Total joint replacement surgery is an excellent treatment for arthritis. Unfortunately around 10% of these prostheses will fail due to aseptic loosening and require revision surgery that is both expensive and less successful for patients. One way of reducing revision surgery could include steps to enhance human osteoblast (hOB) maturation at biomaterial surfaces by modifying existing implant materials. The aim of this research therefore was to create a lipid-functionalised titanium surface that encourages maturation of hOBs, a key event for successfuI osseo integration. Lysophosphatidic acid (LPA) refers to a family of structurally-related bioactive lipids. One of these molecules, oleoyl-LPA, had already been shown to enhance vitamin D3-induced hOB formation and maturation in vitro. Novel results presented within this thesis indicate that LPA members and structurally related synthetic lipids exhibit different potencies with regard to vitamin D3-induced hOB maturation. In summary the finding ofthis thesis indicate that the synthetic compounds are especially efficacious in securing vitamin D3-induced hOB maturation. When developing bioactive titanium surfaces for orthopaedic applications it is important to examine hOB responses to the selected agent(s) in combination with factors central to skeletal health. In this thesis, initial studies focused on an important local mediator, transforming growth factor ~ (TGF~) . In addition research extended to two widely recognised systemic factors, parathyroid hormone (PTH) and oestradiol. Interestingly TGF~ bolstered the maturation of hOBs to LPA and vitamin D3 via a mechanism that may involve an autocrine/paracrine platelet-derived growth factor (PDGF) loop. In contrast oestradiol and parathyroid hormone (PTH) appeared to be without influence on the maturation responses of hOBs to LPA. In light of the risk of prosthetic joint infections, it is also important to consider whether any surface modification promotes or deters the growth of microorganisms. Whilst oleoyl-LPA lacked appreciable antimicrobial actions, it did not promote bacterial growth. In contrast, palmitoyl-LPA appeared to have greater antimicrobial activity and may therefore be an interesting molecule to investigate further in developing multifunctional bone biomaterials that combine host tissue biocompatibility with an antibacterial surface finish . In considering titanium surface functionalisation with LPA (or indeed related lipids) the potential for self-assembly of lipid bi-Iayered structure presented itself as an attractive and facile means of modification. To this end titanium was initially treated with an alkanephosphonate (octadecylphosphonic acid) that served as a tethering point for LPA via tail -tail - hydrophobic interactions akin to the arrangement of phospholipids in cell membranes. The findings of this thesis support the successful functionalisation oftitanium using this simple approach . Future research should continue in exploring the stability and biocompatibility of these novel titanium modifications.

La douleur postopératoire consécutive à la reconstruction osseuse est une complication fréquente susceptible de compromettre le succès global d’une intervention chirurgicale. Cette douleur, sujette à chronicisation, doit être gérée dès les premiers jours postopératoires. Cette thèse s’inscrit dans le développement de ciments phosphocalciques (CPCs) combinés injectables pouvant délivrer in situ des anesthésiques locaux (AL). Ces ciments, une fois formulés et caractérisés, ont montré une libération in vitro des AL pendant 2 semaines. Une évaluation fonctionnelle de la démarche a été réalisée grâce au système CatWalk à partir d’un modèle in vivo de douleur postopératoire après une intervention de reconstruction osseuse. Les résultats ont montré un soulagement significatif de la douleur pendant la période postopératoire à court terme. Le CPC chargé en bupivacaïne a présenté une récupération fonctionnelle plus rapide que le CPC chargé en ropivacaïne. Ces CPCs constitueraient une nouvelle approche de la prise en charge de la douleur postopératoire. Dans cette stratégie locale, le potentiel thérapeutique du gallium sur les maladies osseuses nous a conduits à introduire du maltolate de gallium, GaM (antitumoral, antidouleur) dans des CPCs. L’association de la caséine et du GaM a permis la formulation de nouveaux ciments composites dont la libération du principe actif a pu être modulée. Ces nouveaux systèmes combinés possèdent les propriétés requises comme ciments de comblement osseux et ouvrent de grandes perspectives précliniques et cliniques. Ils permettraient de répondre à des contextes délicats pour lesquels les solutions thérapeutiques actuelles sont insatisfaisantes. / Postoperative pain following bone reconstruction is a serious complication that could jeopardize the global success of a surgery. This pain, which is highly prone to chronicization, must be controlled and minimized during the first postoperative days. This thesis consists in the development of injectable loaded calcium phosphate cements (CPCs) able to deliver in situ local anesthetics (LA). These cements, once formulated and characterized, showed an in vitro release of LA during 2 weeks. A functional evaluation of the gait was performed using the CatWalk system in an in vivo model of postoperative pain following bone reconstructive surgery. The results demonstrated significant pain relief during the short-term postoperative period. Bupivacaine-loaded CPC provided an earlier return to functional recovery than ropivacaine-loaded CPC. These CPCs would constitute a new approach to the management of postoperative pain after orthopedic bone surgery. In this local strategy, the therapeutic potential of gallium on bone disorder led us to insert gallium maltolate, GaM (antitumor, painkiller) inside CPCs. The association of casein and GaM allowed the formulation of new composite cements whose active molecule release has been then modulated. These new combined systems have the required properties for bone void filler and open great pre-clinical and clinical perspectives to treat complex orthopedic situations which currently don’t benefit from satisfactory therapeutic solutions.

