Η χειρουργική καταρράκτη διαμέσου μικρής τομής με τη χρήση αναδιπλούμενων ενδοφθάλμιων φακών είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση μιας νέας επιπλοκής˙ της θόλωσης των φακών. Αρκετοί παράγοντες έχουν ενοχοποιηθεί για την αιτιολόγηση του φαινομένου. Μεταξύ αυτών αναφέρονται η μετεγχειρητική φλεγμονή, η χρήση διαλυμάτων πλύσης και ιξωδοελαστικών υλικών, η σιλικόνη, τα λιπαρά οξέα που εμπεριέχονται στο υδατοειδές υγρό. Προηγούμενες αναφορές έχουν αποδώσει την αιτία του φαινομένου της θόλωσης των ενδοφακών στην ασβεστοποίηση. Για τη μελέτη του φαινομένου της ασβεστοποίησης έχουν κατά καιρούς χρησιμοποιηθεί in vivo μοντέλα. Στα μοντέλα αυτά γίνονται απλοποιήσεις ώστε να προσομοιώνονται όσο το δυνατόν καλύτερα οι φυσικοχημικές συνθήκες των βιολογικών ρευστών που είναι σε επαφή με τους αντίστοιχους ιστούς. Ακριβείς θερμοδυναμικές μετρήσεις και μελέτες της κινητικής στις συνθήκες αυτές είναι δυνατόν να δώσουν χρήσιμες πληροφορίες όσον αφορά στην εμφάνιση και εξέλιξη με το χρόνο του φαινομένου της ασβεστοποίησης διάφορων ιστών ή οργάνων. Στην παρούσα εργασία, και με στόχο να προσομoιωθούν οι συνθήκες του προσθίου θαλάμου κατά την επαφή του φακού με το υδατοειδές υγρό, κατασκευάσθηκε από πολυαμίδιο διπλότοιχος θερμοστατούμενος αντιδραστήρας συνολικού όγκου 10 ml. Ο πυθμένας και το άνω μέρος του αντιδραστήρα ήταν από γυαλί, έτσι ώστε το σύνολο να είναι δυνατόν να διευθετηθεί στο έδρανο οπτικού μικροσκοπίου διερχομένου φωτός, προκειμένου να είναι δυνατή η συνεχής παρατήρηση των δοκιμίων. Το συνθετικό υδατοειδές υγρό παρασκευάστηκε με τριπλά απεσταγμένο νερό στο οποίο διαλύθηκαν συγκεκριμένες ποσότητες κρυσταλλικών αλάτων έτσι ώστε η τελική σύσταση να αντιστοιχεί στη σύσταση του υδατοειδούς υγρού, σύμφωνα με την βιβλιογραφία. Η ροή του συνθετικού υδατοειδούς υγρού προς τον αντιδραστήρα γινόταν με τη βοήθεια αντλίας σύριγγας ρυθμιζόμενης παροχής. Ο ρυθμός ροής ήταν 0.2ml/h όπως και στην περίπτωση της ροής του υδατοειδούς υγρού στον πρόσθιο θάλαμο του φακού. Εντός του αντιδραστήρα τοποθετήθηκαν σε ειδικό δειγματοφορέα τρεις υδρόφιλοι ακρυλικοί ενδοφθάλμιοι φακοί (Α, Β και Γ) με περιεκτικότητα σε νερό 26% κ.β. Η μελέτη του συστήματος έγινε σε συνθήκες αντιπροσωπευτικές του oργανισμού, δηλαδή pH=7.4 και θερμοκρασία=37˚C. Η παρακολούθηση των φακών με τη βοήθεια του οπτικού μικροσκοπίου, το οποίο ήταν εφοδιασμένο με βιντεοκάμερα, γινόταν καθημερινά και λαμβάνονταν φωτογραφίες για περαιτέρω ανάλυση. Οι φακοί Α, Β και Γ απομακρύνθηκαν από τον αντιδραστήρα στους πέντε, εννιά και δώδεκα μήνες αντίστοιχα, με σκοπό να μελετηθεί τόσο η επιφάνειά τους όσο και το εσωτερικό του πολυμερικού υλικού. Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των εναποθέσεων εξετάσθηκαν και μελετήθηκαν με τη βοήθεια ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης ενώ η χημική σύσταση των κρυσταλλιτών ταυτοποιήθηκε με μικροανάλυση με φασματοσκοπία ενεργειακής διασποράς ακτίνων Χ (EDX). Περαιτέρω ταυτοποίηση έγινε με φασματοσκοπικές μεθόδους (φασματοσκοπία Raman) και με περίθλαση ακτίνων Χ. Η τελευταία τεχνική, λόγω της μικρής αναλογίας κρυσταλλικό στερεό/πολυμερές, δεν έδωσε αποτελέσματα και ως εκ τούτου δεν είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί ως τεχνική ταυτοποίησης. Η χρήση της προϋποθέτει διαφορετική γεωμετρία δείγματος-ανιχνευτή. Ο υπερκορεσμός είναι η κινητήρια δύναμη για την έναρξη της πυρηνογένεσης και της εν συνεχεία ανάπτυξης των σταθερών πυρήνων σε κρυσταλλίτες φωσφορικού ασβεστίου. Δεδομένου του ότι, η συγκέντρωση ασβεστίου του υδατοειδούς υγρού είναι χαμηλή, περίπου η μισή της αντίστοιχης του πλάσματος, υπετέθη, ότι κάθε αιτία τοπικής αύξησης του ασβεστίου και του φωσφόρου, εντός του υδατοειδούς υγρού, μπορεί ενδεχομένως να καταλήξει σε δυστροφική ασβεστοποίηση των φακών. Η μελέτη των φακών και η αξιολόγηση του φαινομένου στο