To develop and validate a computerised algorithm for the interpretation of the characteristics of the fetal heart rate (FHR) in labour. Materials and methods: A computerised algorithm based on wavelet transform and Fuzzy C-means algorithm was developed to assess baseline, variability, the presence of accelerations and types of decelerations. Twenty four segments of intrapartum cardiotocographs (CTG) were interpreted using the algorithm and evaluated by seven expert observers. The results compared to assess inter observer variation and agreement between the computer and experts. Results: Inter observer agreement for FHR baseline and the presence and type of decelerations was good (Interclass correlation coefficient (ICC), 0.93, 0.93 and 0.79 respectively). Conclusions: The validation of a computerised algorithm is limited by inter observer variation. The prediction of baseline and decelerations is as good as clinical observers but is more reproducible. / Η ανάπτυξη αλγορίθμων και υπολογιστικής μεθόδου για την ερμηνεία και επεξεργασία των χαρακτηριστικών του εμβρυικού καρδιακού ρυθμού.

Στόχος της παρούσας εργασίας αποτελεί η έγκαιρη πρόβλεψη οξυαιμίας βασιζόμενη στην ανάλυση των πολύ χαμηλής συχνότητας συστατικών του εμβρυϊκού καρδιακού ρυθμού και των καταγραφών της εμβρυϊκής παλμικής οξυμετρίας (FSpO2) κατά τη διάρκεια του τοκετού. Για τη φασματική ανάλυση έγινε εφαρμογή του συνεχούς μετασχηματισμού κυματιδίων (CWT). Για την ανάλυση των καταγραφών του FSpO2 υπολογίστηκε το ποσοστό του συνολικού χρόνου όπου ο FSpO2 είναι κάτω του ορίου 30% (TFSpO2<30%). Όπως αποδείχθηκε τόσο από την εφαρμογή του CWT, όσο και από την παράμετρο TFSpO2<30%, οι κυματισμοί του εμβρυϊκού καρδιακού ρυθμού στην περιοχή συχνοτήτων του 0.01 Hz, παρουσιάζουν ικανοποιητική ευαισθησία (80% and 90%, αντίστοιχα) για την έγκαιρη πρόβλεψη οξυαιμίας, ενώ ο συνδυασμός τους παρουσιάζει υψηλή προσδιοριστικότητα (89%). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης των δεδομένων όπως προκύπτουν από την ανάλυση του εμβρυϊκού καρδιακού ρυθμού – μέσω εφαρμογής του CWT – και των καταγραφών της εμβρυϊκής παλμικής οξυμετρίας δύναται να αποτελέσουν μια επιπρόσθετη πηγή πληροφορίας όσον αφορά την κατάσταση του εμβρύου βοηθώντας ταυτοχρόνως τον γυναικολόγο στην απόφαση για το χρόνο και τον τρόπο διεξαγωγής του τοκετού. / The objective of the present study is the prediction of fetal acidemia based on the Very Low Frequency (VLF) components of the Fetal Heart Rate (FHR) and Fetal Pulse Oximetry (FSpO2) recordings during labor. In order to perform the spectral analysis, we applied the Continuous Wavelet Transform (CWT). The evaluation of FSpO2 was based on calculating the time duration in which the FSpO2 was less than 30% (TFSpO2<30%). We demonstrate that the oscillating activity of the FHR of about 0.01 Hz identified by the CWT and the TFSpO2<30% parameter, show an adequate sensitivity (80% and 90%, respectively) in predicting fetal acidemia, whereas the combination of these two variables shows a very good specificity (89%). The results of the analysis of our data demonstrate that the analysis of the fetal heart rate by the CWT and the fetal pulse oximetry recordings may provide additional source of information about fetal status and to alert the clinician to decide under objective conditions when and how to perform the delivery.