Para-Aminosalicylic acid (PAS) is a well known anti mycobacterial agent and its mode action is believed to be linked to interference of the biosynthesis of the siderophore mycobactin. Certain bicyclic aromatics, in which one of the aromatic rings bears hydroxyl and carboxylic acid groups ortho to one another have recently been found also to possess antimycobacterial activity (unpublished work) and this is thought to be due to similarities in their structures compared with salicylic acid, a constituent building block in mycobactin. We have therefore used the term bicyclic salicylates to describe such compounds. We propose that "bicyclic salicylates", which are hybrids of PAS and the bicyclic systems previously discovered, could be obtained from the reaction between PAS and other reagents and that these would possess greater antimycobacterial activity and less of the gastrointestinal side effects that are associated with PAS. For example, such compounds could be benzopyridines, benzimidazoles and benzothiazoles and related compounds, in which a nitrogen heterocyclic ring is fused to a benzo ring bearing a hydroxy and a carboxylic acid ortho to one another. In our investigations of such "bicyclic salicylates" we were able to synthesize ~/ quinoline derivatives by reacting PAS, or its methyl ester derivative, with selected c.s-unsanrateo carbonyl compounds following the Doebner von- Miller quinoline synthesis. We were also able to synthesize both kinetic and thermodynamic products of quinolone salicylate derivatives using a modified Conrad-Limpach synthesis, obtaining the 4-quinolones and 2-quinolones. Lastly "bicyclic salicylates" based on benzothiazoles were also synthesized from PAS methyl ester following a modified Jacobson synthesis. In all of our studies we observed that the orientation of the cyclisation reactions often favoured the position ortho to the phenolic group of the rr aminosalicylate. In the case of the benzothiazole preparations we often obtained brominated benzothiazoles (from bromination of the product) and so in these heavily substituted products we could not make a final confirmatory statement, in these cases, with respect to the orientation of cyclisation involving the aminosalicylate precursor. 11

Introduction: In 2010, 1.4 million people died from tuberculosis. Bacille Calmette Guerin (BCG) is the only vaccine against tuberculosis that is available, but it has variable efficacy around the world. There is not only an urgent need for a new vaccine, but also identification of a correlate of protection and/or biomarker of disease to enable rapid progression of efficacious and safe vaccine candidates into the clinic. Methods: In order to identify correlates of protection or biomarkers of disease, mycobacteria-specific lymphoproliferation was measured by thymidine incorporation, T cell kinetics were evaluated using a no-wash whole blood flow cytometric approach and cytokine secretion was measured by intracellular cytokine staining. These approaches were used to measure immune responses in rhesus macaques (RM) vaccinated with BCG or BCG/MVA85A and subsequently challenged with M. tuberculosis, and responses in RM and cynomolgus macaques of Mauritian (MCM) and Chinese origin (CCM) after infection with M. tuberculosis. Results: Proliferative and cytokine responses were detected after vaccination, but these responses did not correlate with protection following challenge. Animals that were unable to control disease progression had C!. decline in the number of lymphocytes and T cells and an increase in granulocytes in the periphery. A decline in lymphocyte proliferative capacity and a higher proportion of IFNy-producing T cells after infection was also observed in animals that developed severe disease symptoms. Higher proliferative and IFNy-secreting T cells were observed in RM compared to MCM or CCM and there were also intrinsic differences in white blood cell and T cell numbers between the groups of macaques of different origin and those differences remained after challenge with M. tuberculosis. Conclusion: Studies performed during this research degree confirm that measurement of IFNy-producing T cells, lymphocyte proliferation and polyfunctional T cells does not provide a correlate of protection. However, a decline in lymphocyte and T cell numbers, an increase in granulocytes, a decline in lymphocyte proliferation and increase in IFNy-producing T cells early after infection are biomarkers of disease progression.

This study aimed to develop methods to extract and quantify rifampicin isoniazid and pyrazinamide from plasma and blood spots and test these on patient samples.