πειραματικό μοντέλο που δημιουργήθηκε στην παρούσα εργασία έγιναν σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού, δεδομένου του ότι υπήρξε συνεχής ανανέωση του υδατοειδούς υγρού εντός του αντιδραστήρα, κατά τρόπο κατάλληλο ώστε να επιτευχθεί ικανοποιητική προσομοίωση των in vivo συνθηκών. Τα περισσότερα βιολογικά ρευστά, περιλαμβανομένου του υδατοειδούς υγρού είναι υπέρκορα ως προς διάφορες φάσεις αλάτων φωσφορικού ασβεστίου, οι οποίες κατά σειρά μειωμένης διαλυτότητας είναι το διένυδρο φωσφορικό ασβέστιο (CaHPO42H2O, DCPD), το φωσφορικό τριασβέστιο (Ca3(PO4)2, TCP), το φωσφορικό οκτασβέστιο (Ca8H2(PO4)65 H2O, OCP) και ο υδροξυαπατίτης (Ca10(PO4)6(OH)2, HAP). Η διαλυτότητα των κρυσταλλικών αυτών φάσεων και ο υπερκορεσμός των διαλυμάτων καθορίζονται από παράγοντες όπως η θερμοκρασία, το pH κτλ. Η τάση για καταβύθιση και σχηματισμό συγκεκριμένης φάσης κρυσταλλικού ασβεστίου εντός του υδατοειδούς υγρού, μπορεί να καθοριστεί από το διάγραμμα διαλυτότητας και εξαρτάται από το pH του διαλύματος και από τη θερμοκρασία. Σε υψηλές τιμές υπερκορεσμού και σε διαλύματα με υψηλό pH, έχει ταυτοποιηθεί ο σχηματισμός και η σταθεροποίηση πρόδρομων φάσεων, ενώ σε συνθήκες χαμηλού υπερκορεσμού και μειωμένου pH σχηματίζεται απ’ ευθείας ΗΑΡ. Η διαδικασία της ασβεστοποίησης των ενδοφακών επηρεάζεται από παράγοντες όπως η δομή και η κατεργασία του πολυμερούς υλικού βάσης (μήτρα), η παρουσία πόρων και η περιεκτικότητά του σε νερό. Τα ακρυλικά πολυμερή διαθέτουν επιφανειακές ιονιζόμενες καρβοξυλικές ομάδες, η παρουσία των οποίων σε ιονισμένη μορφή (-COO-, pH>4) ευνοεί τη συμπλοκοποίηση με ιόντα ασβεστίου του υδατοειδούς υγρού. Τα επιφανειακά αυτά σύμπλοκα είναι πιθανόν να λειτουργούν ως ενεργά κέντρα για την πυρηνογένεση και περαιτέρω ανάπτυξη των κρυστάλλων του φωσφορικού ασβεστίου. Επιπλέον, η ασβεστοποίηση φαίνεται ότι είναι έντονη στους υδρόφιλους φακούς, λόγω της υψηλότερης ενυδάτωσης των υδρόφιλων πολυμερών, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την υψηλότερη επιφανειακή συγκέντρωση των ιονισμένων ομάδων (ομάδες / m2) και συνεπώς και των επιφανειακών συμπλόκων- ενεργών κέντρων για την κρυσταλλική ανάπτυξη. Στην παρούσα εργασία και στο in vitro μοντέλο με τη χρησιμοποίηση ενός υδρόφιλου φακού, διαπιστώθηκε ότι η διαδικασία της ασβεστοποίησης λαμβάνει χώρα στο εσωτερικό των φακών, στην πολυμερική μήτρα. Οι σχηματισμοί στο πειραματικό μοντέλο εντοπίσθηκαν στο εσωτερικό των ενδοφακών και με την πάροδο του χρόνου, διαπιστώθηκε ότι μετατοπίζονταν προς τα επιφανειακά στρώματα των φακών. Επίσης, οι εναποθέσεις εμφανίσθηκαν ως γραμμικό μέτωπο παράλληλο προς την γραμμή της επιφάνειας των ενδοφακών. Τόσο η μορφολογική εξέταση των εναποθέσεων στο εσωτερικό όσο και η φασματοσκοπική τους ταυτοποίηση, έδειξε ότι η σύστασή τους ήταν εξ’ ολοκλήρου ΗΑΡ, χωρίς να αποκλείεται και ο σχηματισμός πρόδρομης φάσης OCP, δεδομένου του ότι βρέθηκαν κρυσταλλίτες οι οποίοι μορφολογικά παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα στη φάση αυτή. Η ερμηνεία της διαπίστωσης του γεγονότος ότι η ασβεστοποίηση λαμβάνει χώρα στο εσωτερικό των ενδοφακών, συνίσταται στο ότι η διάχυση των ιόντων Ca2+ και PO43- εντός της πολυμερικής μήτρας, προχωρεί μέχρι τέτοιο βαθμό ώστε να δημιουργούνται στο εσωτερικό του πολυμερούς συνθήκες τοπικού υπερκορεσμού, κατάλληλες για τη δημιουργία των αντίστοιχων κρυστάλλων. Με την υπόθεση ότι οι τιμές των συντελεστών διάχυσής των ιόντων Ca2+ και PO43- εντός της πολυμερικής μήτρας, είναι της αυτής τάξεως μεγέθους είναι δυνατόν να εξηγηθεί και η εμφάνιση μετώπου συγκέντρωσης των. Η συσσώρευση των ιόντων τα οποία αποτελούν τα δομικά συστατικά του ΗΑΡ συνεχίζεται μέχρις ότου επιτευχθεί μία κρίσιμη τιμή υπερκορεσμού. Σε αυτό το σημείο σχηματίζονται οι πυρήνες και λαμβάνει χώρα η κρυσταλλική ανάπτυξη με τον ερχομό και συσσώρευση επιπρόσθετων ιόντων. Η