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθεί η επίδραση του μηχανικού-ακουστικού ερεθισμού στη βιοφυσική εικόνα του εμβρύου με μια προοπτική τυχαιοποιημένη μελέτη Το υλικό της μελέτης απετέλεσαν γυναίκες με μονήρεις κυήσεις, ηλικία κύησης 30 + 0 εβδομάδες και βιοφυσική εικόνα ≤ 8/10. Οι γυναίκες με τυχαίο τρόπο κατατάσσονταν σε μια από δύο ομάδες. Στην ομάδα Α εφαρμοζόταν ακουστικός ερεθισμός διάρκειας 3 δευτερολέπτων με ένα τεχνητό λάρυγγα. Αν η βιοφυσική εικόνα παρέμενε μη φυσιολογική για 30 λεπτά, ακολουθούσε η εφαρμογή ενός δεύτερου ερεθίσματος, ίδιου με το πρώτο και εκτίμηση της βιοφυσικής εικόνας για ακόμη 30 λεπτά. Στην ομάδα Β ο χρόνος παρατήρησης παρατάθηκε για 60 λεπτά (δύο διαστήματα των 30 λεπτών) , ώστε να συμφωνεί με το χρόνο εξέτασης των γυναικών της ομάδας Α. Οι κυήσεις αντιμετωπίστηκαν με βάση την τελική βαθμολογία της βιοφυσικής εικόνας. Όσες γυναίκες γέννησαν περισσότερο από 24 ώρες από την τελευταία εξέταση δεν περιελήφθησαν στη μελέτη. Τα κριτήρια αξιολόγησης ήταν ενδομήτριος θάνατος, καισαρική τομή για εμβρυϊκή δυσπραγία, βαθμολογία Apgar < 7 στα 5 λεπτά από τον τοκετό, κεχρωσμένο αμνιακό υγρό (από μηκώνιο) και εισαγωγή στη ΜΕΘ νεογνών. Η μηδενική υπόθεση ήταν ότι η εφαρμογή του ακουστικού ερεθισμού δεν μεταβάλλει τις στατιστικές παραμέτρους της δοκιμασίας. Συνολικά 2,833 γυναίκες εισήλθαν στη μελέτη και συγκεκριμένα 1,349 στην ομάδα Α και 1,484 στην ομάδα Β. Η εφαρμογή του ακουστικού ερεθισμού μείωσε σημαντικά τον αριθμό των θετικών δοκιμασιών στην ομάδα Α σε σχέση με την ομάδα Β (4.74% vs. 6.67%, p < 0.05) και αύξησε την επίπτωση των κριτηρίων αξιολόγησης στην υποομάδα των γυναικών με θετική τελική δοκιμασία (positive likelihood ratio: 24.1-CI 95%: 11.12-52.46 vs. 7.52-CI 95%: 4.93-11.46), χωρίς να τροποποιεί το περιγεννητικό αποτέλεσμα. Επιπλέον, η ειδικότητα, η θετική προγνωστική αξία και η ακρίβεια της μεθόδου βελτιώθηκαν σημαντικά στην ομάδα Α,όπως επίσης και η αρνητική προγνωστική αξία για τους ενδομήτριους θανάτους. Συμπερασματικά, η εφαρμογή του μηχανικού-ακουστικού ερεθισμού σε περιπτώσεις που υπάρχει υποψία για εμβρυϊκή δυσπραγία, βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της μεθόδου (βιοφυσικής εικόνας), μειώνοντας τις ψευδώς θετικές δοκιμασίες και βελτιώνοντας την ακρίβεια της μεθόδου. Θα πρέπει δε να θεωρείται ως μέσο μιας πιο ενδελεχούς εμβρυϊκής εκτίμησης σε αυτές τις περιπτώσεις. / OBJECTIVES: To verify the effect of vibroacoustic stimulation on biophysical profile score, with a prospective randomised study. STUDY DESIGN: All women with singleton pregnancy, gestational age ≥ 30 weeks, intact membranes and biophysical profile score ≤ 8/10 entered the study, after giving written consent, and were randomised to two groups. In group A, a 3-second stimulus with an artificial larynx was applied; if biophysical profile remained abnormal for 30 minutes, a second stimulus was applied, and it was assessed again. In group B the observation time was extended for 60 minutes to match the time periods of group A. Pregnancies were managed by final test score and patients delivering more than 24 hours apart from last examination were disregarded from the study. Outcome criteria were intrauterine deaths, caesarean sections for fetal distress, Apgar score < 7 at 5 minutes postpartum, meconium-stained amniotic fluid and neonatal intensive care unit admissions. Our null hypothesis was that application of vibroacoustic stimulation does not alter test’s statistical parameters. RESULTS: 1,349 patients were randomised in group A, and 1,484 in group B (2,833 in total). When comparing group A to B, application of vibroacoustic stimulation significantly decreased the number of positive tests (4.74% vs. 6.67%, p < 0.05) and increased the prevalence of outcome criteria in this subgroup (positive likelihood ratio: 24.1-CI 95%: 11.12-52.46 vs. 7.52-CI 95%: 4.93-11.46), without altering perinatal outcome. Furthermore, specificity, positive predictive value and test accuracy were significantly improved, as well as negative predictive value for intrauterine death. CONCLUSION: Vibroacoustic stimulation improves the efficiency of biophysical profile score by decreasing false positive tests and improving test accuracy and should be considered as a means of a more thorough fetal evaluation when fetal compromise is suspected.

