Η ετερότοπη οστεοποίηση είναι ένα όχι σπάνιο φαινόμενο που οδηγεί σε δημιουργία οστικών δομών σε σημεία που φυσιολογικά υπάρχουν μαλακά μόρια. Ετερότοπη οστεοποίηση μπορεί να προκληθεί κατόπιν τοπικού τραύματος, κατόπιν νευρολογικού τραύματος, ύστερα από χειρουργική επέμβαση σε περιοχές όπως τα ισχία και οι αγκώνες, λόγω γενετικού υποστρώματος σε ασθενείς πολύ μικρών ηλικιών και τέλος αντιδραστικές ετερότοπες οστεοοποιήσεις άνω ή κάτω άκρων. Στην παρούσα διατριβή προσεγγίστηκε η νευρογενούς αιτιολογίας ετερότοπη οστεοποίηση, κυρίως κατόπιν ΚΕΚ. Ο παθοφυσιολογικός μηχανισμός του φαινομένου είναι εν πολλοίς άγνωστος και αυτό που θεωρείται δεδομένο είναι η διαταραχή του ισοζυγίου οστεοβλαστικής – οστεοκλαστικής δραστικότητας κατόπιν της δράσης του επαγωγικού παράγοντα. Ύστερα από τη δράση του επαγωγικού παράγοντα –στη συγκεκριμένη περίπτωση της ΚΕΚ – αυξάνεται η οστεοβλαστική δραστηριότητα τοπικά. Κατά το σχηματισμό του οστού λοιπόν, παράγονται και εκκρίνονται πρωτεογλυκάνες στις αλυσίδες των οποίων προσκολλώνται οι γλυκοζαμινογλυκάνες. Πρωτεογλυκάνες και γλυκοζαμινογλυκάνες συναποτελούν μαζί με τις κολλαγονικές και μη κολλαγονικές πρωτεΐνες, τα τρία κύρια είδη μακρομορίων του εξωκυττάριου δικτύου του οστού. Σκοπός της μελέτης μας ήταν αφενός η μελέτη των πρωτεογλυκανών και γλυκοζαμινογλυκανών στο ετερότοπο οστό σε αντιδιαστολή με φυσιολογικό-ορθότοπο οστό προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος τους στην δημιουργία του φαινομένου της ετρότοπης οστεοποίησης. Αφετέρου για να διερευνηθεί καλύτερα ο παθοφυσιολογικός μηχανισμός του φαινομένου, μελετήθηκαν κυτταρικοί πληθυσμοί με οστεοβλαστική δραστηριότητα στο περιφερικό αίμα ασθενών που είχαν υποστεί ΚΕΚ και νοσηλεύονταν στη ΜΕΘ, καθώς και πειραματοζώων κατόπιν τεχνητής επαγωγής Κρανιοεγκεφαλικής Βλάβης. Η θειική χονδροϊτίνη και το υαλουρονικό οξύ είναι οι μοναδικοί τύποι γλυκοζαμινογλυκανών στο εξωκυττάριο δίκτυο ετερότοπου οστού όπως και στο φυσιολογικό. Εντούτοις, το ολικό ποσό τους είναι κατά 70% μικρότερο σε σύγκριση με αυτό του φυσιολογικού οστού. Διαφορετική είναι και η εκατοστιαία αναλογία αυτών των μακρομορίων. Η επικρατούσα μορφή δισακχαρίτη θειικής χονδροϊτίνης είναι η θειωμένη στην θέση 6. Ωστόσο η ποσοτική διαφοροποίηση από το φυσιολογικό οστό τόσο στους 4 θειωμένους όσο και στους μη θειωμένους δισακχαρίτες είναι υπαρκτή σε όλα τα ετερότοπα δείγματα. Από πλευράς πρωτεογλυκανών η αγγρικάνη και η διακοσμητίνη είναι ποιοτικά παρούσες στο εξωκυττάριο δίκτυο οστίτη ιστού. Επομένως, ποσοτικές διαφοροποιήσεις στο ετερότοπο οστό σε αντιδιαστολή με το φυσιολογικό είναι υπαρκτές και αυτή η διαφοροποίηση πιθανώς αντικατοπτρίζει διαφορετικές ενζυμικές δραστηριότητες στο φαινόμενο της ετερότοπης οστεοποίησης. Στη μελέτη των κυτταρικών πληθυσμών με οστεοβλαστική δραστηριότητα στο περιφερικό αίμα διαπιστώνονται τα ακόλουθα: Αυξημένη οστεοβλαστική δραστηριότητα στους πληθυσμούς CD-63(+) η οποία εμφανίζει κορυφή στις 6-10 ημέρες μετά την ΚΕΚ. Αυξανόμενη οστεοβλαστική δραστηριότητα πληθυσμών κυττάρων osteocalcin (+) σε όλες τις μετρήσεις μετά την ΚΕΚ. Το σύστημα οστεοπροτεγερίνης – sRANKL εμφανίζει τα εξής χαρακτηριστικά: η osteoprotegerin είναι μετρήσιμη και αυξάνει προς το τέλος των μετρήσεων. Το sRANKL απεναντίας δεν είναι μετρήσιμο σε καμία χρονική στιγμή κατόπιν της ΚΕΚ. Τα παραπάνω συνεπάγονται ότι η ΚΕΚ είναι παράγων επαγωγής οστεοβλαστικής δραστηριότητας όχι μόνο τοπικά αλλά και συστηματικά. Η εκτροπή της οστεοβλαστικής δραστηριότητας προς δημιουργία ετερότοπης οστεοποίησης χρήζει μελέτης μεγαλυτέρου δείγματος ασθενών και