ασβεστοποίηση των υδρόφιλων ενδοφακών είναι μία προοδευτική και συνεχώς εξελισσόμενη διαδικασία μετά την εμφύτευσή τους και όσο περισσότερο αφήνεται να εξελιχθεί τόσο αυξάνεται η πυκνότητα των εναποθέσεων στο εσωτερικό των φακών. Η επιφάνεια μπορεί να προσβληθεί μόνο σε όψιμες φάσεις και αρκετά χρόνια μετά την εμφύτευση των φακών. Στο σημείο αυτό κρύσταλλοι μπορεί να αναπτυχθούν και σε σημεία, στα οποία έχουν δημιουργηθεί στην επιφάνεια του πολυμερούς σχισμές και χαρακιές. Το θέμα της έναρξης της ασβεστοποίησης (εσωτερικό ή επιφάνεια) χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Σύμφωνα με κάποιες αναφορές στη βιβλιογραφία, προτείνεται ότι η έναρξη της ασβεστοποίησης γίνεται στην επιφάνεια των ενδοφακών. Στην παρούσα εργασία, σε συνθήκες χαμηλού υπερκορεσμού, ανάλογες με τις αντίστοιχες υγιούς υδατοειδούς υγρού η ασβεστοποίηση έλαβε χώρα στο εσωτερικό της πολυμερικής μήτρας του ενδοφακού και σε χρόνο και με τρόπο ο οποίος μπορεί να εξηγηθεί από τη (βραδεία) διάχυση των δομικών ιόντων του ΗΑΡ στο εσωτερικό της πολυμερικής μήτρας. Τα ευρήματα και τα συμπεράσματα από την ολοκλήρωση της πειραματικής διαδικασίας με τη χρήση υδρόφιλων ενδοφακών με υδρόφοβη επικάλυψη δείχνουν ότι το θέμα της έναρξης της ασβεστοποίησης˙ εσωτερικό ή επιφάνεια φαίνεται ότι εκτός από τον υπερκορεσμό, υψηλός ή χαμηλός, εξαρτάται και από τη φύση του πολυμερούς του φακού˙ υδρόφιλη ή υδρόφοβη. Τα ευρήματα δείχνουν ότι η υδρόφιλη φύση ευνοεί τη διάχυση, ενώ το υδρόφοβο υλικό την έναρξη της ασβεστοποίησης στην επιφάνεια του φακού. Τα ευρήματα δείχνουν ότι η υδρόφιλη φύση ευνοεί τη διάχυση, ενώ το υδρόφοβο υλικό την έναρξη της ασβεστοποίησης στην επιφάνεια του φακού. Συμπερασματικά, η όψιμη μετεγχειρητική ασβεστοποίηση των ενδοφακών συνιστά σοβαρή επιπλοκή και αιτία μείωσης της όρασης. Λόγω του ότι η διαδικασία και η εκδήλωση του φαινομένου έχει καθυστερημένη έναρξη, είναι σημαντική η μακροχρόνια και προσεκτική παρακολούθηση αυτών των ασθενών. Αρκετοί οφθαλμίατροι δεν είναι ενήμεροι ως προς αυτήν την κλινική οντότητα και αναγνωρίζοντάς την βοηθούν ώστε να μην υποβάλλουν τους ασθενείς σε ανώφελες επεμβάσεις. Η χειρουργική εξαίρεση του φακού συνιστά τη μοναδική θεραπευτική προσέγγιση, καθώς ασθενείς με ασβεστοποιημένους φακούς παρουσιάζουν σταδιακή μείωση της οπτικής τους οξύτητας και καμία περίπτωση αυτόματης υποστροφής δεν έχει παρατηρηθεί. / Small incision cataract surgery with foldable IOL implantation resulted in a new postoperative complication, IOL opacification. Various factors implicated in the phenomenon have been suggested, including inflammation, irrigation solutions and viscosurgical devices, silicone and fatty acids contamination. There is increasing evidence that IOL opacification is due to calcification. Modeling in vivo processes by reliable and reproducible in vitro methods is of key importance to understand the underlying mechanisms. Precise thermodynamic calculations of equilibrium speciation in combination with kinetics measurements at conditions simulating the eye environment are expected to yield mechanistic information concerning the formation of calcium phosphate deposits. In the present contribution we have developed an experimental approach for the investigation of the mechanism of calcification of hydrophilic acrylic IOLs. A double walled thermostated reactor was constructed, volume totaling 10 ml made of polyamide. The reactor had glass windows on top and bottom to allow for the direct observation of the IOL specimens in situ using an optical microscope combined with an image analysis system. In the external wall of the reactor, water supplied from a thermostat was circulated in order to maintain the temperature at 37.0  0.2˚C, while in the interior of the reactor constant flow of a simulated aqueous humor solution (SAH) was ensured with the help of a