Our laboratory has defined a rapid cellular response in porcine articular cartilage to injury. To enable study of the injury response in genetically modified animals I have characterized a novel model of cartilage injury in the mouse, involving avulsion of femoral head epiphyseal cartilage from 4-6 week old animals, and maintaining the explanted tissue in culture. Avulsion injury (explantation) of murine cartilage rapidly activated mitogen activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor κB (NFκB), thus establishing a close similarity to porcine tissue. Gene expression (mRNA) was analysed on Taqman® Low density array microfluidic cards for 47 pre-selected genes. 25 were upregulated upon injury; many characteristic of the inflammatory response. Some were upregulated early (by 1 h) and some not till after 4 h, suggesting primary and secondary responses. Re-cutting cartilage adapted to culture only activated a subset of genes, probably due to release of fibroblast growth factor 2 (FGF2) which is stored pericellularly. Gene expression profiling of explanted cartilage of Fgf2-deficient mice showed 7 of the 25 (28%) genes were partly or largely FGF2-dependent. Because the gene and signalling profiles resembled an inflammatory response I examined tissue deficient in the myeloid differentiation 88 protein (MyD88) an adaptor protein for signalling of the interleukin-1 receptor and toll-like receptor family. 12 of the 25 genes were MyD88-dependent. MyD88-/- cartilage did not show impairment of the intracellular signalling response upon injury and expression of a MyD88-dependent gene (Ccl2) did not increase till 4 h of culture. It was likely that a MyD88-using ligand was made during the primary response and contributed to the secondary. I conclude there are at least 3 mechanisms by which cartilage injury activates gene expression: 1) release of pericellular FGF2, 2) an unkown trigger of MAPK and NFκB and 3) secondary production of a MyD88-using factor.

- / -

Στην παρούσα διατριβή προσεγγίσθηκε η βιολογική συνιστώσα του φαινομένου της άσηπτης χαλάρωσης των υλικών των ορθοπαιδικών προθέσεων. Κατ’ αρχήν μελετήθηκαν διεξοδικά περιπροθετικοί ιστοί (IFT και PCT) υγρό (PSSF) από πέντε ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε επέμβαση αναθεώρησης λόγω άσηπτης χαλάρωσης των προθέσεων. Το ενδεχόμενο σηπτικής χαλάρωσης αποκλείσθηκε με μικροβιολογικό και ιστοπαθολογικό έλεγχο. Οι ιστοί αυτοί εκχυλίσθηκαν παρουσία αναστολέων των πρωτεασών ώστε να αποκλεισθεί το ενδεχόμενο in vitro ενεργοποίησης των περιεχομένων στα εκχυλίσματα ενζύμων. Σε όλα τα δείγματα και σε συμφωνία με άλλους ερευνητές, ανιχνεύθηκε ζελατινολυτική και κολλαγονολυτική δραστικότητα. Ο προσδιορισμός της πρώτης έγινε με χρήση ζυμογραφήματος ζελατίνης, αξιολόγηση και επεξεργασία των ζωνών λύσεως, ενώ για την δεύτερη χρησιμοποιήθηκε το συνθετικό πεπτίδιο DNP-S και χρωματογραφία υψηλής επίδοσης ανάστροφης φάσης RP-HPLC. Οι δραστικότητες που ανιχνεύθηκαν οφείλονταν σε εκφραζόμενες στους ιστούς ΜΜPs. Η ζελατινολυτική δραστικότητα οφειλόταν κατά το πλείστον σε ζελατινάσες (MMP-2 και MMP-9), οι οποίες όμως στο μεγαλύτερο ποσοστό τους ανιχνεύθηκαν σε σύμπλοκη με TIMPs μορφές. Η ειδική ζελατινολυτική δραστικότητα μεταξύ δειγμάτων ίδιας κατηγορίας ιστών (IFT ή PCT) δεν παρουσίαζε μεταβολή ανεξάρτητα από το είδος της αρθροπλαστικής ή την παρουσία οστεόλυσης. Ελαττωμένη δραστικότητα εμφάνισαν τα δείγματα των PSSF. Η κολλαγονολυτική δραστικότητα, η οποία ήταν αυξημένη στα δείγματα όπου συνυπήρχε περιπροθετική οστεόλυση, οφειλόταν κυρίως σε κολλαγονάσες του ενδιάμεσου στρώματος. Πιο σημαντική συμβολή φάνηκε ότι είχε η ΜΜΡ-13, η οποία ανιχνεύθηκε στα περισσότερα δείγματα σε ενεργό μορφή, σε σχέση με την ΜΜΡ-1. Η ΜΤ-1-ΜΜΡ μάλλον δεν ανιχνεύθηκε λόγω του τρόπου αρχικής επεξεργασίας των εκχυλισμάτων. Σε πειράματα που ακολούθησαν και δεν περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη, ανιχνεύθηκε κυρίως σε σύμπλοκη με ΤΙΜΡ-2 μορφή. Συνοψίζοντας τα παραπάνω προέκυψε το συμπέρασμα ότι στους περιπροθετικούς ιστούς εκφράζονται μέλη της οικογένειας των ΜΜPs, που εμπλέκονται, σε διαφορετικό βαθμό το κάθε ένα, στην διαδικασία της οστικής απορρόφησης και της άσηπτης χαλάρωσης. Η ανίχνευση δε δραστικοτήτων