Tuberculosis is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. The mycobacterial cell wall is a characteristic component of mycobacteria and the enzymes involved in its biosynthesis are validated drug targets. Enoyl-ACP reductase (InhA) is involved in the elongation of mycolic acids. Isoniazid (INH), an important anti-tuberculosis drug, is a prodrug and requires activation by a catalase-peroxidase KatG. Our aim was to design inhibitors that can bypass the activation step and hence resistance due to mutations in KatG. In this study recombinant InhA and known INH resistant mutants were cloned, expressed and purified for use in in vitro and cell assays and crystallization studies. Aryl sulfonates tested for inhibitory activity against InhA did not show any promising activity. The galactofuranosyl and arabinofuranosyl transferases GIfT! and EmbA are validated drug targets but lack of structural and mechanistic information of these enzymes has hindered the discovery of novel inhibitors. The structure prediction studies of the enzyme GIITl were conducted. GIITl was also successfully expressed and purified for use in biophysical characterization and crystallization trials. The structure prediction and biophysical characterization studies suggest that GlITl has a typical GT -A a-B fold with a nucleotide binding domain present at the C-terminus. The sequence analysis confirmed that the protein is not membrane bound, while it may be membrane associated. The availability of soluble G1fTl in high yields will facilitate further structural characterization studies.

No description available.

HIV is the strongest risk factor for TB and TB is the most common cause of death amongst HIV-infected persons in high burden settings. Khayelitsha, the setting for studies in this thesis, is a high HIV/TB burden and transmission setting. The increased susceptibility to TB infection in HIV-infected persons represents a challenge in TB epidemic control. The absence of a gold standard test for latent TB infection (LTBI) makes it difficult to accurately measure the burden of LTBI. A review conducted in this thesis demonstrated a paucity of data on risk factors for LTBI in HIV-infected persons. This thesis contributes to existing knowledge through describing the prevalence of LTBI in a high HIV/TB burden setting and identifying risk factors for infection, in HIV-infected and uninfected persons, using the tuberculin skin test and interferon gamma release assays (IGRA), as well as identifying risk factors for indeterminate IGRA results. HIV co-infection also increases the risk of progression from LTBI to active disease and blurs the distinction between latent and active TB. This makes diagnosis challenging as passive case-finding, reliant upon clinical symptoms, is often utilized in high burden settings. In order to effectively interrupt transmission, early and accurate diagnosis and treatment of TB cases is crucial. The limitation of smear microscopy in HIV-infected persons, due to paucibacillary disease, along with the operational challenges of performing