Η αναζήτηση και επινόηση νέων προσεγγίσεων για την προγεννητική διάγνωση χρωμοσωμικών συνδρόμων, που να συνδυάζουν ταχύτητα, αξιοπιστία και ασφάλεια για την μητέρα και το έμβρυο, είναι πάντοτε επίκαιρη και επιτακτική, ιδιαίτερα στην εποχή μας, όπου η πρόοδος της μοριακής βιολογίας και η αποκρυπτογράφηση του ανθρώπινου γονιδιώματος, προσφέρουν νέα γνώση και εργαλεία για την προσπάθεια αυτή. Στην παρούσα εργασία τυποποιήθηκε η μεθοδολογία της ποσοτικής φθορίζουσας αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction, QF-PCR) σε συνδυασμό με τη συμβατική PCR για την ανίχνευση ανευπλοειδιών και φύλου σε δείγματα αμνιακών κυττάρων, σε βλαστομερίδια προεμβρύου και κυρίως σε ελεύθερο εμβρυϊκό DNA από την μητρική κυκλοφορία καθώς και σε ούρα της εγκύου, για την καθιέρωση μη επεμβατικής μεθοδολογίας προγεννητικής διάγνωσης. Είναι σαφές από τα αποτελέσματα της παρούσας ερευνητικής εργασίας ότι οι συγκεκριμένες μεθοδολογίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν συμπληρωματικά στο συμβατικό χρωμοσωμικό έλεγχο και παράλληλα να αξιοποιηθούν όσον αφορά την ανάλυση του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στο πλάσμα της μητέρας για την ασφαλή διάγνωση του φύλου του εμβρύου στα πρώτα στάδια της κύησης. Επιπλέον, επινοήθηκαν πειράματα προσομοίωσης μητρικού πλάσματος με σκοπό τον προσδιορισμό του ποσοστού του εμβρυϊκού DNA στη μητρική κυκλοφορία σε όλη τη διάρκεια της κύησης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στα δείγματα μας το εμβρυϊκό DNA μπορεί να διαχωριστεί από το DNA της μητέρας, ανιχνεύοντας μοναδικά εμβρυϊκά αλληλόμορφα πολυμορφικών περιοχών STR (Short Tandem Repeats) πατρικής προέλευσης με QF-PCR. Αυτά τα αλληλόμορφα χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του ποσοστού του εμβρυϊκού DNA στο μητρικό πλάσμα. Έτσι βρέθηκε ότι σε φυσιολογικές κυήσεις, το εμβρυϊκό DNA είναι της τάξεως του 7% (διακύμανση 0-20%) του ολικού ελεύθερου DNA στη μητρική κυκλοφορία. Με βάση την ανάλυση των μοντέλων προσομοίωσης προσδιορίσθηκε με QF-PCR ο αριθμός των αντιγράφων των εμβρυϊκών χρωμοσωμάτων συγκρίνοντας τις αναλογίες των αλληλομόρφων δεικτών STR στα χρωμοσώματα 21, 18, 13, Χ και Υ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι για φυσιολογικά έμβρυα και σε περιπτώσεις όπου το ποσοστό του εμβρυϊκού DNA στο μητρικό πλάσμα είναι ≥15%, ο λόγος των αναλογιών των αλληλομόρφων δύο δεικτών STR σε διαφορετικά χρωμοσώματα προσεγγίζει τη μονάδα. Η ανάλυση δειγμάτων μητρικού πλάσματος από φυσιολογικές κυήσεις και μετά από εμπλουτισμό τους στο ελεύθερο εμβρυϊκό DNA επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα των μοντέλων προσομοίωσης. Αντίστοιχα μοντέλα προσομοίωσης δειγμάτων πλάσματος εγκύων με τρισωμικά έμβρυα για το χρωμόσωμα 21 έδειξαν ότι ο λόγος της αναλογίας των αλληλομόρφων ενός δείκτη STR σε ένα αυτοσωμικό χρωμόσωμα (π.