales de l’autophagie. L’autophagie (macroautophagie) est un mécanisme cellulaire hautement conservé, qui permet la dégradation de composants cytoplasmiques via la formation d’une vésicule à double membrane, appelé autophagosome. L’autophagie est contrôlée par une trentaine de protéines ATG (AuTophaGy-related genes) qui sont recrutés au site de formation du phagophore qui conduira, suite à son élongation, à la formation de l’autophagosome. Il a récemment été décrit que certaine protéines ATG sont également impliquées dans d’autres fonctions cellulaires indépendante de l’autophagie, comme la résistance contre certains pathogènes. C’est le cas notamment de la phagocytose médiée par LC3 (LC3-associated phagocytosis, LAP), un mécanisme indépendant du complexe de pré-initiation de l’autophagie au cours duquel certaines protéines ATG modifient la membrane du phagosome et accélèrent la dégradation des éléments phagocytés. L’objectif de ma thèse était donc de définir si l’autophagie ou certaines protéines de l’autophagie sont impliquées dans le mécanisme moléculaire déployée par Vpu pour contrer la restriction imposée par BST2/Tetherin sur la production virale. Au cours de ma thèse, nous avons démontré l’implication de la protéine LC3C dans le mécanisme par lequel Vpu contrecarre la restriction imposée par BST2 sur la libération des particules virales du VIH-1 dans le milieu extracellulaire. Plus précisément, nos résultats montrent que les protéines ATG5 et Bécline 1, et non tous les composants de l’autophagie, agissent avec la protéine LC3C pour faciliter l’action de la protéine virale Vpu sur la restriction imposée par BST2. L’expression de la protéine LC3C favorise l’élimination par Vpu des molécules de BST2 présentes au site du bourgeonnement, permettant ainsi une libération plus efficace de particules virales VIH-1. Nos expériences d’immunofluorescence montrent que les protéines BST2 et Vpu sont présentes dans des compartiments marqués par LC3, protéine décorant les phagophores, autophagosomes et phagosomes impliqués dans la LAP. Enfin, nos données biochimiques révèlent une interaction spécifique et directe entre la protéine Vpu et la protéine LC3C via un motif LIR non-canonique. L’intégrité de ce motif présent dans le domaine cytoplasmique de Vpu est nécessaire pour la levée par Vpu de la restriction imposée par BST2. En conclusion, mes travaux de thèse montrent que la protéine Vpu du VIH-1 via son interaction avec la protéine d’autophagie LC3C utilise un mécanisme de LAP pour contrer la restriction induite par BST2 sur la production de virus VIH-1. / BST2/Tetherin is a key mediator of the innate immune system that restricts the dissemination of enveloped viruses. This restriction factor impedes the release of de novo formed HIV particles by physically retaining them at the surface of infected cells. The HIV-1 protein Vpu promotes the release of virus by counteracting this restriction. Vpu removes BST2 present at the budding site and downregulates BST2. The mechanisms by which Vpu counteracts BST2 are still not well understood. Recently, we showed that HRS and Rab7A, two regulators of the endocytic and autophagic pathway participates to the mechanism by which Vpu counteracts BST2-mediated restriction on HIV-1 release. Interestingly, these two proteins are also required in the autophagy pathway. Autophagy (macroautophagy) is a highly conserved degradative mechanism that leads to degradation of cytosolic components through the formation of double-membrane vacuoles called autophagosomes that sequester cytosolic material. This process is tightly regulated by the ATG proteins that are hierarchically recruited at the phagophore assembly site to form the autophagosome. Some ATG proteins are additionally involved in non autophagic cell functions involved in maintenance of cell homeostasis and resistance of pathogens. Notably, they participate in microbe clearance through LC3-associated phagocytosis, a process independent of autophagic preinitiation complex in which some ATG proteins directly modify the phagosomal membrane to enhance degradation of phagocytosed elements. The aim of my thesis was to explore if the autophagy pathway or some ATG proteins could be involved in the molecular mechanism by which Vpu counteracts BST2/Tetherin on HIV-1 release. Here, we reveal that the protein LC3C is required in the Vpu-induced antagonism of BST2 restriction. Our results show that only ATG5 and Beclin-1, and not all the components of the autophagy pathway, act with LC3C to favor the counteraction of Vpu on BST2 restriction, and thus enhance HIV-1 release. We report that BST2 and Vpu are present in LC3-positive compartments. We found that Vpu selectively interacts with the ATG8 ortholog, LC3C, through a non-canonical LIR motif by immunoprecipitation and GST pulldown assays. This motif is required for Vpu to antagonize BST2 restriction. LC3C expression favors the removal of BST2 from HIV-1 budding site, and thus HIV-1 release in BST2 expressing cells. Altogether, our data support the view that Vpu uses a non-canonical autophagy pathway reminiscent of LC3-associated phagocytosis to counteract BST2 restriction.