TB culture, highlight the need for new diagnostic tests. This thesis measures the prevalence of, and risk factors for, subclinical TB disease and highlights the clinical relevance of this intermediary disease state and the need for intensified case-finding and better diagnostic tools to diagnose TB in HIV-infected persons. A novel method is also evaluated to improve the accuracy of an existing diagnostic test, the T-SPOT.TB in the diagnosis of active TB in HIV co-infected persons.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) kills 1.7 million people annually. The Th1 paradigm does not explain TB-driven cavitation. Current treatment is lengthy with many adverse effects. The IL-23/Th17 axis plays a critical role in early Mtb containment. Respiratory stromal cells are important first-line defence and secrete MMPs. Regulation of Matrix metalloproteinases (MMPs), which are substrate-specific proteases causing extracellular matrix (ECM) degradation/ remodelling, was investigated in the context of TB. Human bronchoalveolar lavage (BAL) samples from 35 well-characterised TB and control patients were analysed for MMPs and Th17 cytokines. TB/Control lung biopsies were stained for MMPs/IL-17. Primary normal human bronchial epithelial cells (NHBEs) and MRC-5 fibroblasts were stimulated with IL-17/IL-22/IL-23, alone and in combination with conditioned medium from Mtb-infected monocytes (CoMTb). Secretion, gene expression, gene silencing and intracellular signalling were investigated by luminex, ELISA, zymography, dual-luciferase promoter-reporter, real time RT-PCR and siRNA transfection. MMPs were up-regulated in Human TB BALs (p<0.0001). This positively correlated with cavitation score on CXRs. IL-17 and MMP-3 were co-expressed in pneumocytes around granulomas in TB lung biopsies. CoMTb (but not direct infection) up-regulated secretion and gene expression of MMP-1 (collagenase, p<0.0001), MMP-3 (stromelysin, p<0.001) and MMP-9 (gelatinase, p<0.0001) from NHBEs. MMP-3 protein and promoter activity in MRC-5 fibroblasts was also increased by CoMTb. AKT inhibition suppressed all MMPs (p<0.01) whereas siRNA and chemical inhibition of the proximal PI3Kp110α subunit abrogated MMP-3 only (p<0.001). Distally, p70S6K(mTOR) blockade with rapamycin abrogated TB-driven MMP-1 and MMP-3 (p<0.001). MMP-9 regulation was more complex. IL-17 independently and also synergistically with CoMTb, augmented MMP-3 secretion/ gene expression from NHBEs and MRC-5 fibroblasts in a concentration-dependent manner (peak 8ng/ml, p<0.0001). This was p38-dependent, confirmed by p38-specific siRNA. In contrast, IL-17 down-regulated CoMTb-driven MMP-9 to baseline (p<0.01). Interleukin-22 augmented MMP-3 from fibroblasts in a TB network, but not from NHBEs. IL-23 did not drive MMPs. MMP-1, MMP-3 and MMP-9 production was also affected by anti-mycobacterial agents in a TB network. In summary, MMPs are key mediators of tissue damage in human pulmonary TB and are regulated in a cell- and stimulus-specific manner. IL-17 and IL-22 drive MMP-3 from human airway stromal cells. The PI3Kinase/p110α/p70S6K is a crucial target and its immunomodulation (e.g. with rapamycin) has potential as adjunctive therapy to limit tissue destruction and shorten chemotherapy in TB.