στους ιστούς των PCT, αντίστοιχων μάλιστα με αυτών των IFT, στηρίζει την υπόθεση της έναρξης της κυτταρικής αντίδρασης του οργανισμού, στα μικροσωματίδια των υλικών, στον ιστό αυτόν. Η διευκρίνιση του ακριβούς ποσοστού συμμετοχής της κάθε μίας ΜΜΡ αναμένεται να δώσει σημαντική ώθηση στην προσπάθεια επιβράδυνσης των διαδικασιών της χαλάρωσης, μέσω της χρήσης ειδικών και πιθανώς εκλεκτικών φαρμακευτικών αναστολέων των ενζύμων αυτών. Στα πλαίσια της παραπάνω πιθανής θεραπευτικής προσέγγισης μελετήθηκε η επίδραση μερικών γνωστών μη-στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (ΜΣΑΦ) στην, επαγόμενη από δέκα IFT, in vitro παραγωγή ΜΜPs και ΤΙΜΡs. Λόγω δε της πολυπλοκότητας των παθογενετικών μηχανισμών της οστικής απορρόφησης, μελετήθηκε η επίδραση των φαρμάκων αυτών και σε άλλους εμπλεκόμενους, στην οστεόλυση και την χαλάρωση, παράγοντες (IL-1β, IL-6, TNF-α και PGE2). Τα ΜΣΑΦ που δοκιμάσθηκαν ήταν η ασεκλοφαινάκη, η πιροξικάμη, η τενοξικάμη και η ινδομεθακίνη, ενώ για τον προσδιορισμό της επίδρασής τους χρησιμοποιήθηκαν ζυμογράφημα ζελατίνης και τεχνικές ELISA. Τα αποτελέσματα έδειξαν στατιστικά μη-σημαντική ανασταλτική επίδραση στα επίπεδα των MMPs και των αναστολέων τους, σημαντικότατη αναστολή της PGE2, αναστολή της IL-6 και του TNF-α ιδιαίτερα από ασεκλοφαινάκη και τενοξικάμη και αύξηση των επιπέδων IL-1β (ιδιαίτερα από την ασεκλοφαινάκη). Για να υποστηριχθεί βέβαια η θέση της χορήγησης των ΜΣΑΦ αυτών με σκοπό τουλάχιστον την επιβράδυνση των διαδικασιών της χαλάρωσης απαιτούνται μετρήσεις σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων ή in vivo μετρήσεις. / In this study the biological mechanisms, which contribute to aseptic loosening process, were evaluated. Periprosthetic tissues (IFT and PCT) and liquids (PSSF) from five patients, who subjected to hip revision due to aseptic loosening, were collected. The possibility of septic loosening was, by histopathological and culture examinations, excluded. Extraction of tissues and dialysis were, in the presence of proteinases inhibitors, performed in order to exclude the in vitro activation of the sample-enzymes. Collagenolytic and gelatinolytic activity were, in all samples, detected. In order to examine the gelatinolytic activity, all samples were subjected in gelatin zymography and the lysis bands were evaluated. The collagenolytic activity was examined by using the DNP-S peptide and reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The activities, mentioned above, were the outcome of, expressed in periprosthetic tissues, MMPs. The gelatinolytic activity was the result of gelatinases (MMP-2 and MMP-9), which were mainly in complex with TIMPs forms detected. The specific gelatinolytic activities of the samples were almost equal, independently the type of arthroplasty and the presence or absence of osteolysis. In PSSF samples low activity was detected. Collagenolytic activity, which was higher in samples collected from osteolytic lesions, was the result of presence and action of interstitial callagenases. MMP-13 seems to have the major contribution, compared to MMP-1 in collagenolytic activity. MT1-MMP was not detected, possibly due to the extraction methods. In more recent and unpublished results, MT1-MMP was detected in complex to TIMP-2. In brief, different members of the MMP family are expressed in periprosthetic tissues and fluids. These MMPs contribute in different way in loosening and osteolysis processes. The fact that in PCTs high activities were measured can support the hypothesis that all the biological events that lead to loosening start to take place in the PCT tissue. The contribution of each MMP in these processes has to be elucidated in order to try to decelerate them by using selective MMPs-inhibitors. In order to evaluate the possible usage of several well-known non-steroidal anti-inflammatory drugs for retarding the loosening process, the in vitro effect of these drugs in the IFT- induced production of MMPs and TIMPs was studied. Because of the complexity of the involved in pathogenesis factors, the effect of the drugs in other soluble cytokines (such as IL-6, IL-1β, TNF-a) and PGE2 was also measured. For all these experiments cultures of IFT of ten patients were used. Aceclofenac, Piroxicam, Tenoxicam and Indomethacin were used. The drugs didn’t have a statistically significant effect in the MMPs or TIMPs production. In all cases the inhibitory effect on PGE2 was potent. Aceclofnac and tenoxicam reduced strongly the IL-6 and TNF-α levels. Finally the drugs seemed to induce the ΙL-1β levels (especially aceclofenac). More experimental studies are necessary for supporting the usage of the tested drugs, for retarding the aseptic loosening phenomenon. In vivo studies will also be useful.