syringe pump. The SAH solution was introduced in the reactor in an once flow mode at a flow rate of 0.2ml/h, simulating the in vivo flow in the anterior chamber, where aqueous humor is fully renewed within 2 hours. Hydrophilic acrylic IOLs (A, B and C) in triplicate, made of Poly-HEMA with 26% water content were placed in a special holder. The observation of IOLs was done in situ daily by optical microscopy, for the assessment of the opacification progress. Five months after the initiation of the experiment, Lens A was removed in order to be inspected, both at the surface and in the interior. The morphology of the deposits was examined using Scanning Electron Microscopy (SEΜ). The composition of the deposits was identified by microanalysis with Energy Dispersive x-ray Spectroscopy (EDS). Lens B was removed on the ninth month, while Lens C was inspected one year after the onset of the experiment. Similar studies including SEM and EDS analysis were used for the investigation of both those lenses. Investigation showed deposits of calcium phosphate crystallites in the interior of opacified IOLs. These deposits however, were not observed on the IOL’s surface. The thermodynamic driving force for the formation of a salt from solution is the difference between the chemical potentials of the salt in solution from the equilibrium. Taking into account that the calcium concentration in normal aqueous humor is low, about half of the respective value in blood serum, it may be assumed that any cause of localized increase in calcium and phosphorus might result in dystrophic calcification. The experiments in the present work were done at conditions of practically constant supersaturation, since the solution in the experimental reactor was flown once through thus providing a reasonable simulation of the in vivo conditions. Heterogeneous nucleation, an almost ubiquitous phenomenon, is initiated at impurity sites and foreign surfaces in contact with supersaturated solutions. The induction time preceding the formation of nuclei of solids which grow to crystals depends on several factors, including temperature, pH, ionic strength, solution composition which determine the thermodynamic driving force for the formation of the solid phase. Biological fluids like blood serum or aqueous humor are supersaturated with respect to a number of different phases of calcium phosphate salts, in the order of decreasing solubility: Calcium phosphate dehydrate (CaHPO42H2O, DCPD), Tricalcium phosphate (Ca3(PO4)2, TCP), Octacalcium phosphate (Ca8H2(PO4)65 H2O, OCP) and Hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2, HAP). HAP is the thermodynamically stable phase while the rest of the crystalline phases are precursors which may be formed and/or stabilized in supersaturated solutions depending on the conditions in the supersaturated solutions. The tendency for particular calcium phosphate phases to form in supersaturated solutions may be estimated from the solubility phase diagrams of calcium phosphates. Unstable precursor phases, if formed, they convert through hydrolytic processes to the thermodynamically most stable. The process of biomaterial calcification seems moreover to be influenced by factors such as polymer structure, polymer porosity and water content. The ionizable surface hydroxyl groups (present in the carboxyl functional groups) available on the surface of the acrylic polymers may act as sites for nucleation and growth of mineral phase, through surface complexation with calcium ions. The presence of larger numbers of –COOH groups on the polymers accelerate the process of Ca-P overgrowth. The higher extend of hydration in hydrophilic materials leads to higher ionization of the surface functional groups, thus promoting calcification through the formation of complexes with