Οι ασθενείς στο τελικό στάδιο της νεφρικής νόσου βιώνουν μία παράλληλη έκπτωση της ανοσιακής τους απάντησης. H ένταξη σε χρόνιο πρόγραμμα αιμοκάθαρσης δεν διορθώνει την ανοσιακή απάντηση. Αντίθετα την επιβαρύνει και με το οξειδωτικό στρες της εξωσωματικής κυκλοφορίας. Οι διαταραχές αφορούν κυρίως το κλάδο της κυτταρικής ανοσίας. Το πρόβλημα είναι κλινικά σημαντικό. Οι αιμοκαθαιρόμενοι παρουσιάζουν δερματική ανεργία, φτωχή απάντηση σε θυμοεξαρτώμενα αντιγόνα αλλά και αυξημένη συχνότητα εκδήλωσης μυκοβακτηριδιώσεων. Η συχνότητα εκδήλωσης φυματίωσης αναφέρεται αυξημένη στον ειδικό αυτό πληθυσμό. Η διαγνωστική προσέγγιση της νόσου, είναι ιδιαίτερα δύσκολη λόγω των μη ειδικών κλινικών συ- μπτωμάτων, που προσομοιάζουν αυτά του ουραιμικού συνδρόμου αλλά και των συχνών εξωπνευμονικών εντοπίσεων. Ανασκοπώντας την διεθνή βιβλιογραφία συναντούμε πολλές αναφορές φυματίωσης στους αιμοκαθαιρόμενους. Παρατηρείται όμως έλλειψη προοπτικών μελετών της συχνότητας εκδήλωσης φυματίωσης στους αιμοκοθαιρόμενους, ενώ οι όποιες μελέτες έχουν κατά καιρούς γίνει δεν παρουσιάζουν στοιχεία σχετικά με τον γενικό πληθυσμό από τον οποίο προέρχονται οι ασθενείς. Στην παρούσα μελέτη ξεπεράσαμε τους μεθοδολογικούς αυτούς περιορισμούς. Εντάξαμε στην μελέτη μας 272 αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς και καταγράψαμε την συχνότητα εκδήλωσης φυματίωσης για περίοδο 36 μηνών. Ταυτόχρονα καταγράφαμε την επίπτωση φυματίωσης στους κατοίκους του νομού Αχαΐας, περιοχή από την οποία προέρχονταν οι ασθενείς της μελέτης. Για να μελετήσουμε τη επίδραση τυχών τοπικών ενδονοσοκομιακών παραγόντων στην συχνότητα εκδήλωσης φυματίωσης των αιμοκαθαιρομένων, εντάξαμε στην μελέτη και ομάδα ελέγχου 45 ατόμων, μη ουραιμικών, που εργάζονταν στις νοσηλευτικές μονάδες που πραγματοποιήθηκε η μελέτη. Σκοπός της μελέτης ήταν να υπολογίσουμε τον κίνδυνο εκδήλωσης φυματίωσης στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς και να τον συσχετίσουμε με κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών μας όπως η φυματινοαντίδραση, το φύλλο, η ηλικία, το σωματικό βάρος, η συνύπαρξη σακχαρώδη διαβήτη, ο χρόνος σε τακτικό πρόγραμμα αιμοκαθάρσεων αλλά και τα ευρήματα της ακτινογραφίας θώρακα. Τα παραπάνω ευρήματα είναι πολύ χρήσιμα στην επιλογή των αιμοκαθαιρόμενων που πρέπει να λάβουν χημειοπροφύλαξη κατά της φυματίωσης. Ταυτόχρονα μπορούν να στηρίξουν της απόφαση χορήγησης εμπειρικής αντιφυματικής αγωγής, όταν τα αποτελέσματα του ελέγχου παραμένουν αρνητικά αλλά η υποψία της νόσου είναι ισχυρή. Κατά την ένταξη στην μελέτη η περί- πτωση ενεργού φυματίωσης από- κλείετο κλινικά και ακτινολογικά. Ταυτόχρονα οι συμμετέχοντες υπο- βάλλονταν σε δερματικές δοκιμασίες με φυματίνη και 2,4-δινιτροχλωρο- βενζένιο ώστε να καταγραφεί ο δείκτης κυτταρικής τους ανοσίας. Κατά την περίοδο των 36 μηνών της μελέτης, 24 αιμοκαθαιρόμενοι νεφροπαθείς εκδήλωσαν ενεργό φυματίωση (συχνότητα εκδήλωσης 7.4%). Σύμφωνα