πιθανότατα και σε επίπεδα γονιδιακής έκφρασης κυτταρικών καλλιεργειών ασθενών κατόπιν ΚΕΚ. / Ηeterotopic ossification is a relatively frequent phenomenon that leads to the formation of heterotopic osseous structures at points where soft molecules normally do exist. Heterotopic ossification can be induced after local lesion, neurological lesion, after surgical intervention in regions as the hips and the elbows, due to genetic causes in patients of very small ages and, finally, the phenomenon has been observed as distinct, reactive cases in upper or lower limbs. In this Thesis, pathophysiology and mechanisms of neurogenic heterotopic ossification were studied. Pathways of the phenomenon still unknown to date. What is thaught to be the case in the formation of HO, is the disturbance of balance of osteoblastic to osteoclastic activities, after the induction-Head injury in this situation. After Traumatic Brain Injury, osteoblastic activity is induced locally. During bone formation proteoglycans are produced and secreted. Glucozaminoglycans are attached on the side chains of Proteoglycans. Proteoglycans and Glycozaminoglycans constitute along with collageneous and non-collageneous proteins the major macromolecules of extracellular matrix. The purpose of our study was the characterization of proteoglycans and glycozaminoglycans of the heterotopic bone versus the normotopic bone towards the elucidation of their role in the heterotopic bone formation. On the other hand, a more detailed approach to the pathophysiology of the phenomenon requires cellular populations expressing osteoblastic activities to be observed and studied. This is done in peripheral blood of patients that had sustained traumatic brain injuries and being hospitalized within IC units. Same studies on cellular populations have been conducted in a rabbit animal model of traumatic brain injury. Chondroitin-Sulfate and Hyaluronate are the only glycozaminoglycans that have been observed in extracellular matrix of heterotopic bone as well as in normotopic one. Quantitative analyses, however, revealed that their total amount is 70% less compared to normotopic bone. The commonest form of dissacharites of chondroitin-sulfate is the one sulfated at 6-O. However, there is a significant quantitative difference between normotopic and heterotopic bone in 4-O sulfated as well as in non sulfated dissacharites. With regards to proteoglycans, aggrecan and decorin are present in extracellular matrix. Quantitative differences between normotopic and heterotopic bone do exist and reflect a possible alternative pathway of bone formation in the HO phenomenon. The studies on osteoblastic activities of peripheral blood after traumatic brain injury revealed that there is increased osteoblastic activity in CD-63 (+) population that peaks 6-10 days after the inciting event. Osteocalcin (+) population do excibit increased osteoblastic activity as well which increases along with time. The system osteoprotegerin - sRANKL presents the following characteristics: osteoprotegerin is measurable and increases towards the end of measurements. sRANKL on the contrary is not measurable at any time following traumatic brain injury. Consequently, Traumatic Brain Injury do induce osteoblastic activity not only locally but also systemically. The deviation of osteoblastic activity towards heterotopic ossification requires studies of bigger sample of patients, probably to the level of differential gene expression of cellular cultures derived from patients having sustained neurotrauma.