Ca2+ ions. The higher calcification incidents observed in IOLs with higher water content has been attributed to this fact. The polar functional groups (-COO) on the surface of the polymeric matrix of IOLs result in the significant increase in electron density and the subsequent reduction of the interfacial energy between the polymer and aqueous solution. The energy barrier to diffusion of calcium and phosphate species from the bulk solution to the substrate is also reduced, through the formation of surface complexes, which favor the accumulation of Ca2+ and PO43- ions, thus promoting calcification. Our in vitro model experiments have shown that IOL’s calcification is a process initiated at the interior of the IOLs tested. SEM investigation in combination with EDS microanalysis, confirmed the presence of HAP crystallites with sizes less than 100nm. Raman spectroscopy analyses of the opacified lenses corroborated the findings for HAP formation in the interior of the polymeric matrix. X-Ray diffraction measurements failed to identify the presence of minerals apparently because of the low content (by mass) of solid in the polymeric matrix. Supersaturation of the aqueous humor, with respect to calcium phosphate, is the driving force a necessary condition for nucleation of Ca-P salts. The formations observed in our experimental set-up which simulated closely in vivo conditions, were found exclusively in the interior of the IOLs. The solid deposits formed linear fronts parallel to the lens surfaces, advancing with time. It may be suggested therefore that the deposits fronts is the result of diffusion of Ca2+, PO43- and OH- ions through the polymer matrix in contact with the polymer. Assuming similar values for the diffusion coefficients of Ca2+, PO43- and OH- ions in the gel (bulk polymer) material the formation of linear deposits fronts may be explained from the formation of the supersaturated solutions at a depth in which a critical supersaturation was reached. At this point calcium phosphate nuclei form and grow with the arrival of additional ions. IOL’s calcification is an ongoing process after IOL implantation, and the longer the process proceeds, the density of the deposits in the interior of the IOL increases. In all of the cases surface was free of deposits and the distortions that were observed are thought to be due to changes in polymer structure in the IOL’s interior. Surface can be affected only in late phases of calcification and many years after IOL implantation. At this stage crystals may outgrow especially at places in which the polymer’s surface has developed fissures. The issue of calcification’s process initiation (interior or surface) needs further investigation. Reports in the literature, suggest that calcification is initiated on the surface of the IOL. In our experiment where low supersaturation conditions have been achieved, diffusion was favored resulting in calcification at the interior of the polymeric matrix. Investigation and analysis of IOLs with hydrophobic surface confirmed that the issue of calcification`s process initiation is more over influenced by factors others than supersaturation conditions, such as the hydrophilic or hydrophobic nature of the IOLs surface. The experimental analysis proved that hydrophilic IOLs favor ions diffusion while hydrophobic material limits calcification process on the surface. In conclusion, late postoperative IOL opacification causes a severe loss of visual acuity. Because calcification process appears to be of delayed onset it is important to be vigilant in the long-term follow-up of these patients. Many ophthalmologists are not aware of this clinical problem and recognizing this phenomenon will help prevent patients from undergoing useless procedures. IOL exchange is the only therapeutic approach, in such patients, as patients with calcified IOLs have gradual deterioration of their visual acuity and no case of spontaneous recovery has been observed.