με τον προκαταρκτικό έλεγχο, 8 από αυτούς είχαν θετική (12.9%), 2 ασθενώς θετική (7.4%) και 14 (7.6%), αρνητική Mantoux κατά την ένταξη στην μελέτη. Όλες οι περιπτώσεις ήταν βακτηριολογικά ή/και ιστολογικά επιβεβαιωμένες. Σε 4 μόνο από τις περιπτώσεις φυματίωσης που διαγνώσθηκαν (16.6%), η νόσος εντοπιζόταν αποκλειστικά στους πνεύμονες. Στις υπό- λοιπες 20 περιπτώσεις (83.4%), 76 επικρατούσαν οι εξωπνευμονικές εντοπίσεις. Οι λεμφαδένες, ο υπεζωκότας, το περικάρδιο, το περιτόναιο, το ήπαρ, ο σπλήνας, οι νεφροί, τα οστά και οι μήνιγγες ήταν τα κύρια όργανα στα οποία διαπιστώθηκαν εντοπίσεις (πίνακας 4). Οι περισσότερες περιπτώσεις εκδηλώνονταν τους πρώτους μήνες από την ένταξη σε χρόνιο πρόγραμμα. Στην ομάδα ελέγχου των μη ουραιμικών, ένας άνδρας, μη διαβητικός, με θετική φυματινοαντίδραση κατά τον προκαταρκτικό έλεγχο, από το προσωπικό μίας από τις νοσηλευτικές μονάδες που συμμετείχαν στην μελέτη, εκδήλωσε επίσης ενεργό φυματίωση (2%). Την ίδια χρονική περίοδο, στο Νομό Αχαΐας καταγράψαμε 131 περιπτώσεις ενεργού φυματίωσης. Η συχνότητα εκδήλωσης φυματίωσης για τις ηλικίες > 25 ετών ήταν 0.11%. Θεωρώντας των γενικό πληθυσμό του νομού Αχαΐας σαν ομάδα αναφοράς, ο σχετικό κίνδυνος εκδήλωσης ενεργού φυματίωσης για τους αιμοκαθαιρομένους νεφροπαθείς υπολογίσθηκε 67.2 (95% confidence interval [CI] 58.65-113.6, P <0.001). Θεωρώντας τους μη ουραιμικούς της ομάδας ελέγχου, από το προσωπικό των νοσηλευτικών ομάδων στις οποίες αιμοκαθαίρονταν οι ασθενείς της μελέτης μας, σαν ομάδα αναφοράς ο σχετικός κίνδυνος εκδήλωσης φυματίωσης για τους αιμοκαθαιρομένους νεφροπαθείς υπολογίσθηκε 3.7 (95% confidence interval [CI] 2.86-4.45, P = 0.02). Οι πίνακες 5 and 6, παρουσιάζουν τον σχετικό κίνδυνο εκδήλωσης φυματίωσης στους αιμοκαθαιρόμενους νεφροπαθείς κατά τους 36 μήνες της μελέτης μας, σε σχέση με παράγοντες που σχετίζονται με την εκδήλωση φυματίωσης, ως προς το γενικό πληθυσμό του νομού Αχαΐας. Ο κίνδυνος ήταν σημαντικά υψηλότερος: α) στις γυναίκες αιμοκαθαιρόμενες (P =0.03), β) στους ανεργικούς αιμοκαθαιρομένους νεφροπαθείς (P <0.001) γ) στους διαβητικούς νεφροπαθείς (P =0.03). Επίσης ο σχετικός κίνδυνος αυξανόταν: α) με την πρόοδο της ηλικίας (r = 0.95, P = 0.006), β) με την μείωση του BMI (r = 0.98, P < 0.001), και γ) αν και όχι κλιμακωτά, με το μέγεθος της απάντησης στην Mantoux κατά την ένταξη στη μελέτη (r = 0.84, P = 0.02). Τέλος, με εξαιρετικά υψηλό κίνδυνο εκδήλωσης ενεργού φυματίωσης σχετιζόταν και : α) η παρουσία στην ακτινογραφία θώρακα ευρημάτων συμβατών με παλαιά (μη θεραπευθείσα), αυτόματα επουλωμένη φυματίωση (P < 0.001). β) το αρχικό στάδιο αιμοκάθαρσης (P < 0.001). Καθώς οι περισσότεροι από τους παράγοντες κινδύνου εκδήλωσης φυματίωσης που μελετήσαμε είναι αλληλοεξαρτώμενοι, προχωρήσαμε σε ανάλυση πολλαπλών πιθανοτήτων των αποτελεσμάτων της μελέτης, η οποία επιβεβαίωσε όλες τις συσχετίσεις που περιγράψαμε παραπάνω. Οι αναφορές για αυξημένη συχνότητα εκδήλωσης φυματίωσης στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς επιβεβαιώθηκαν από τα ευρήματα της παρούσας μελέτης. Αιτία είναι η ανοσοβιολογικές διαταραχές που