Le traumatisme crânien (TC) représente un des problèmes majeurs de santé publique, pour lequel à l’heure actuelle il n’existe aucun traitement. Le TC induit une neuro-inflammation délétère qui pourrait contribuer à l’apparition des lésions de la substance blanche (SB). Ces dernières sont à l’origine de lourdes conséquences neurologiques chez les patients victimes de TC. Néanmoins, très peu d’études se sont intéressées à ces lésions bien que plus sévères que les lésions de la substance grise. Ainsi une meilleure connaissance de leur évolution et des causes devient indispensable. L’hyperactivation de la poly(ADP ribose)polymérase (PARP) joue un rôle délétère dans les conséquences post-traumatiques, notamment sur la neuro-inflammation. Ainsi son inhibition pourrait être bénéfique le développement des lésions de la SB. Dans ce contexte, l’objectif de notre travail a été d’évaluer le rôle de la PARP dans les lésions de la SB dans un modèle expérimental de TC induit par impact cortical contrôlé chez la souris. Dans une première partie, nous avons étudié l’évolution de la démyélinisation dans le corps calleux, une structure riche en SB, entre 6 heures et 3 mois post-TC. Parallèlement, les évolutions de la lésion cérébrale, des déficits sensorimoteurs, de la neuro-inflammation et de l’œdème cérébral ont été étudiées. Le TC induit (1) une démyélinisation dès 7 jours et au moins jusqu’à 3 mois post-TC, précédée par (2) une lésion cérébrale entre 24 et 72 heures suivie par une cicatrisation, (3) une neuro-inflammation entre 6 heures et 7 jours et (4) un œdème cérébral entre 6 et 72 heures post-TC. De plus, le TC induit des déficits sensorimoteurs à 6 heures et 3 mois. Ces résultats montrent que ce modèle est adapté pour étudier les lésions de la SB post-TC, et que la neuro-inflammation et l’œdème cérébral pourrait être impliqués dans la démyélinisation. Dans une deuxième partie, nous avons étudié le rôle de la PARP dans les lésions de la SB suite à TC à l’aide de souris knockout (KO) et wild-type (WT) pour le gène de la PARP. Nous avons mis en évidence que les souris KO ne présentent pas de démyélinisation bilatérale du corps calleux après un TC par rapport aux souris WT à 7 jours post-TC, démontrant pour la première fois l’implication de cette enzyme dans les lésions de la SB consécutives à un TC. De plus, nous avons constaté que les souris KO non traumatisées présentent une diminution de myélinisation comparativement aux souris WT non traumatisées, suggérant un rôle de la PARP dans le processus physiologique de la myélinisation.En conclusion, l’ensemble de ce travail expérimental a permis (1) une meilleure caractérisation de la démyélinisation post-TC et des mécanismes potentiellement impliqués dans cette dernière, et (2) de démontrer pour la première fois le rôle délétère de la PARP dans la démyélinisation induite par un TC. Nos travaux suggèrent le potentiel de l’inhibition de la PARP comme stratégie thérapeutique pour la prévention des lésions de la SB post-traumatiques. / Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of death and disability for which there is no neuroprotective treatment up to date. It results in neuroinflammation that may participate in lasting motor and cognitive impairments accompanied by changes in white matter (WM) tracts. WM lesions, evidenced by demyelination, are associated with neurological disorders and in clinical studies are common consequences in patients with chronic TBI. Several studies suggest a contribution of an overactivation of the poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) to the neuroinflammatory response which may lead to demyelination. The first part of this study was dedicated to a detailed in vivo assessment of the evolution over time of neurological disorders, cerebral lesion and edema, neuroinflammation and white matter injury induced by controlled cortical impact (CCI) between 6 hours and 12 weeks post-TBI. Notably in the corpus callosum, a significant demyelination starting at 7 days appeared to be a major consequence to post-traumatic neuroinflammation associated with motor dysfunctions. The second part of this study was dedicated to the evaluation of PARP’s role in WM lesions post-TBI, using PARP knockout (KO) mice. Our main findings reveal a diminished demyelination in the corpus callosum of TBI PARP KO as opposed to TBI PARP wildtype specimens. Hence, these data suggest for the first time PARP’s deleterious role in post-traumatic demyelination. In conclusion, taken together these data give an overall view of motor/sensorimotor deficits, neuroinflammation and demyelination in a CCI model of TBI that could help to validate pharmacological strategy for preventing post-traumatic WM injury. Notably, PARP’s inhibition seems to be a valid candidate as this enzyme participates in the establishment of a demyelinating process.