La révolution en cours des outils optogénétiques - des protéines photosensibles génétiquement induites qui peuvent activer, inhiber et enregistrer l'activité neuronale - a permis d'ouvrir une nouvelle voie pour relier l'activité neuronale et la cognition. Néanmoins, pour profiter au mieux de ces outils nous avons besoin de méthodes optiques qui peuvent projeter des schémas d'illumination complexes dans le cerveau. Pendant mon doctorat, j'ai travaillé sur deux nouveaux systèmes complémentaires pour la stimulation de l'activité neuronale. Le premier système combine des déflecteurs acousto-optiques et une illumination Gaussienne à faible ouverture numérique pour produire une photo activation rapide des outils optogénétiques. La capacité d'accès aléatoire du système permet de délivrer des séquences d'illumination spatialement et temporellement complexes qui simulent avec succès les schémas physiologiques de l'activité des fibres moussues dans des tranches de cerveaux. Ces résultats démontrent que les schémas de stimulation optogénétique peuvent être utilisés pour recréer l'activité en cours et étudier les microcircuits du cerveau dans un environnement physiologique. Alternativement, l'holographie générée par ordinateur (HGO) permet d'améliorer grandement les stimulations optogénétiques en répartissant efficacement la lumière sur plusieurs cibles cellulaires simultanément. Néanmoins, le confinement axial se dégrade pour des schémas d'illuminations larges. Afin de d'améliorer ce point, l’HGO peut être combinée avec une technique de focalisation temporelle qui confine axialement la fluorescence sans dépendre de l'allongement latéral. Les précédentes configurations maintiennent l'excitation non linéaire à un unique plan focal spatiotemporel. Dans cette thèse, je décris deux méthodes différentes qui permettent de dépasser ces limitations et de permettre la génération de schémas focalisés tridimensionnellement, à la fois spatialement et temporellement. / The ongoing revolution of optogenetic tools – genetically encoded light-sensitive proteins that can activate, silence and monitor neural activity – has opened a new pathway to bridge the gap between neuronal activity and cognition. However, to take full advantage of these tools we need optical methods that can deliver complex light patterns in the brain. During my doctorate, I worked on two novel and complementary optical systems for complex spatiotemporally neural activity stimulation. The first system combined acousto-optic deflectors and low numerical aperture Gaussian beam illumination for fast photoactivation of optogenetic tools. The random-access capabilities of the system allowed to deliver complex spatiotemporal illumination sequences that successfully emulated physiological patterns of cerebellar mossy fiber activity in acute slices. These results demonstrate that patterned optogenetic stimulation can be used to recreate ongoing activity and study brain microcircuits in a physiological activity context. Alternatively, Computer Generated Holography (CGH) can powerfully enhance optogenetic stimulation by efficiently shaping light onto multiple cellular targets simultaneously. Nonetheless, the axial confinement degrades for laterally extended illumination patterns. To address this issue, CGH can be combined with temporal focusing that axially confines fluorescence regardless of lateral extent. However, previous configurations restricted nonlinear excitation to a single spatiotemporal focal plane. In this thesis, I describe two alternative methods to overcome this limitation and enable three-dimensional spatiotemporal focused pattern generation.