συνοδεύουν την ουραιμία. Οι τελευταίες ευθύνονται για την σημαντική μείωση του δείκτη κυτταρικής ανοσίας που καταγράψαμε στους ασθενείς της μελέτης μας. Η αδυναμία των αιμοκαθαιρόμενων να εκφράσουν πλήρως, όπως η ομάδα ελέγχου, μια αντίδραση επιβραδυνόμενου τύπου υπερευαισθησίας (DTH), όπως η ευαισθησία εξ επαφής (contact 77 sensitivity reaction, CSR) στο DNCB, αποτελεί ένδειξη ανεπάρκειας των Τ- λεμφοκυττάρων, άρα και αδυναμία ενεργοποίησης των μακροφάγων, στην περίπτωση φυματικής μόλυνσης και εκρίζωσης των μυκοβακτηριδίων. Ο δείκτης κυτταρικής ανοσίας που υπολογίζετο κατά την ένταξη στη παρούσα μελέτη αποτελεί μία ποσοτική έκφραση της ικανότητας να εκδηλωθεί μία CSR-αντίδραση άρα και της επάρκειας των Τ-λεμφοκυττάρων των συμμετεχόντων. Οι διακυμάνσεις του δείκτη των ασθενών της μελέτης, ακολουθούνταν από αντίστοιχες αυξομειώσεις της συχνότητας εκδήλωσης φυματίωσης. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, επιβεβαίωσαν και τις αναφορές για αυξημένη συχνότητα εμφάνισης εξωπνευμονικών εκδηλώσεων αλλά και άτυπων πνευμονικών εντοπίσεων. Οι θεράποντες ιατροί θα πρέπει να διατηρούν υψηλό επίπεδο υποψίας και να συμπεριλαμβάνουν την φυματίωση στην διαφοροδιάγνωση κάθε αιμοκαθαιρόμενου ασθενούς που παρουσιάζει μη ειδικά συμπτώματα όπως ανορεξία, πυρετό η/και απώλεια βάρους. Πρέπει να καταβάλλονται όλες οι προσπάθειες για γρήγορη διά- γνωση και να μην διστάζουμε να χρησιμοποιούμε όπου είναι εφικτό και επεμβατικές μεθόδους (βιοψίες, ενδοσκοπήσεις κλπ.) για την επιβεβαίωσή της διάγνωσης. Παραταύτα, ένα αυτό δεν είναι εφικτό και τα αποτελέσματα είναι αρνητικά ενώ η υποψία της νόσου παραμένει ισχυρή, η χορήγηση εμπειρικής αντί-ΤΒ αγωγής είναι απόλυτα δικαιολογημένη. Η πρόγνωση του ασθενούς είναι στενά συνδεδεμένη με την έγκαιρη έναρξη φαρμακευτικής αγωγής. Φυσικά, θεραπεύοντας ένα ηλικιωμένο πληθυσμό, συχνά με πολλαπλά συνοδά προβλήματα υγείας που τον καταβάλλουν, όπως στην περίπτωση τω αιμοκαθαιρόμενων, είναι αναμενόμενες και κάποιες θεραπευτικές αποτυχίες λόγω κακής συμμόρφωσης αλλά και λόγω της τοξικότητας των φαρμάκων. Στην περίπτωση αυτή, την απόφαση για χορήγηση αγωγής θα πρέπει να συνεπικουρεί η ύπαρξη προδιαθεσικών, τρόπο τινά παραγόντων. Στην παρούσα μελέτη η προχωρημένη ηλικία, το θηλυκό γένος, το χαμηλό σωματικό βάρος, η συνύπαρξη σακχαρώδη διαβήτη και το μικρότερο των 12 μηνών διάστημα από την ένταξη σε χρόνιο πρόγραμμα αιμοκάθαρσης συσχετίστηκαν με σημαντική έκπτωση του δείκτη κυτταρικής ανοσίας και αυξημένη συχνότητα εκδήλωσης φυματίωσης. Η συχνότητα φυματίωσης, αυξανόταν ακόμη περισσό- τερο στην περίπτωση ύπαρξης ινοδωσκληρυντικών ή άλλων αλλοιώσεων συμβατών με παλαιά φυματίωση στην ακτινογραφία θώρακα. Τα κλινικά και ακτινολογικά χαρακτηριστικά που προαναφέραμε αποδείχτηκαν σημαντικοί παράγοντες κινδύνου εκδήλωσης φυματίωσης και θα πρέπει να λαμβάνονται σοβαρά υπόψιν στην απόφαση για την χορήγηση εμπειρικής αντί-ΤΒ αγωγής. Η αυξημένη συχνότητα εκδήλωσης φυματίωσης αλλά και η άτυπη κλινικοακτινολογική εμφάνιση στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς, επιβάλουν την χορήγηση χημειοπροφύλαξης κατά της