- / -

L’arthrose est un véritable problème de santé publique. Plus de dix millions de personnes sont atteintes en France et 35 millions aux États-Unis. L’arthrose du genou représente 35% du nombre total d’arthrose avec plus de 1,3 million de patients en Europe. Il existe de nos jours plusieurs solutions permettant de traiter l’arthrose du genou, suivant le caractère dégénératif de la maladie, allant du traitement chirurgical conservateur, tel que l’ostéotomie supérieure du tibia, jusqu’au traitement chirurgical prothétique, tel que l’arthroplastie totale du genou. Le succès à long terme de ces interventions repose (1) sur le contrôle de l’alignement du membre inférieur au cours de l’intervention, réalisé par l’intermédiaire de l’angle HKA entre les centres hanche, genou et cheville, et (2) sur une planification chirurgicale permettant de préparer l’intervention, et notamment, définir la position optimale des coupes osseuses pour la mise en place d’une prothèse à partir de modèles 3D de l’os du patient issus d’images tomodensitométriques (TDM) ou IRM. Nous nous sommes intéressés, dans un premier temps, à l’étude et l’évaluation, dans un contexte clinique, de la précision et la robustesse des techniques utilisées en chirurgie assistée par ordinateur pour la localisation du centre hanche, nécessaire au calcul de l’angle HKA. Nous avons ainsi proposé une nouvelle méthode, mini-invasive, et particulièrement adaptée pour l’ostéotomie supérieure du tibia. Nous nous sommes ensuite intéressés aux méthodes de segmentation permettant d’extraire la surface osseuse du genou à partir d’IRM pour la phase de planification. Nous avons également proposé une nouvelle approche, automatique, qui se base sur des modèles actifs de forme ou Active Shape Model (ASM). Compte tenu des résultats très encourageants, l’intégration de nos contributions en routine clinique pourrait, potentiellement, améliorer le service médical rendu pour le traitement de l’arthrose du genou. / Osteoarthritis is a real public health problem. More than ten million people are affected by osteoarthritis in France and 35 million in the United States. Knee Osteoarthritis represents 35% of the total number of osteoarthritis with more than 1.3 million patients in Europe. Today, there are several solutions to treat knee osteoarthritis depending on the degenerative nature of the disease : from conservative surgical treatment, such as High tibia Osteotomy (HTO), to prosthetic surgical treatment, such as Total Knee arthroplasty (TKA). The long-term success of these interventions is (1) the control of the lower limb alignment, during the intervention, which can be obtained by measuring the HKA angle between the hip, the knee and the ankle centers, and (2) the surgical planning allowing the preparation of the intervention, and for instance, the definition of the optimal cuts for the placement of a knee prosthesis based on the 3D model of the patient bone obtained from computerized tomography (CT) or MRI. We were interested, first, in the study and evaluation, in a clinical context, of the accuracy and precision of the methods used in computer-assisted orthopedic surgery for the localization of the hip center. We have thus proposed a new minimally invasive method especially adapted to HTO. We were interested, then, to the segmentation methods allowing the extraction of the knee bony surface from MRI for the surgical planning. We have also proposed a new automatic approach based on active shape models (ASM). Given the very encouraging results, the integration of our contributions in the clinical routine could, potentially, improve the medical benefits for the treatment of knee osteoarthritis.