Avec une prévalence mondiale de 0,7%, l’infection in utero à cytomégalovirus (CMV) représente la première cause de handicap neurologique congénital d’origine infectieuse. Les modalités de prise en charge de cette infection restent débattues notamment en raison de l’absence de marqueurs pronostics fiables et d’inconnus sur sa physiopathologie notamment celle de l’atteinte du cerveau fœtal. Le premier objectif de notre travail était de décrire et valider des marqueurs immuno-virologiques prédictifs de la transmission verticale et de séquelles néonatales. Le deuxième objectif était d’étudier les corrélats immuno-virologiques in situ de la sévérité de l’atteinte du cerveau fœtal. Nous avons pu établir à partir du bilan virologique maternel (avidité des IgG et ADN CMV sanguin) un score de risque de transmission verticale du virus en cas de primo-infection maternelle. Nous avons montré que le niveau du réservoir viral fœtal, reflété par la charge virale dans le liquide amniotique et dans le sang fœtal, était un marqueur prédictif des séquelles néonatales. Ainsi, la combinaison de la mesure du réservoir viral fœtal avec l’imagerie fœtale a permis d’établir des scores pronostics avec des valeurs prédictives positives et négatives de 80 à 100% respectivement. Nous avons mis en évidence par immuno-histochimie couplée à une analyse quantitative d’images que la multiplication virale ainsi que la réponse immunitaire innée (cellules NK) et adaptative (CD8+ et plasmocytes) étaient significativement plus élevées dans les cerveaux fœtaux les plus sévèrement atteints. Ce résultat paradoxal nous a incité à quantifier la présence du marqueur PD-1 et celle de son récepteur PD-L1. PD-1 était significativement plus exprimé dans les cerveaux sévèrement atteints. L’analyse par cytométrie de flux montrait que PD-1 était exprimé par 96% des CD8+ mais aussi par plus de 70% des lymphocytes B et des cellules NK. Ces résultats témoignent de l’existence dans les cerveaux fœtaux infectés d’un épuisement immunitaire touchant la réponse adaptative mais aussi innée. Enfin, l’analyse par cytométrie de flux montrait la présence d’une réplication virale dans les différents types de cellules neuronales (cellules souches, neurones, astrocytes). En conclusion, les résultats de notre travail ont permis d’améliorer les algorithmes de prise en charge de l’infection à CMV in utero grâce à la validation de marqueurs prédictifs immuno-virologiques. Par ailleurs, le fait qu’un épuisement immunitaire et une forte multiplication virale soient associés à la sévérité de l’atteinte cérébrale est important pour l’élaboration de stratégies thérapeutiques in utero. / CMV congenital infection has a worldwide incidence estimated at about 0.7% of all life births and represents the major cause of neurological handicap of infectious origin. The management of this infection remains highly debated. Several factors contribute to this and among them are the absence of recognized prognostic markers and gaps in the knowledge of its pathogenicity particularly that of the fetal brain. The first objective of this work was to describe and validate immune and virological predictive markers of vertical transmission and of neonatal sequelae. The second objective was to study in situ immune and virological correlates of the severity of fetal brain infection. We first validated a model of materno-fetal transmission based on maternal virological results (IgG avidity and blood CMV DNA). We then showed that the viral reservoir level, estimated by the viral load in the amniotic fluid and the fetal blood, was a predictive marker of neonatal sequelae. Prognosis models combining quantification of the viral reservoir to fetal imaging allow to reach positive and negative predictive values up to 80% and 100% respectively. We showed using immunohistochemistry and quantitative image analysis that viral multiplication as well as both innate immune responses (NK cells) and adaptive immune responses (CD8+ and plasma cells) were significantly higher in the most severely infected fetal brains. This paradox drove us to quantify PD-1 and its receptor PD-L1, PD-1expression was significantly higher in severely affected fetal brains. Cytometry flow analysis evidenced that PD-1 was expressed in 95% of CD8+ cells but also in at least 70% of NK cells and of B cells. These results demonstrate immune exhaustion of both adaptive and innate responses in fetal infected brains. Finally, viral replication was evidenced in stem cells, neurons and mature astrocytes after separation by flow cytometry of these neuronal cell types. In conclusion, the validation of immune-virological markers obtained within this work has usefully improved the algorithms for the clinical management of in utero CMV infection. Moreover, the demonstration that immune exhaustion and high viral multiplication are responsible of severe fetal brain affection is important to elaborate in utero treatment strategies.