φυματίωσης. Στην περίπτωση αυτή όμως, είναι απαραίτητη η περαιτέρω διεύρυνση των ισχυουσών διεθνών κατευθυντήριων οδηγιών. Η απόφαση για την επιλογή των αιμοκαθαιρόμενων που θα λάβουν ΤΒ- προφύλαξη δεν θα πρέπει να εξαρτάται αποκλειστικά από την φυματινοαντίδραση των ασθενών. Όπως παρατηρήσαμε στην μελέτη μας, η φυματινοαντίδραση υποεκτιμά την επίπτωση Λανθάνουσας Φυματικής Λοίμωξης στο ειδικό αυτό πληθυσμό, λόγω των υψηλών ποσοστών ανεργίας. Οι ανεργικοί δε αιμοκαθαιρόμενοι ασθενείς παρουσιάζουν αυξημένο κίνδυνο εκδήλωσης φυματίωσης και θα πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψιν η ανάγκη χορήγηση ΤΒ-προφύλαξης και στην περίπτωσή τους. Στη περίπτωση αυτή η απόφαση για την χορήγηση της φαρμακευτικής αγωγής συνε-πικουρείται από την ύπαρξη προδι-αθεσικών παραγόντων εκδήλωσης φυματίωσης. Όπως παρατηρήσαμε στην μελέτη μας, η προχωρημένη ηλικία, το θηλυκό γένος, το χαμηλό σωματικό βάρος, η συνύπαρξη σακχαρώδη διαβήτη, το μικρό- τερο των 12 μηνών διάστημα από την ένταξη σε χρόνιο πρόγραμμα αιμοκάθαρσης και τα ευρήματα παλαιάς νόσου στην ακτινογραφία θώρακα, σχετίζονται με αυξημένη συχνότητα εκδήλωσης φυματίωσης και θα πρέπει να θεωρούνται παράγοντες που αυξάνουν τον κίνδυνο εκδήλωσης της νόσου. / Background: Dialysis patients are at increased risk of developing tuberculosis (TB) and anergy due to attenuated cellular immunity. Aim: To define the risk of TB in regular dialysis treatment patients and its association with clinical and radiological risk factors such as sex, age, body mass index, tuberculin sensitivity, coincidence of diabetes mellitus, time in dialysis treatment and evidence of old TB in chest x-ray. Methods: A total of 272 dialysis patients were enrolled in this prospective study over a period of 36 months. Upon entering the study, participants underwent Mantoux and 2,4-dinitrochlorobenzene skin tests and their cell-mediated immunity (CMI)–indexes were estimated. Patients were then classified as anergic (CMI-index ≤2) or non anergic and specific, relative risks of TB were calculated using data from the general population and 49 non-uremic health care workers. The independent effect of sex, age and Diabetes Mellitus was determined using Cox’s proportional hazard method. Results: Among the 116 (42.6%) anergics 13 (11.2%), and among the 156 non-anergics 11 (7%) developed active tuberculosis. Anergics had a significantly higher risk of TB than nonanergics (Adjusted Relative Risks, 98.3, 95% CI 58.65-113.6 versus 61.6, 95% CI 13.6.-72.1, P =0.003). Initial response to Mantoux was weakly associated with the subsequent risk of TB (r =0.51). The latter showed a steadily decreasing trend with increasing CMI-index (r = -0.99). Older patients, females, diabetics, underweighted patients, treated for <12 months and those with abnormal x-rays presented a significant higher risk for TB development. Conclusion: Anergy influences the association of tuberculin sensitivity with the risk of TB development. Anergic dialysis patients are at increased risk of TB development and chemoprophylaxis is justified in their treatment as well.