χ. 18 ή 13) προς την αναλογία των αλληλομόρφων ενός δείκτη STR στο χρωμόσωμα 21, διαφέρει από τη μονάδα και εξαρτάται από την προέλευση, πατρική ή μητρική, του επιπλέον εμβρυϊκού χρωμοσώματος 21 στο δείγμα (0.5 έναντι 1.3 αντιστοίχως). Τα αποτελέσματα αυτά μπορούν, εφόσον επαληθευθούν σε ικανό αριθμό δειγμάτων να αξιοποιηθούν ως επιπλέον δείκτες προγεννητικού ελέγχου και ενδεχομένως να συμβάλλουν στην τυποποίηση αποτελεσματικής μεθοδολογίας μη επεμβατικής χρωμοσωμικής διάγνωσης. / The quest and devise of new approaches for the prenatal diagnosis of chromosomal syndromes that combine rapid analysis robustness and safety for mother and embryo are always in demand especially in the post-genome era with new tools and methods in our disposition. In the present study, the methodology of quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) has been developed and standardized in conjunction with conventional PCR for the detection of aneuploidies and sex in amniotic cells, blastomeres and most importantly in free fetal DNA isolated from maternal peripheral blood and urine, for the establishment of non-invasive methods of prenatal diagnosis. It has become evident that the methodology we have followed can complement conventional prenatal chromosome analysis and in addition can be exploited for the analysis of fetal DNA in maternal plasma for fetal sex determination at the first stages of gestation. Moreover, simulation experiments have been devised in order to determine the percentage of fetal DNA in maternal circulation throughout pregnancy. Our results showed that free fetal DNA can be distinguished from the mother’s DNA in maternal plasma by identifying unique paternally inherited fetal polymorphisms, such as short tandem repeat (STR) alleles, with QF-PCR. These alleles were used to calculate the percentage of fetal DNA in maternal plasma. Fetal DNA was found to be present on an average of 7% (range 0-20%) of the total free DNA in maternal circulation, in normal pregnancies. QF-PCR analysis was also used to determine the copy number of fetal chromosomes by comparing the allelic ratios for chromosomes 21, 18, 13 X and Y. It appears that in informative cases where free fetal DNA is 15% or more and originates from normal embryos, the value of the allelic ratio of a STR marker on one chromosome divided by the value of the allelic ratio of another STR marker on a different chromosome is equal to 1. Analysis of DNA samples isolated from the plasma of pregnant women bearing normal embryos confirmed the results of the simulation models. Comparison of the above data with new analyses simulating DNA from the plasma of pregnant women carrying trisomic for chromosome 21 embryos have shown that the value of the allelic ratio of a STR marker on an autosomal chromosome (e.g. 18 or 13), divided by the allelic ratio of a STR marker on chromosome 21, is different from 1 and it depends on the origin, paternal or maternal, of the extra copy of chromosome 21 in the embryo, with values of 0.5 in paternal compared to 1.3 in maternal trisomies respectively. These results differentiate between normal and trisomic cases and after further evaluation may provide a new indication marker for prenatal diagnosis. In the long term, they may also provide the basis of a non-invasive procedure for early prenatal chromosomal analysis.