Le traumatisme crânien (TC) représente un des problèmes majeurs de santé publique, pour lequel à l’heure actuelle il n’existe aucun traitement. Le TC induit une neuro-inflammation délétère qui pourrait contribuer à l’apparition des lésions de la substance blanche (SB). Ces dernières sont à l’origine de lourdes conséquences neurologiques chez les patients victimes de TC. Néanmoins, très peu d’études se sont intéressées à ces lésions bien que plus sévères que les lésions de la substance grise. Ainsi une meilleure connaissance de leur évolution et des causes devient indispensable. L’hyperactivation de la poly(ADP ribose)polymérase (PARP) joue un rôle délétère dans les conséquences post-traumatiques, notamment sur la neuro-inflammation. Ainsi son inhibition pourrait être bénéfique le développement des lésions de la SB. Dans ce contexte, l’objectif de notre travail a été d’évaluer le rôle de la PARP dans les lésions de la SB dans un modèle expérimental de TC induit par impact cortical contrôlé chez la souris. Dans une première partie, nous avons étudié l’évolution de la démyélinisation dans le corps calleux, une structure riche en SB, entre 6 heures et 3 mois post-TC. Parallèlement, les évolutions de la lésion cérébrale, des déficits sensorimoteurs, de la neuro-inflammation et de l’œdème cérébral ont été étudiées. Le TC induit (1) une démyélinisation dès 7 jours et au moins jusqu’à 3 mois post-TC, précédée par (2) une lésion cérébrale entre 24 et 72 heures suivie par une cicatrisation, (3) une neuro-inflammation entre 6 heures et 7 jours et (4) un œdème cérébral entre 6 et 72 heures post-TC. De plus, le TC induit des déficits sensorimoteurs à 6 heures et 3 mois. Ces résultats montrent que ce modèle est adapté pour étudier les lésions de la SB post-TC, et que la neuro-inflammation et l’œdème cérébral pourrait être impliqués dans la démyélinisation. Dans une deuxième partie, nous avons étudié le rôle de la PARP dans les lésions de la SB suite à TC à l’aide de souris knockout (KO) et wild-type (WT) pour le gène de la PARP. Nous avons mis en évidence que les souris KO ne présentent pas de démyélinisation bilatérale du corps calleux après un TC par rapport aux souris WT à 7 jours post-TC, démontrant pour la première fois l’implication de cette enzyme dans les lésions de la SB consécutives à un TC. De plus, nous avons constaté que les souris KO non traumatisées présentent une diminution de myélinisation comparativement aux souris WT non traumatisées, suggérant un rôle de la PARP dans le processus physiologique de la myélinisation.En conclusion, l’ensemble de ce travail expérimental a permis (1) une meilleure caractérisation de la démyélinisation post-TC et des mécanismes potentiellement impliqués dans cette dernière, et (2) de démontrer pour la première fois le rôle délétère de la PARP dans la démyélinisation induite par un TC. Nos travaux suggèrent le potentiel de l’inhibition de la PARP comme stratégie thérapeutique pour la prévention des lésions de la SB post-traumatiques. / Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of death and disability for which there is no neuroprotective treatment up to date. It results in neuroinflammation that may participate in lasting motor and cognitive impairments accompanied by changes in white matter (WM) tracts. WM lesions, evidenced by demyelination, are associated with neurological disorders and in clinical studies are common consequences in patients with chronic TBI. Several studies suggest a contribution of an overactivation of the poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) to the neuroinflammatory response which may lead to demyelination. The first part of this study was dedicated to a detailed in vivo assessment of the evolution over time of neurological disorders, cerebral lesion and edema, neuroinflammation and white matter injury induced by controlled cortical impact (CCI) between 6 hours and 12 weeks post-TBI. Notably in the corpus callosum, a significant demyelination starting at 7 days appeared to be a major consequence to post-traumatic neuroinflammation associated with motor dysfunctions. The second part of this study was dedicated to the evaluation of PARP’s role in WM lesions post-TBI, using PARP knockout (KO) mice. Our main findings reveal a diminished demyelination in the corpus callosum of TBI PARP KO as opposed to TBI PARP wildtype specimens. Hence, these data suggest for the first time PARP’s deleterious role in post-traumatic demyelination. In conclusion, taken together these data give an overall view of motor/sensorimotor deficits, neuroinflammation and demyelination in a CCI model of TBI that could help to validate pharmacological strategy for preventing post-traumatic WM injury. Notably, PARP’s inhibition seems to be a valid candidate as this enzyme participates in the establishment of a demyelinating process.