The resurgence of tuberculosis cases world-wide over the last two decades has led to one third of the population being infected and an ever increasing number of deaths (World Health Organisation, 2006). Little is known about the pathogenicity of the infectious agent, Tubercule bacillus, and resistance to the key chemotherapeutic drugs is widespread. Increasing research effort aiming to curtail the spread of this disease has been aided by the work of Cole et al. (1998 and 2002), which provided genomic annotations of the H37Rv strain of Mycobacterium tuberculosis. Subsequent structural genomics projects have identified hundreds of potential targets for structure-based drug design. The research presented in this thesis focuses on the expression and characterisation of targets from the Mycobacterium tuberculosis genome. Cell-free expression trials of 36 unique targets were performed. Initial screening resulted in soluble expression for 30 % of the targets and inclusion of additives, such as molecular chaperones or detergents, increased this to 67 %. Milligram quantities of protein were obtained for eleven targets. As a comparison, four targets were chosen for expression trials using an E. coli in vivo system. Similar results were obtained for three of the targets using the cell-free or in vivo expression systems. However, significant quantities of soluble Rv3545c, a cytochrome P450 125, were only produced using the in vivo method. Proteins that were expressed in sufficient quantities were progressed into crystallisation trials, one of which yielded crystals suitable for X-ray diffraction. The crystal structure of Rv3628, an inorganic pyrophosphatase (Mtb-PPase), was refined to 2.7 A resolution in space group P3221. Inorganic pyrophosphatases (PPases) are ubiquitous metalloenzymes which belong to the phosphatase superfarnily, and play an essential role in biosynthetic reactions (Teplyakov et aL, 1994). 'ne refined crystal structure of Mtb- PPase was found to exhibit a similar overall fold and oligomeric form to existing type I PPase structures. Comparison with two recent Mtb-PPase structures, both in space group P6322 (Tammenkoski et al., 2005 and Benini and Wilson, to be published), highlighted a possible pH-dependent role of His93 within the active site. The characterisation of Rv3545c, a predicted cytochrome P450 125 (Mtb-CYP125), is also described in this thesis. Cytochrome P450s are a superfamily of haern-thiolate proteins (50 to 60 kDa) which monooxygenate hydrophobic substrates as part of electron transport chains (Nebert and Gonzalez, 1987 and Chapple, 1998). P450s have recently been implicated as novel antimycobacterial targets (Munro et al., 2003). Spectroscopy was used to confirm the cytochrome P450 annotation of Rv3545c, with the ferrous enzyme exhibiting a Soret peak at 450 nm in the presence of CO. A high-to-low spin-shift was observed by UV/visible and EPR spectroscopy, upon imidazole-inhibition of ferric Mtb-CYP125. Secondary structural elements were determined by circular dichroism (CD) to be - 33 % a-helix and - 14 % P-sheet. Finally, dark brown/red crystals of Mtb-CYP125 were obtained, but it was not possible to collect a full data set. This was primarily due to the crystals forming clusters which were impossible to separate. Despite this, weak diffraction data to 3 A resolution were measured, and further optimisation of the crystallisation conditions may prove successful.

Development of an improved TB vaccine is hindered by the lack of a correlate of ,~.-r protection. Efficacy of TB vaccines in humans can only be a"S~essed by expensive and time consuming trials within TB endemic areas, which are limited; therefore, it is critical that vaccines with the greatest potential to protect are selected for these trials. Mycobacterial growth inhibition assays (MGIAs) have been developed with the hope that these in vitro functional assays will correlate with protection, which could aid in the selection of the best vaccine candidates. Work in this thesis describes the development and evaluation of different MGIAs for their ability to detect TB vaccine induced mycobacterial growth inhibition. The mycobacterial growth indicator tube (MGIT) MGIA reproducibly demonstrated mycobacterial growth inhibition in splenocytes from BCG vaccinated compared with naive mice, which corresponded with in vivo protection from M. tb challenge. This assay also discriminated between PBMC from naive and BCG/BCG-MVA85A vaccinated macaques. Microarray data showed extensive differential gene expression in splenocyte responses to ex-vivo BCG stimulation between naive and BCG vaccinated mice. T H 1 responses including IFN-y with NOS2 expression were enhanced in BCG vaccinated mice, indicating a possible mechanism for mycobacterial growth inhibition in BCG vaccinated mice. Further investigation into whether the MGIT assay can be used as a correlate of protection from M. tb in humans and animals is warranted.