Le traumatisme crânien (TC) représente un des problèmes majeurs de santé publique, pour lequel à l’heure actuelle il n’existe aucun traitement. Le TC induit une neuro-inflammation délétère qui pourrait contribuer à l’apparition des lésions de la substance blanche (SB). Ces dernières sont à l’origine de lourdes conséquences neurologiques chez les patients victimes de TC. Néanmoins, très peu d’études se sont intéressées à ces lésions bien que plus sévères que les lésions de la substance grise. Ainsi une meilleure connaissance de leur évolution et des causes devient indispensable. L’hyperactivation de la poly(ADP ribose)polymérase (PARP) joue un rôle délétère dans les conséquences post-traumatiques, notamment sur la neuro-inflammation. Ainsi son inhibition pourrait être bénéfique le développement des lésions de la SB. Dans ce contexte, l’objectif de notre travail a été d’évaluer le rôle de la PARP dans les lésions de la SB dans un modèle expérimental de TC induit par impact cortical contrôlé chez la souris. Dans une première partie, nous avons étudié l’évolution de la démyélinisation dans le corps calleux, une structure riche en SB, entre 6 heures et 3 mois post-TC. Parallèlement, les évolutions de la lésion cérébrale, des déficits sensorimoteurs, de la neuro-inflammation et de l’œdème cérébral ont été étudiées. Le TC induit (1) une démyélinisation dès 7 jours et au moins jusqu’à 3 mois post-TC, précédée par (2) une lésion cérébrale entre 24 et 72 heures suivie par une cicatrisation, (3) une neuro-inflammation entre 6 heures et 7 jours et (4) un œdème cérébral entre 6 et 72 heures post-TC. De plus, le TC induit des déficits sensorimoteurs à 6 heures et 3 mois. Ces résultats montrent que ce modèle est adapté pour étudier les lésions de la SB post-TC, et que la neuro-inflammation et l’œdème cérébral pourrait être impliqués dans la démyélinisation. Dans une deuxième partie, nous avons étudié le rôle de la PARP dans les lésions de la SB suite à TC à l’aide de souris knockout (KO) et wild-type (WT) pour le gène de la PARP. Nous avons mis en évidence que les souris KO ne présentent pas de démyélinisation bilatérale du corps calleux après un TC par rapport aux souris WT à 7 jours post-TC, démontrant pour la première fois l’implication de cette enzyme dans les lésions de la SB consécutives à un TC. De plus, nous avons constaté que les souris KO non traumatisées présentent une diminution de myélinisation comparativement aux souris WT non traumatisées, suggérant un rôle de la PARP dans le processus physiologique de la myélinisation.En conclusion, l’ensemble de ce travail expérimental a permis (1) une meilleure caractérisation de la démyélinisation post-TC et des mécanismes potentiellement impliqués dans cette dernière, et (2) de démontrer pour la première fois le rôle délétère de la PARP dans la démyélinisation induite par un TC. Nos travaux suggèrent le potentiel de l’inhibition de la PARP comme stratégie thérapeutique pour la prévention des lésions de la SB post-traumatiques. / Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of death and disability for which there is no neuroprotective treatment up to date. It results in neuroinflammation that may participate in lasting motor and cognitive impairments accompanied by changes in white matter (WM) tracts. WM lesions, evidenced by demyelination, are associated with neurological disorders and in clinical studies are common consequences in patients with chronic TBI. Several studies suggest a contribution of an overactivation of the poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) to the neuroinflammatory response which may lead to demyelination. The first part of this study was dedicated to a detailed in vivo assessment of the evolution over time of neurological disorders, cerebral lesion and edema, neuroinflammation and white matter injury induced by controlled cortical impact (CCI) between 6 hours and 12 weeks post-TBI. Notably in the corpus callosum, a significant demyelination starting at 7 days appeared to be a major consequence to post-traumatic neuroinflammation associated with motor dysfunctions. The second part of this study was dedicated to the evaluation of PARP’s role in WM lesions post-TBI, using PARP knockout (KO) mice. Our main findings reveal a diminished demyelination in the corpus callosum of TBI PARP KO as opposed to TBI PARP wildtype specimens. Hence, these data suggest for the first time PARP’s deleterious role in post-traumatic demyelination. In conclusion, taken together these data give an overall view of motor/sensorimotor deficits, neuroinflammation and demyelination in a CCI model of TBI that could help to validate pharmacological strategy for preventing post-traumatic WM injury. Notably, PARP’s inhibition seems to be a valid candidate as this enzyme participates in the establishment of a demyelinating process.